フラッシュパックアプローチによるシンプルな社内超高性能キャピラリーカラム製造

梱包プロトコルは5つのステップ(図1):1)パッキングステーションの準備、2)毛管調製、3)吸着スラリー製剤、4)圧力爆弾内のキャピラリーパッキング、および5)HPLCシステム内のカラムパッキングで構成され、サイズとUHPLC接続の設置に切り取られます。FlashPack 最適化では、共通プロトコルと比較してセクション 3 および 4 で調整を行う必要があります。 1. パッキングステーションアセンブリ 窒素、ヘリウム、またはアルゴンを充填したガスタンクを、出口圧力>50バーを備えた単一ステージのガスレギュレータで供給して準備します。最大圧力は圧力爆弾の互換性によって制限される。 圧力爆弾のベントバルブにレギュレータを接続します。 圧力爆弾に統合された磁気スターラーが装備されていない場合は、磁気スターラーに爆弾を置きます。 狭いIDプラスチックチューブ(例えば、0.13mm)を圧力爆弾の通気口に接続し、水で容器に入れます。 2. 毛細血管製剤 カシルとホルムアミド15 から形成された一体化ガラスフリットまたはレーザープーラー16によって調製された引っ張られたエミッタキャピラリーでフリットキャピラリーを準備する。毛細管は意図したコラムの長さより10-15 cm長く作られる。注: さまざまなキャピラリーサイズとフリットタイプに関連する可能性のある問題については、 表 1 を参照してください。 表2 は、プルドエミッタキャピラリーを作るためのP2000レーザープーラープログラムの例を示しています。 カットされたゲルローディングピペットチップで引っ張られたエミッタの端を保護します。 チップをカットして、360 μmのOD毛細管の周りにしっかりとフィットします(毛細血管に沿って移動できますが、そのためには何らかの努力が必要です)。 カットピペットチップをキャピラリーフロントエンドの方向からキャピラリーにスライドさせ、エミッタの端まで移動します。 柱がスプレーされているときに、保護チップをスライドバックします。柱がスプレーされていないときに(柱が流れの下にあるが、まだスプレーしていない場合でも)、先端の内側にエミッタの端を持つには、先端を前方にスライドさせます。 3. ソルベントスラリー製剤 ストックの吸着剤バイアルを準備する:1.5 mL遠心チューブに乾燥剤の〜50mgを置きます。ここで、Reprosil Pur C18が例として用いられる。 吸着管に1mLのメタノールを加えます。 完全に混合するには、渦ミキサーを使用して10sのチューブを渦に入れ。 10 sのための超音波処理浴で超音波処理。 20~30分間、ソルベントを十分に浸します。その後、渦ともう一度それを超音波処理します。 働く吸着剤バイアルを準備します。爆弾に収まる円錐形の底のバイアルを使用してください。注:それは別の1.5 mL遠心管または特定の圧力爆弾の設計に応じて他のバイアルのいずれかであることができます。この実験では、圧力爆弾の高さに切断された円錐形の底ねじキャップチューブが使用される。 ストック・ソルベント・バイアルの吸着剤を再び中断し、2 x 3 mmサイズのマグネットバーを使用して500 μLを作動性の吸着剤バイアルに移します。 作業バイアルに約1 mLまでのメタノールを加えます。 作業バイアルは、吸着剤が重力によって落ち着くために10分間テーブルの上に立たせます。 沈降後、吸着剤層が4mm以下の場合は、ストックの吸着スラリーを追加し、さらに10分間落ち着くのを待ちます。注:準備された働くバイアルは、数ヶ月にわたって複数の列の準備を意図しています。作業吸着バイアルが2時間以上攪拌せずに滞在する場合、それは10 sのために渦巻き、10 sのために超音波処理され、重力によって解決されなければなりません。定期的に、吸着剤は、充填前の午前中に再中断されます。次に、連続列パッキングの間に長い休止がない場合は、一日の梱包に適しています。働くバイアルの吸着剤が乾燥した場合は、メタノールを加え、ストック吸着バイアル(ステップ3.2-3.5)に関して完全な吸着剤調製手順を実行します。 4. 圧力爆弾でキャピラリーパッキング 注意:圧力爆弾を使用する場合は、常に保護メガネを着用してください。手袋をはめないでください。これらは、小径の毛細血管の適切な取り扱いに必要な触覚を著しく低下させ、間違いにつながります。 圧力爆弾に吸着バイアルを入れ、すべてのナットをしっかりと固定します。 60~100rpmで回転を開始します。 フリットまたは引っ張られたエミッタキャピラリーを爆弾に挿入します:バイアルの一番下に押し込み、2〜3mm持ち上げてナットを固定します。注:毛細血管やフェルールの損傷を避けるために毛細血管を固定するために必要最小限の力を適用します。一番の手締めです。六重レンチを使用する場合は、締めるのに十分な労力を最小限にしてください。 毛細管が正しく固定されているかどうかを確認してください- 手で引き出すことによって毛細血管を動かすことは不可能でなければなりません。 あなたの顔から離れて指し、毛細血管の開いた端を保ちながら非常にゆっくりと圧力爆弾バルブを開きます。 梱包プロセスの初期手順をご覧ください。注:加圧の直後に、吸着剤が毛細管を充填し、全長に対して透明でなくなります。吸着剤が遠位端の内側に詰め始めるとすぐに、背圧が増加し、流れが減速し、毛細管内の吸着スラリーでさえ、吸着剤のないギャップで区切られたいくつかの吸着パケットに変わります。既にパックされた吸着剤は、密集した着色連続成長領域として見える。 充填された部分は、充填プロセス全体の間、小さな吸着剤の空き隙を持つキャピラリー長さの少なくとも70%に保ちます。 パッキングプロセス中に注意すべきいくつかの一般的な問題があり、毛細血管への効率的な吸着物の送達を維持するために機内設定調整が必要です。注: 吸着剤の納期効率調整の詳細については、表 3を参照してください。 問題1:新しい吸着剤がキャピラリーに入り止まり、すでに内部の吸着剤が動き続ける場合は、次の手順に従ってください。注: これは最も頻繁な問題です。ほとんどの場合、毛細血管の入り口は自己凝集する吸着団によってブロックされます。次のステップを 1 つずつ適用して、吸着フローが復元され、問題に関連する残りの手順をスキップします。 回転速度を500rpmに上げ、すぐに60〜100rpmに戻します。通常、それは吸着流を復元します。残りの梱包プロセスでは、回転速度が60rpm以上であることを確認します。 それが役に立たない場合は、簡単に梱包爆弾を発散し、すぐにそれを加圧します。 それが役に立たないか、ブロッキングが再び起こる場合は、吸着剤層の内側に毛細血管を再配置します。吸着剤の不在は、キャピラリーオープンエンドがマグネットバーの上に高すぎるか、柱の端がそれに触れないか、またはキャピラリーがバイアル底部に突き刺さったりすることが原因である可能性があります。まず、爆弾を完全に通気し、ナットを緩め、キャピラリーを底に押し付け、2mm戻します。ナットを固定します。 ブロッキングが持続する場合は、システムを通して、吸着バイアルと渦を取り出し、もう一度超音波処理します。キャピラリー前頭の端部が顕微鏡下で損傷していないかどうかを確認し、必要に応じてフロントエンドの5mmを切ります。 問題 2: 吸着剤が長い空の領域で毛細血管のごく一部のみを満たす場合は、次の手順に従います。 回転速度を確認します。回転が遅すぎると、キューポラの割れが十分に効率的ではありません。回転速度を~150 rpmに上げます。 回転が速すぎると、吸着剤はより大きなバイアルボリュームに再懸濁され、カラムの入り口の周りの局所的な吸着剤濃度が低くなります。回転速度を 60~100 RPM まで遅くします。 吸着剤のレベルを確認します。バイアルに十分な吸着剤がない場合、毛細血管内の吸着剤がほとんどない同じ問題が観察されます。吸着剤が使い果たされたら、バイアルに新しい吸着剤を充填して、重力によって起こる沈降後に吸着層を4mm以上高く保ちます。 ターゲット列の長さに 5~7 cm を加えた値が達成されるまで、カラムを梱包し続けます。 回転を停止し、非常にゆっくりと爆弾を減圧します。 爆弾弁を少し開けて、水筒の中でバブルが破裂するのを待ちます。その後、バルブを少し広く開き、再びバブルが減速するのを待ちます。 バルブからガスが出なくなるまで、圧力を段階的に放出します。注:一度にバルブを開けないでください – それはキャピラリーの中でバブリングし、吸着剤がバイアルに戻ります。その場合は、爆弾を加圧し、列が再びパックされるのを待ちます。 ガスがベントバルブから出てくるのを止めたら、詰まった毛細管を圧力爆弾から取り出します。メモ:カラムを乾かしてはなりません。HPLCシステムに直ちに接続されていない場合は、パックされたキャピラリーを10%のEtOH溶液に完全に沈めてストレージに入れます。キャピラリー貯蔵用に、液体密閉ポリプロピレン食品貯蔵容器を使用することができます。切断されたHPLCカラムも同様に保存されます。 それ以上の梱包が計画されていない場合は、爆弾から吸着バイアルを取り出し、しっかりと閉じます。さらなる列の梱包のためにそれを保ちます。 5. HPLC カラムのパッキング パックされたキャピラリーをHPLC接続でHPLC システムに 接続します。 250~300バー圧を目標に95%溶媒B(80または100%アセトニトリル、0.1%のギ酸(FA))で流れ始めます。40 cmパックキャピラリーの場合は、200-300 nL/分の流量を使用してください。注:パッキングの流量は2μmの吸着剤が詰まった100 μm IDの40-50 cmカラムのための200 nL/minである。表 4に、その他の列サイズを示します。他のカラム長およびIDの流量は、背圧とカラム長と断面の間の直接比例性から推定されます。正確な流量は実際のパックされた長さに調整されます。また、300バーの圧力はHPLC接続の物理的圧力限界をターゲットとしていることにも注意してください。高い圧力接続では、接続圧力限界までの流量が速く充填されます。 毛細管内の緩い吸着物が詰まり、合計パックされた長さに追加されるのを見てください。 流れを止めずに、カラム本体を超音波浴に2回浸します。注: 柱の端部と毛細血管接続は、柱本体の一部のみを使用して浸漬しないでください。超音波処理ステップは、特に長さ50cm(未公開のデータ)>非常に長い列の列の再現性を向上させるのに役立ちます。ただし、引っ張られたエミッタキャピラリーのエミッタの端の内側に自己組立の吸着フリットを壊し、カラムを完全にブロックするランダムなチャンスが追加されます。超音波処理は、任意のガラスフリットカラムに普遍的に適用することができますが、我々は50センチメートル>列の長さのためのプルドエミッタカラムを超音波処理することをお勧めします。 吸着剤のベッドが収縮を停止したら、流れを止めずにカラム本体を超音波浴に2倍以上浸します。 300 バーで 10 分の列を実行します。 流れを止め、圧力が3つのバーを下回るのを待ち、列を取り外します。 ギャップや変色が欠けているかどうかを視覚的に検査します。もし見つかったら、流れの下で超音波処理を繰り返すことができます。重要な実験の場合は、新しい列を作成することを検討してください。 列を目的の長さに切り取ります。注: 適切に行われた切断は、カラム効率の前提条件です。筆記者でポリイミドコーティングのノッチを作り、部分的に毛細血管を割り、2つの部分を引き離します。 セラミックウエハーまたはラッピングフィルムで柱のフロントエンドを磨きます。 UHPLC 接続を使用して、列を LC システムに再接続します。 表 4に従って、列 ID に応じて作業流量を 2% B から開始します。圧力が平衡化するのを待ち、カラムの背圧を確認します。注: 作業流量は、カラムパラメータに従って調整されます。たとえば、長さ30cmの100 μm IDカラムは500 nL/minで実行されます。 バックプレッシャが期待値の 5% 以内であることを確認します ( 表 5を参照)、列が正しくパックされ、使用できる状態であることを確認します。注: カラムバックプレッシャは、列が接続された HPLC システムの勾配チャネルの全圧力から、柱の前にあるキャピラリーの背圧を差し引いたものです。同時に、 表 5 の値は任意です (期待するものの任意のスケールを与えます)。カラムからカラムへの背圧の実験室内類似性は、すべてが正常に動作することを示すより重要な指標です。実際の絶対背圧は、吸着剤の大きさや特性、キャピラリーID、製造およびバッチ、引っ張られたエミッタの形状やガラスフリットの密度と長さ、部屋の溶媒特性や周囲温度など、多くのパラメータに依存します。バックプレッシャーが高すぎる場合は、問題の可能性について 表 1 を参照してください。