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Biochemistry

Fabricação simples de coluna capilar de alto desempenho com a abordagem flashpack

Published: December 04, 2021
doi:
10.3791/62522
, ,
1Laboratory of Bioinformatics Methods in Combinatorial Chemistry and Biology, Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry,Russian Academy of Sciences, 2Department of Molecular Neuroimmune Signalling, Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry,Russian Academy of Sciences

Summary

Aqui apresentamos um protocolo para o procedimento otimizado de embalagem de colunas capilares FlashPack. A aplicação de um protocolo otimizado para uma configuração comum de bomba de pressão de 100 barras permite a embalagem e fabricação 10 vezes mais rápidas de colunas capilares de alto desempenho.

Abstract

A cromatografia líquida de ultra-alto desempenho capilar (UHPLC) é atualmente um método de escolha para a etapa de separação da amostra na proteômica baseada em LC-MS. No entanto, as colunas capilares são muito menos robustas em comparação com seus contratipos de fluxo mais elevados. Por causa da fácil contaminação e bloqueio, muitas vezes eles precisam de substituição. Isso faz deles uma parte marcadamente cara do custo total de análise LC-MS. A embalagem interna de colunas capilares UHPLC economiza muito dinheiro e permite a personalização. No entanto, o procedimento padrão de embalagem na bomba de pressão de 100 barras funciona bem apenas para colunas HPLC, mas é muito lento para sorbents UHPLC. Aqui fornecemos uma descrição de um protocolo FlashPack otimizado aplicado à mesma configuração de bomba de pressão de 100 barras. O método é baseado na embalagem de chorume de concentração sorbent ultra-alto e é desenvolvido para fabricação interna de colunas capilares UHPLC de comprimento ilimitado em tempo razoável.

Introduction

A proteômica moderna é baseada na espectrometria de massa acoplado à cromatografia líquida com a cromatografia de nano-fluxo de desempenho ultra-alto (50-150 μm de diâmetro interno da coluna (ID)) proporcionando a melhor velocidade de análise e sensibilidade1. Embora inúmeras colunas capilares comerciais da UHPLC estejam disponíveis, seu preço representa uma grande parte do custo dos consumíveis, especialmente quando vários projetos diversos são executados em laboratório e a contaminação de colunas específicas do projeto é um problema frequente. Além disso, a embalagem de colunas internamente permite o uso de sorbents personalizados específicos para experimentos (como, por exemplo, o sorbent polyCAT-A2) e características da coluna não disponíveis para compra como uma coluna pronta.

Para lidar com isso, muitos laboratórios embalam colunas capilares internamente. No entanto, o procedimento comum de embalagem com uma bomba de pressão de 100 barras (célula de injeção de pressão)3 é inadequado para a embalagem da coluna UHPLC devido à alta pressão traseira de sorbents UHPLC sub-2 μm resultando em uma redução dramática da taxa de embalagem em comparação com os sorbents hplc de tamanho maior. Embora as colunas UHPLC curtas ainda possam ser muito lentamente embaladas, a fabricação de longas colunas UHPLC é fisicamente impossível4.

A embalagem da coluna capilar padrão é feita a pressões relativamente baixas até 100 barras, e com uma concentração de chorume muito baixa. Assim, duas instruções possíveis de acelerar o processo estão disponíveis. É possível aumentar a pressão de embalagem5. No entanto, isso requer equipamentos especiais e, praticamente, instalação de um novo método em laboratório. Outra forma é aumentar a concentração de chorume sorbent6. A embalagem de concentração de chorume de alto sorbent é descrita em combinação com pressão de embalagem ultra-alta em uma publicação anterior7. No entanto, a 100 barras de pressão, que é usada na maioria das bombas de embalagem existentes, maior concentração sorbent resulta em uma taxa de embalagem lenta ou cessação total da embalagem. O efeito foi recentemente demonstrado devido ao agrupamento sorbent na entrada da coluna, e um simples truque de desestabilização da cúpula sorbent martelando a entrada da coluna com uma barra de ímã dentro de um frasco sorbent foi sugerido4. O método resultante, chamado FlashPack, usa a mesma configuração de embalagem de bomba de pressão de 100 barras. Ao mesmo tempo, pequenas, mas críticas mudanças no procedimento de embalagem permitem a embalagem a partir de uma concentração de chorume muito alta e produção de colunas UHPLC muito longas (50 a 70 cm, e mais) em menos de uma hora, enquanto uma coluna curta pode ser produzida em minutos com a qualidade de separação igual a colunas comerciais dos mesmos parâmetros4. A abordagem FlashPack já foi utilizada com sucesso em múltiplos projetos de proteômica para a elaboração de ambas as fases inversas (RP)8,9,10,11,12,13,14 e interação hidrofílica (HILIC)2 colunas capilares.

Aqui descrevemos em detalhes, as modificações necessárias para a adaptação da abordagem FlashPack ao procedimento padrão de embalagem de bombas de pressão de 100 barras.

Protocol

O protocolo de embalagem consiste em cinco etapas (Figura 1): 1) Preparação da estação de embalagem, 2) preparação capilar, 3) preparação de chorume sorbent, 4) embalagem capilar na bomba de pressão e 5) embalagem de coluna no sistema HPLC, cortando até o tamanho e instalação de conexão UHPLC. A otimização do FlashPack requer ajustes nas seções 3 e 4 em comparação com o protocolo comum. 1. Montagem da estação de embalagem Prepare um tanque de gás cheio de nitrogênio, hélio ou argônio fornecido com um regulador de gás de estágio único com a pressão de saída > 50 barras. A pressão máxima é limitada pela compatibilidade da bomba de pressão. Conecte o regulador à válvula de ventilação da bomba de pressão. Se a bomba de pressão não estiver equipada com um agitador magnético integrado, coloque a bomba em um agitador magnético. Conecte um tubo de plástico de identidade estreito (por exemplo, 0,13 mm) à saída de ventilação da bomba de pressão e coloque-a em um recipiente com água. 2. Preparação capilar Prepare um capilar frito com um frit de vidro integrado formado a partir de Kasil e formamide15 ou um capilar emitter puxado preparado por um puxador de laser16. O capilar é feito 10-15 cm mais longo do que o comprimento da coluna pretendida.NOTA: Consulte a Tabela 1 para a discussão de possíveis questões associadas a diferentes tamanhos capilares e tipos de frit. A Tabela 2 contém um exemplo de um programa de puxador a laser P2000 para fazer capilares puxados. Proteja uma extremidade do emissor puxado com uma ponta de pipeta de carregamento de gel cortada. Corte a ponta para que ela se encaixe firmemente em torno do capilar de 360 μm OD (pode ser movido ao longo do capilar, mas requer algum esforço para fazer isso). Deslize a ponta de pipeta cortada para o capilar da direção da extremidade dianteira capilar e mova-a até a extremidade do emissor. Deslize para trás a ponta protetora quando a coluna estiver pulverizando. Deslize a ponta para a frente para ter a extremidade do emissor dentro da ponta quando a coluna não estiver pulverizando (mesmo quando a coluna estiver sob o fluxo, mas ainda não pulverizando). 3. Preparação de chorume sorbent Prepare um frasco de sorbent de caldo: Coloque ~50 mg de sorbent seco em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Aqui, o Reprosil Pur C18 é usado como exemplo. Adicione 1 mL de metanol ao tubo de sorbent. Para misturá-lo completamente, vórtice do tubo por 10 s usando um misturador de vórtice. Sonicato em um banho de sônica por 10 s. Deixe o sorbent ficar encharcado por 20-30 minutos. Então, vórtice e sonicá-lo mais uma vez. Prepare um frasco de trabalho sorbent. Use um frasco de fundo cônico que se encaixa na bomba.NOTA: Pode ser outro tubo de centrífugas de 1,5 mL ou qualquer outro frasco, dependendo do design da bomba de pressão específica. Para este experimento, é usado o corte do tubo de tampa do parafuso inferior cônico até a altura da bomba de pressão. Resuspenda o sorbent no frasco de sorbent de estoque e transfira 500 μL para o frasco de sorbent de trabalho com uma barra de ímã de tamanho de 2 x 3 mm. Adicione metanol até ~1 mL ao frasco de trabalho. Deixe o frasco de trabalho ficar sobre a mesa por 10 minutos para o sorbent se estabelecer pela gravidade. Se, depois de se estabelecer, a camada sorbent estiver abaixo de 4 mm, adicione mais do caldo sorbent e espere que o sorbent se contente com mais 10 minutos.NOTA: O frasco de trabalho preparado destina-se à preparação de várias colunas ao longo de meses. Se o frasco de trabalho sorbent permanecer sem mexer por mais de 2h, deve ser vórtice para 10 s, sonicado para 10 s e resolvido pela gravidade. Rotineiramente, o sorbent é resuspended pela manhã antes de empacotar. Então, é bom para embalar durante todo o dia se não houver longas pausas entre a embalagem de colunas sequenciais. Se o sorbent no frasco de trabalho secar, adicione metanol e execute o procedimento completo de preparação sorbent quanto ao frasco de sorbent de estoque (passos 3.2-3.5). 4. Embalagem capilar em uma bomba de pressão ATENÇÃO: Use sempre óculos de proteção ao trabalhar com a bomba de pressão. Não use luvas. Estes reduzem severamente a sensação de toque necessária para o manuseio adequado de capilares de pequeno diâmetro e levam a erros. Coloque o frasco sorbent na bomba de pressão e conserte todas as porcas firmemente. Inicie a rotação a 60-100 rpm. Insira o capilar de emissor frito ou puxado na bomba: empurre-o para o fundo do frasco e, em seguida, levante-o 2-3 mm e fixe a porca.NOTA: Aplique uma força mínima necessária para fixar o capilar para evitar danos capilares e ferrule. O melhor é apertar a mão. Se for usada uma chave hexa-chave, aplique esforço mínimo o suficiente para apertar. Verifique se o capilar está devidamente fixado – deve ser impossível mover o capilar puxando-o à mão. Muito lentamente abra a válvula da bomba de pressão mantendo a extremidade aberta do capilar apontada para longe do seu rosto. Observe as etapas iniciais do processo de embalagem.NOTA: Imediatamente após a pressurização, o sorbent preenche o capilar e torna-se não transparente durante todo o comprimento. Assim que o sorbent começa a embalar dentro da extremidade distal, a pressão traseira aumenta, o fluxo diminui e o chorume ainda mais sorbent dentro das reformas capilares em vários pacotes sorbent separados por lacunas sem sorbent. O sorbent já embalado é visível como uma região de crescimento contínuo densamente colorida. Mantenha as regiões preenchidas sorbent pelo menos 70% do comprimento capilar com pequenas lacunas livres sorbent durante toda a duração do processo de embalagem. Existem vários problemas comuns a serem observados durante o processo de embalagem, que requerem ajuste de configuração no voo para manter a entrega eficiente do sorbent no capilar.NOTA: Mais detalhes sobre o ajuste de eficiência de entrega sorbent estão descritos na Tabela 3. Edição 1: Quando o novo sorbent parar de entrar no capilar enquanto o sorbent já dentro continua se movendo, siga os passos abaixo.NOTA: Este é o problema mais frequente. Na maioria dos casos, a entrada capilar é bloqueada por aglomerados sorbent auto-agregantes. Aplique as etapas a seguir, uma a uma, até que o fluxo sorbent seja restaurado e, em seguida, pule o resto das etapas relacionadas ao problema. Aumente a velocidade de rotação para 500 rpm e reduza-a imediatamente para 60-100 rpm. Normalmente, restaura o fluxo sorbent. Verifique a velocidade de rotação a pelo menos 60 rpm para o resto do processo de embalagem. Se não ajudar, desabafe a bomba de embalagem e pressurize-a imediatamente de volta. Se não ajudar ou o bloqueio acontecer novamente, reposicione o capilar dentro da camada sorbent. A ausência do sorbent pode ser devido à extremidade aberta capilar ser muito alta acima da barra de ímã, de modo que a extremidade da coluna não tocá-lo, ou o capilar furando no fundo do frasco. Primeiro, desabafe a bomba completamente, solte a porca, empurre o capilar para o fundo, e depois puxe-a 2 mm para trás. Conserte a porca. Se o bloqueio persistir, desabafe o sistema, tire o frasco sorbent e o vórtice e sonicá-lo mais uma vez. Verifique a extremidade frontal capilar quanto ao dano sob o microscópio e corte ~5 mm da extremidade frontal, se necessário. Edição 2: Quando o sorbent encher apenas uma pequena parte do capilar com longas regiões vazias, siga os passos abaixo. Verifique a velocidade de rotação. Se a rotação for muito lenta, a quebra da cúpula não é eficiente o suficiente. Aumente a velocidade de rotação para ~150 rpm. Se a rotação for muito rápida, o sorbent é resuspendido no maior volume de frasco e a concentração local ao redor da entrada da coluna é baixa. Reduza a velocidade de rotação para 60-100 RPM. Verifique o nível sorbent. O mesmo problema com pouco sorbent dentro do capilar é observado quando não há sorbent suficiente no frasco. Quando o sorbent for usado, encha o frasco com o novo sorbent para manter a camada sorbent não menos de 4 mm de altura após a fixação induzida pela gravidade. Continue embalando a coluna até que o comprimento da coluna alvo mais 5-7 cm seja alcançado. Pare a rotação e despressurize lentamente a bomba. Abra um pouco a válvula da bomba e espere que a bolha estoure dentro da garrafa de água para diminuir. Em seguida, abra a válvula um pouco mais larga e novamente espere a bolha estourar para diminuir a velocidade. Solte a pressão em incrementos até que não saia do gás da válvula.NOTA: Não abra a válvula de uma só vez – ela levará a borbulhar dentro do capilar e o sorbent voltar para o frasco. Se isso acontecer, pressurize a bomba de volta e espere a coluna ser embalada novamente. Quando o gás parar de sair da válvula de ventilação, tire o capilar embalado da bomba de pressão.NOTA: Não deixe a coluna secar. Se não estiver conectado ao sistema HPLC imediatamente para mais embalagem, coloque o capilar embalado no armazenamento, submergindo-o inteiro em uma solução etoh de 10%. Um recipiente de armazenamento de alimentos de polipropileno com gás líquido pode ser usado para armazenamento capilar. As colunas HPLC desconectadas são armazenadas da mesma forma. Se não for planejada mais embalagem, tire o frasco sorbent da bomba e feche-o firmemente. Guarde para mais embalagem de colunas. 5. Embalagem na coluna HPLC Conecte o capilar embalado ao sistema HPLC através de uma conexão HPLC. Inicie o fluxo a 95% solvente B (80 ou 100% acetonitrilo, 0,1% ácido fórmico (FA)) visando 250-300 bar de pressão. Para 40 cm embalado capilar, use a taxa de fluxo de 200-300 nL/min.NOTA: A taxa de fluxo de embalagem é de 200 nL/min para coluna de 40-50 cm com ID de 100 μm embalado com sorbent de 2 μm. Alguns outros tamanhos de coluna estão listados na Tabela 4. As taxas de fluxo para outros comprimentos de coluna e IDs são estimadas a partir da proporcionalidade direta entre a pressão traseira e o comprimento da coluna e seção transversal. A taxa de fluxo exata é ajustada ao comprimento real embalado, que é por padrão mais longo do que o comprimento da coluna alvo. Observe também que a pressão de 300 barras visa o limite de pressão física da conexão HPLC. Para conexões de maior pressão, taxas de fluxo mais altas até o limite de pressão de conexão devem ser usadas para uma embalagem mais rápida. Observe o sorbent solto dentro do capilar ficando embalado e sendo adicionado ao comprimento total embalado. Sem parar o fluxo, mergulhe o corpo da coluna duas vezes no banho de sônica.NOTA: Não mergulhe as extremidades da coluna e as conexões capilares – apenas uma parte do corpo da coluna. A etapa de sonicação ajuda a melhorar a reprodutibilidade da coluna, especialmente para colunas extremamente longas >50 cm de comprimento (dados inéditos); no entanto, ele adiciona uma chance aleatória de quebrar o frit sorbent auto-montado dentro da extremidade do emissor puxado e bloqueando a coluna completamente. Embora a sônica possa ser universalmente aplicada a qualquer coluna de vidro fritado, sugerimos colunas de emissor puxado sonicating apenas para o comprimento da coluna > 50 cm. Quando a cama sorbent parar de encolher, mergulhe o corpo da coluna no banho de sônica duas vezes mais sem parar o fluxo. Execute a coluna por mais 10 minutos em 300 bares. Pare o fluxo, espere a pressão cair para abaixo de três barras e desconecte a coluna. Inspecione visualmente a coluna pela falta de lacunas e descolorações. Se algum for encontrado, a sônica sob o fluxo pode ser repetida. Para experimentos críticos, considere fazer uma nova coluna. Corte a coluna ao comprimento desejado.NOTA: O corte devidamente feito é um pré-requisito para a eficiência da coluna. Faça um entalhe no revestimento de poliimida com o escriba, quebre parcialmente o capilar e puxe duas peças separadas. Polonês a parte frontal da coluna em um wafer de cerâmica ou com filme de lapping. Reconecte a coluna ao sistema LC usando uma conexão UHPLC. Inicie a taxa de fluxo de trabalho em 2% B, dependendo do ID da coluna de acordo com a Tabela 4. Aguarde o equilíbrio da pressão e verifique a pressão traseira da coluna.NOTA: A taxa de fluxo de trabalho é ajustada de acordo com os parâmetros da coluna. Por exemplo, uma coluna ID de 30 cm de comprimento de 100 μm é executada a 500 nL/min. Certifique-se de que a pressão traseira está dentro de 5% do valor esperado (ver Tabela 5), Isso confirma que a coluna está embalada corretamente e está pronta para uso.NOTA: A pressão traseira da coluna é a pressão total no canal de gradiente do sistema HPLC com a coluna conectada menos a pressão traseira dos capilares antes da coluna. Ao mesmo tempo, os valores da Tabela 5 são arbitrários (dão uma escala arbitrária do que esperar). A similaridade intra-laboratorial da pressão traseira da coluna para a coluna é um indicador mais importante de que tudo funciona corretamente. A pressão absoluta real depende de muitos parâmetros, como o tamanho e características sorbent, o ID capilar, o fabricante e o lote, a forma da extremidade do emissor puxado ou a densidade e comprimento do frito de vidro, as características do solvente e a temperatura ambiente na sala, etc. Se a pressão traseira for muito alta, consulte a Tabela 1 para possíveis problemas.

Representative Results

A abordagem FlashPack é baseada na configuração padrão de embalagem e segue o mesmo pipeline de embalagem. A embalagem é feita em capilares de emissor fritado ou puxados padrão. A principal otimização está na concentração de chorume sorbent: o método padrão é incompatível com uma suspensão sorbent de alto concentrado usada no FlashPack. O resultado é um método de produção rápida para colunas UHPLC longas, por exemplo, uma coluna embalada para 50 cm de comprimento com sorbent de 1,9 μm em menos de 1 h(Figura 2). Para demonstrar a aplicação da abordagem FlashPack, foi preparada uma coluna capilar de 30 cm 100 μm ID(Tabela 6). A embalagem de ReprosilPur C18 1.9 μm sorbent foi feita a 60 barras em um 50 cm de comprimento 100 μm ID puxado emitter capillary, preparado por um puxador a laser P2000. O capilar foi embalado a ~40 cm em 40 min com um pouco mais solto sorbent deixado dentro do capilar. O capilar embalado foi conectado a um sistema HPLC e executado a 300 nL/min com solvente B (80% acetonitrilo, 0,1% FA). Após duas rodadas de sonicação de 5 s, o comprimento final embalado foi de 43 cm. A coluna foi desconectada, cortada para 30 cm e conectada ao sistema HPLC usando uma conexão UHPLC. Usamos rotineiramente 360 μm de pele de porca PEEK sem mangas e união de aço inoxidável de 360 μm. Esta combinação mantém pelo menos até 700 barras se apertada fortemente. A coluna fabricada tem uma pressão traseira de 520 barras a 2% de solvente B a 500 nL/min, o que é consistente com a faixa de valor esperada(Tabela 5). Como demonstração da eficiência da coluna, utilizamos a coluna fabricada de 30 cm para separar 50 fmol de um digestor trippático de proteína citocromoma C em um gradiente de 15 min de 2% a 50% B. Cromatógramas de íons extraídos mostraram que os picos eram altamente simétricos com o mínimo de rejeito. A média de FWHM foi em torno de 3 s (Figura 3). Tabela 1: Solução de problemas para alta pressão de fundo da coluna. Clique aqui para baixar esta Tabela. Tabela 2: Programa de puxador a laser P2000/F. Programa de puxador de laser P2000/F para a preparação de capilares emitter puxados a partir de 360 μm OD 100 μm ID fundidos poliimida revestidos de capilares sem revestimento interno a temperaturas ambientes 23-25 °C. Clique aqui para baixar esta Tabela. Tabela 3: Problemas de embalagem e pontos de verificação específicos do FlashPack para controlar durante o processo de embalagem. Clique aqui para baixar esta Tabela. Tabela 4: Taxas exemplares de embalagem e fluxo de trabalho para diferentes IDs de coluna e comprimento. Clique aqui para baixar esta Tabela. Tabela 5: Pressão de retorno esperada para uma coluna embalada comsorbents esféricos de 2 μm e executada à taxa de fluxo de trabalho (de acordo com o ID da coluna) no sistema de solvente RP na RT. Por favor, clique aqui para baixar esta Tabela. Tabela 6: Embalagem exemplar de coluna UHPLC de 30 cm. Clique aqui para baixar esta Tabela. Figura 1: Esquema de embalagem de coluna capilar. Os estágios 1 a 3 são preparatórios, seguidos de embalagem de bombas de pressão e finalizados pela embalagem hplc. As etapas 3 e 4 são modificadas para o protocolo FlashPack ultraeficiente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Taxa de embalagem para um capilário fritado 100 μm ID com ReprosilPur C18 AQ 1,9 μm a 100 barras em metanol. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 3: Cromatógrafos de íons extraídos de peptídeos trippticos de citocromo C. Cromatógramas de íon extraído de peptídeos fônpticos de citocromo C após separação de 50 fmol em 30 cm de comprimento 100 mm ID puxado coluna capilar emitter embalado com ReprosilPur C18 AQ 1.9 μm em um gradiente de tampão B (80% acetonitrilo, 0,1% FA) e no buffer A (2% acetonitrilo, 0,1% FA) de 2% a 40% B em 15 min a 500 nL/min na RT. A detecção foi realizada utilizando-se um espectrômetro de massa. Intensidades absolutas e faixas de m/z extraídas para cada peptídeo são mostradas à direita do espectro. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A embalagem de colunas capilares internas é altamente popular em grandes laboratórios que trabalham em vários projetos independentes. No entanto, um método comum de embalagem de uma suspensão sorbent de baixa concentração tem grandes limitações na velocidade e é incapaz de produzir longas colunas UHPLC.

FlashPack é uma modificação do procedimento de embalagem padrão que torna possível a embalagem de uma concentração sorbent muito alta. A base teórica do método reside na contínua desestabilização da cúpula sorbent na entrada da coluna durante toda a duração da embalagem. Este último é tecnicamente alcançado pela entrada da coluna sendo continuamente atingido com uma barra de ímã. O método de desestabilização da cúpula é intencionalmente desenvolvido para ter a configuração de embalagem completamente semelhante ao processo de embalagem comum, mas o truque do FlashPack está nos detalhes da preparação do chorume sorbent, posicionamento capilar e uso de barras de ímã durante o processo de embalagem.

O chorume sorbent é preparado como uma camada de sedimentos sorbent em um grande volume de solventes. É interessante que a embalagem baseada em bombas de pressão não exija as mesmas condições de embalagem para coluna para coluna. No FlashPack, nunca sabemos a concentração exata de chorume sorbent ao redor da entrada da coluna. É impossível medir e controlar exatamente, pois também muda durante o processo de embalagem. No entanto, as colunas finais ainda são muito reprodutíveis4, independentemente de como a embalagem foi alcançada.

A base para a embalagem rápida está na eficiente desestabilização da cúpula sorbent. Por essa razão, é importante controlar a entrada do sorbent no capilar e manter as condições ideais de desestabilização da cúpula durante toda a duração da embalagem. Existem vários problemas possíveis que podem impedir uma entrega eficiente. Alguns exemplos deles são a ressuspensão de camada sorbent por rotação rápida da barra magnética, desestabilização ineficiente da cúpula devido a um capilar relativo errado ao posicionamento da barra de ímã ou rotação muito lenta da barra de ímã. As questões em si e como elas devem ser abordadas são discutidas detalhadamente na seção de protocolo.

Depois que a coluna estiver embalada, o parâmetro principal da coluna para verificar é a pressão traseira da coluna. Os valores de pressão listados na Tabela 5 fornecem um ponto de referência ao que é esperado para um dos populares tamanhos de contas sub 2 μm sorbent-Reproent-ReproSil PUR C18 AQ (1,9 μm). Ao mesmo tempo, uma pressão adicional pode ser adicionada pelo frit ou um emissor muito estreitamente puxado e deve-se monitorar constantemente para isso. Se a embalagem for feita em um emissor puxado, ainda sugerimos medir a pressão traseira da coluna esperada para o sorbent particular em uso, embalando capilares fritados primeiro, e depois para ver se o frito auto-montado acrescenta muito. Para quaisquer problemas de alta pressão, use as diretrizes fornecidas na Tabela 1 para identificar o problema.

Em nossa experiência, uma coluna embalada sem descolorações, lacunas, e com a devida pressão traseira funciona em 100% dos casos e dá a qualidade de separação próxima ao que se pode esperar do comprimento da coluna e características sorbentes. Uma coluna com descolorações não é garantida para funcionar corretamente, mas ainda pode dar resultados satisfatórios.

Na maioria das vezes, se houver algum problema com a qualidade da separação, eles não vêm da própria coluna, mas sim de outras partes do sistema de separação, ou seja, bombas, solventes ou conexões. Especialmente potencialmente prejudicial é qualquer conexão pós-coluna. A má conexão com um volume morto entre o emissor e a coluna fritada leva a um grande pico de ampliação e seguimento devido a taxas de fluxo muito baixas na cromatografia capilar.

Uma questão mais importante específica para a abordagem FlashPack é que ele usa um monte de sorbents caros em um frasco de chorume sorbent funcionando. Lembre-se, que o chorume sorbent no FlashPack é destinado a uso múltiplo. Cuide do sorbent. Evite a agitação desnecessária da barra de ímã para reduzir a moagem sorbent lembre-se para parar a rotação assim que a embalagem estiver pronta. E não deixe o frasco aberto na bomba de pressão para evitar a secagem sorbent. Embora o sorbent ainda possa ser usado depois disso, leva tempo para refazer o chorume sorbent.

O método funciona igualmente bem tanto para capilares fritados quanto para capilares de emissor puxado. O princípio flashPack aumenta a taxa de embalagem para IDs capilares de 20 para 250 μm (menores e maiores não foram testados). Também é aplicável a todos os sorbents, tanto total e superficialmente porosos, que pudemos testar (refletindo que a formação da cúpula sorbent em alta concentração de chorume não se limita especificamente aos sorbents de RP). Além disso, os parâmetros de solventes afetam claramente a embalagem de acordo com suas características físicas e químicas. Por exemplo, acetona menos viscosa dá uma taxa de embalagem ainda maior do que o metanol na mesma pressão de embalagem. No entanto, também é menos polar do que o metanol e reduz partículas sorbent grudados umas nas outras. O efeito por si só impede a formação de cúpula sorbente no início da embalagem quando a taxa de fluxo ainda é alta. No entanto, a redução da interação com partículas sorbent também leva a uma formação de frit auto-montador menos confiável e bloqueio mais frequente durante a embalagem. Assim, enquanto o acetona é melhor para embalagem de capilares fritados, é menos adequado para capilares puxados- emitter, com o metanol como um solvente de chorume sendo mais lento, mas adequado para ambos os tipos de finalização. Embalagem de hexano ou diclorometano (DCM) são casos extremos de mudança para acetona de metanol: eles são ainda menos polares, por isso impedem completamente a formação de cúpula sorbent, no entanto, eles não são aptos para embalagem de emissor puxado em tudo. Além disso, notou-se que a polaridade extremamente baixa do DCM leva a partículas sorbent grudadas na parede capilar interna e fazendo uma camada grossa sobre ela. A espessura da camada cresce gradualmente e blocos locais aleatórios formam-se na coluna embalada em várias partes separadas por regiões sem sorbent. Tal efeito foi observado para C18 Peptide Aeris sorbent.

Outra questão observada foi o sorbent YMC Triart C18 não ser suspenso em metanol corretamente, mas para formar algum tipo de flocos. No entanto, isso não o impede de ficar embalado com o FlashPack e dar eficiência de separação muito decente (dados não publicados). Assim, embora não seja o ideal para alguns casos, o metanol foi o solvente mais universal para trabalhar para todos os sorbents e colunas testados. É necessário mencionar que ainda não analisamos como diferentes solventes de chorume afetam a eficiência da separação da coluna. Ao mesmo tempo, a eficiência das colunas embaladas a partir do metanol já é completamente igual às colunas comerciais para os mesmos sorbents4.

O FlashPack não é a única abordagem existente para melhorar a taxa de embalagem das colunas UHPLC. A embalagem rápida de alta concentração de chorume sorbent também é possível com o uso de embalagem de ultra-alta pressão7. A vantagem do FlashPack é que ele é muito mais simples, pois não requer bombas especiais de ultra-alta pressão e bombas de pressão para entrega sorbent e conexões capilares. Ao mesmo tempo, foi demonstrado que as colunas embaladas em pressões extremas podem ter eficiência de separação maior do que as colunas de pressão mais baixa17. E enquanto o FlashPack produz colunas idênticas às comerciais usadas na comparação4, para as quais não sabemos o método de embalagem, ainda não foi testado como as colunas FlashPack se posicionam contra colunas embaladas por ultra-alta pressão.

Em resumo, o método FlashPack descrito pode ser facilmente adaptado ao protocolo de embalagem existente em laboratório com alguns ajustes feitos no protocolo, enquanto a configuração permanece completamente a mesma. Acelera a embalagem da coluna capilar HPLC a minutos e permite a produção de longas colunas capilares UHP, o que é claramente impossível com o procedimento padrão de embalagem. A economia global no tempo e dinheiro para o laboratório por aplicação da abordagem FlashPack pode ser contada em dezenas de milhares de euros por ano. Além disso, a capacidade de produzir colunas capilares UHP abre localmente as possibilidades de personalização de experimentos impossíveis com os produtos comerciais disponíveis.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O trabalho foi apoiado pela concessão da RSF 20-14-00121. Os autores agradecem p. V. Shliaha (Memorial Sloan Kettering Cancer Center) por discussões frutíferas.

Materials

Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid Merck 1.59002
centrifuge tube 1.5 mL Eppendorf
Ceramic Scoring Wafer Restek 20116 any ceramic wafer is suitable for capillary polishing
Diamond-chip bladed scribe NewObjective Diamond-chip bladed scribe recommended for capillary cutting
fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD CM Scientific TSP100375
GELoader tips Eppendorf 30001222
HPLC system ThermoScientific Ultimate3000 RSLCnano
laser puller Sutter P2000/F
magnet bar 2×5 mm Merck Z283819
MeOH Merck 1.06018
microspatula Merck Z193216
PEEK ferrule 360 mm VICI JR-C360NFPK use to connect the column to UPLC union
pipette tip, 1000 uL Merck Z740095
pipette, 1000 uL Gilson Pipetman L P1000L
pressure bomb NextAdvance PC-77 MAG
regulator GCE Jetcontrol 600 200/103
Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm Dr. Maisch r13.aq.0001
Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL Merck AXYST050SS
Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL Merck AXYST150SS
Screw caps with O-rings Merck AXYSCOC
sonication bath Elma Elmasonic S30 H
union HPLC VICI JR-C360RU1PK6 HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column
union UPLC VICI JR-C360RU1FS6 UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column
vortex BioSan V-1plus
Water with 0.1% (v/v) Formic acid Merck 1.59013
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Kovalchuk, S. I., Ziganshin, R., Shelukhina, I. Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach. J. Vis. Exp. (178), e62522, doi:10.3791/62522 (2021).
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