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Biochemistry

Semplice produzione interna di colonne capillari ad altissime prestazioni con l'approccio FlashPack

Published: December 04, 2021
doi:
10.3791/62522
, ,
1Laboratory of Bioinformatics Methods in Combinatorial Chemistry and Biology, Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry,Russian Academy of Sciences, 2Department of Molecular Neuroimmune Signalling, Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry,Russian Academy of Sciences

Summary

Qui presentiamo un protocollo per la procedura di confezionamento a colonna capillare FlashPack ottimizzata. L’applicazione di un protocollo ottimizzato a una comune configurazione della bomba a pressione da 100 bar consente l’imballaggio e la produzione 10 volte più veloci di lunghe colonne capillari ad altissime prestazioni.

Abstract

La cromatografia liquida capillare ad altissime prestazioni (UHPLC) è attualmente un metodo di scelta per la fase di separazione del campione nella proteomica basata su LC-MS. Tuttavia, le colonne capillari sono molto meno robuste rispetto ai loro controtipi di flusso più elevato. A causa della facile contaminazione e del blocco, spesso hanno bisogno di essere sostituiti. Ciò li rende una parte notevolmente costosa del costo totale dell’analisi LC-MS. L’imballaggio interno di colonne capillari UHPLC consente di risparmiare un sacco di soldi e consente la personalizzazione. Tuttavia, la procedura di imballaggio standard nella bomba a pressione da 100 bar funziona bene solo per le colonne HPLC, ma è troppo lenta per i assorbenti UHPLC. Qui forniamo una descrizione di un protocollo FlashPack ottimizzato applicato alla stessa configurazione della bomba a pressione da 100 bar. Il metodo si basa sull’imballaggio da liquami ad altissima concentrazione assorbente ed è sviluppato per la produzione interna di colonne capillari UHPLC di lunghezza illimitata in tempi ragionevoli.

Introduction

La moderna proteomica si basa sulla spettrometria di massa accoppiata a cromatografia liquida con la cromatografia nano-flusso ad altissime prestazioni (separazione del diametro interno della colonna (ID)) da 50-150 μm) che fornisce la migliore velocità e sensibilità di analisi1. Mentre sono disponibili numerose colonne capillari UHPLC commerciali, il loro prezzo costituisce una parte importante del costo dei materiali di consumo, specialmente quando più progetti diversi vengono eseguiti in laboratorio e la contaminazione delle colonne specifiche del progetto è un problema frequente. Inoltre, l’imballaggio interno delle colonne consente l’uso di assorbenti personalizzati specifici per l’esperimento (come, ad esempio, il sorbente polyCAT-A2) e caratteristiche della colonna non disponibili per l’acquisto come colonna già pronta.

Per far fronte a ciò, molti laboratori imballano internamente colonne capillari. Tuttavia, la procedura di imballaggio comune con una bomba a pressione da 100 bar (cella di iniezione apressione) 3 non è adatta all’imballaggio della colonna UHPLC a causa dell’elevata contropressione dei assorbenti UHPLC inferiori a 2 μm con conseguente drastica riduzione del tasso di imballaggio rispetto agli assorbenti HPLC di dimensioni maggiori. Mentre le colonne UHPLC corte possono ancora essere imballate molto lentamente, la produzione di colonne UHPLC lunghe è fisicamente impossibile4.

L’imballaggio standard della colonna capillare viene eseguito a pressioni relativamente basse, fino a 100 bar e con una concentrazione di liquame assorbente molto bassa. Quindi, sono disponibili due possibili direzioni per accelerare il processo. È possibile aumentare la pressione di imballaggio5. Tuttavia, ciò richiede attrezzature speciali e, praticamente, l’installazione di un nuovo metodo in laboratorio. Un altro modo è aumentare la concentrazione di liquame assorbente6. L’imballaggio ad alta concentrazione di liquami assorbenti è descritto in combinazione con una pressione di imballaggio ultra-elevata in una precedente pubblicazione7. Tuttavia, a una pressione di 100 bar, che viene utilizzata nella maggior parte delle bombe da imballaggio esistenti, una maggiore concentrazione assorbente si traduce in un rallentamento della velocità di imballaggio o nella cessazione definitiva dell’imballaggio. L’effetto è stato recentemente dimostrato essere dovuto al raggruppamento assorbente all’ingresso della colonna, e un semplice trucco di destabilizzazione della cupola assorbente martellando l’ingresso della colonna con una barra magnetica all’interno di una fiala assorbente è stato suggerito4. Il metodo risultante, denominato FlashPack, utilizza la stessa configurazione di imballaggio della bomba a pressione da 100 bar. Allo stesso tempo, modifiche minori ma critiche nella procedura di imballaggio consentono l’imballaggio da una concentrazione di liquame assorbente molto elevata e la produzione di colonne UHPLC molto lunghe (da 50 a 70 cm e più) in meno di un’ora, mentre una colonna corta può essere prodotta in pochi minuti con la qualità di separazione pari alle colonne commerciali degli stessi parametri4. L’approccio FlashPack è già stato utilizzato con successo in progetti di proteomica multipla per la preparazione di entrambe le colonnecapillari di fase inversa (RP)8,9,10,11,12, 12,13, 14 e di interazione idrofila (HILIC)2.

Qui descriviamo in dettaglio le modifiche necessarie per l’adattamento dell’approccio FlashPack alla procedura standard di confezionamento delle bombe a pressione da 100 bar.

Protocol

Il protocollo di imballaggio consiste in cinque fasi (Figura 1): 1) Preparazione della stazione di imballaggio, 2) preparazione capillare, 3) preparazione del liquame assorbente, 4) imballaggio capillare nella bomba a pressione e 5) imballaggio della colonna nel sistema HPLC, taglio fino alle dimensioni e installazione della connessione UHPLC. L’ottimizzazione di FlashPack richiede modifiche da apportare nelle sezioni 3 e 4 rispetto al protocollo comune. 1. Assemblaggio della stazione di imballaggio Preparare un serbatoio di gas riempito con azoto, elio o argon dotato di un regolatore di gas monostadio con la pressione di uscita > 50 bar. La pressione massima è limitata dalla compatibilità della bomba a pressione. Collegare il regolatore alla valvola di sfiato della bomba a pressione. Se la bomba a pressione non è dotata di un agitatore magnetico integrato, posizionare la bomba su un agitatore magnetico. Collegare un tubo di plastica ID stretto (ad esempio, 0,13 mm) all’uscita di sfiato della bomba a pressione e metterlo in un recipiente con acqua. 2. Preparazione capillare Preparare un capillare fritto con una fritta di vetro integrata formata da Kasil e formamide15 o un capillare emettitore tirato preparato da un estrattore laser16. Il capillare è reso 10-15 cm più lungo della lunghezza della colonna prevista.NOTA: Vedere la Tabella 1 per la discussione dei possibili problemi associati a diverse dimensioni dei capillari e tipi di fritta. La Tabella 2 contiene un esempio di un programma di estrattore laser P2000 per la realizzazione di capillari tirati-emettitore. Proteggere un’estremità dell’emettitore tirato con una punta della pipetta di caricamento del gel tagliata. Tagliare la punta in modo che si adatti saldamente attorno al capillare OD da 360 μm (può essere spostato lungo il capillare ma richiede un certo sforzo per farlo). Far scorrere la punta della pipetta tagliata sul capillare dalla direzione dell’estremità anteriore capillare e spostarla verso l’estremità dell’emettitore. Far scorrere indietro la punta di protezione quando la colonna sta spruzzando. Far scorrere la punta in avanti per avere l’estremità dell’emettitore all’interno della punta quando la colonna non spruzza (anche quando la colonna è sotto il flusso, ma ancora non spruzza). 3. Preparazione del liquame assorbente Preparare un flaconcino assorbente: posizionare ~ 50 mg di assorbente secco in un tubo di centrifuga da 1,5 ml. Qui, Reprosil Pur C18 è usato come esempio. Aggiungere 1 mL di metanolo al tubo assorbente. Per mescolarlo completamente, vortice il tubo per 10 s usando un miscelatore a vortice. Sonicate in un bagno di sonicazione per 10 s. Lasciare che l’assorbente si impregni accuratamente per 20-30 minuti. Quindi, vortice e sonicatelo ancora una volta. Preparare un flaconcino assorbente funzionante. Utilizzare una fiala conica inferiore che si inserisce nella bomba.NOTA: può essere un altro tubo della centrifuga da 1,5 ml o qualsiasi altra fiala a seconda del particolare design della bomba a pressione. Per questo esperimento, viene utilizzato il tubo conico del tappo a vite inferiore tagliato all’altezza della bomba a pressione. Ricaricare l’assorbente nel flaconcino assorbente di riserva e trasferire 500 μL nel flaconcino assorbente funzionante con una barra magnetica di dimensioni 2 x 3 mm. Aggiungere metanolo fino a ~1 mL al flaconcino funzionante. Lasciare riposare il flaconcino funzionante sul tavolo per 10 minuti affinché il assorbente si depositi per gravità. Se, dopo la sedimentazione, lo strato assorbente è inferiore a 4 mm, aggiungere altro liquame assorbente e attendere che il sorbente si depositi per altri 10 minuti.NOTA: il flaconcino di lavoro preparato è destinato alla preparazione di più colonne nell’arco di mesi. Se il flaconcino assorbente funzionante rimane senza agitarsi per più di 2 ore, deve essere vorticoso per 10 s, sonicato per 10 s e stabilizzato per gravità. Di routine, l’assorbente viene riconsosomato al mattino prima di imballare. Quindi, è buono per l’imballaggio per l’intera giornata se non ci sono lunghe pause tra l’imballaggio sequenziale della colonna. Se l’assorbente nel flaconcino di lavoro si asciuga, aggiungere metanolo ed eseguire la procedura di preparazione completa dell’assorbente come per il flaconcino di assorbente di riserva (passaggi 3.2-3.5). 4. Imballaggio capillare in una bomba a pressione ATTENZIONE: Indossare sempre occhiali protettivi quando si lavora con la bomba a pressione. Non indossare guanti. Questi riducono notevolmente il senso del tatto necessario per una corretta gestione dei capillari di piccolo diametro e portano a errori. Posizionare il flaconcino assorbente nella bomba a pressione e fissare saldamente tutti i dadi. Avviare la rotazione a 60-100 giri / min. Inserire il capillare dell’emettitore fritto o tirato nella bomba: spingerlo sul fondo della fiala, quindi sollevarlo di 2-3 mm e fissare il dado.NOTA: Applicare una forza minima richiesta per fissare il capillare per evitare danni ai capillari e alla ghiera. Il meglio è stringere la mano. Se si utilizza una chiave esagonale, applicare uno sforzo minimo sufficiente per il serraggio. Controllare se il capillare è fissato correttamente: deve essere impossibile spostare il capillare estraendolo a mano. Aprire molto lentamente la valvola della bomba a pressione mantenendo l’estremità aperta del capillare puntata lontano dal viso. Guarda le fasi iniziali del processo di imballaggio.NOTA: Subito dopo la pressurizzazione, l’assorbente riempie il capillare e diventa non trasparente per tutta la lunghezza. Non appena il sorbente inizia a impacchettarsi all’interno dell’estremità distale, la contropressione aumenta, il flusso rallenta e il liquame assorbente uniforme all’interno del capillare si riforma in diversi pacchetti assorbenti separati da spazi vuoti privi di assorbenti. Il assorbente già confezionato è visibile come una regione densamente colorata in continua crescita. Mantenere le regioni riempite di assorbente ad almeno il 70% della lunghezza capillare con piccoli spazi liberi assorbenti per l’intera durata del processo di imballaggio. Ci sono diversi problemi comuni da osservare durante il processo di imballaggio, che richiedono la regolazione della configurazione in volo per mantenere un’efficiente consegna assorbente nel capillare.NOTA: Maggiori dettagli sulla regolazione dell’efficienza di erogazione del sorbente sono descritti nella Tabella 3. Problema 1: Quando il nuovo assorbente smette di entrare nel capillare mentre il assorbente già all’interno continua a muoversi, seguire i passaggi seguenti.NOTA: questo è il problema più frequente. Nella maggior parte dei casi l’ingresso capillare viene bloccato da cluster assorbenti autoaggreganti. Applicare i passaggi seguenti uno per uno fino a quando il flusso assorbente non viene ripristinato, quindi ignorare il resto dei passaggi relativi al problema. Aumentare la velocità di rotazione a 500 giri / min e ridurla immediatamente a 60-100 giri / min. Di solito, ripristina il flusso assorbente. Controllare che la velocità di rotazione sia di almeno 60 giri /min per il resto del processo di imballaggio. Se non aiuta, sfiatare brevemente la bomba da imballaggio e pressurizzarla immediatamente indietro. Se non aiuta o il blocco si verifica di nuovo, riposizionare il capillare all’interno dello strato assorbente. L’assenza dell’assorbente può essere dovuta al fatto che l’estremità aperta capillare è troppo alta sopra la barra magnetica, quindi l’estremità della colonna non la tocca, o il capillare che si attacca al fondo della fiala. In primo luogo, sfiatare completamente la bomba, allentare il dado, spingere il capillare verso il basso, quindi tirarlo indietro di 2 mm. Fissare il dado. Se il blocco persiste, sfiatare il sistema, es togliere la fiala assorbente e il vortice e sonicarlo ancora una volta. Controllare l’estremità frontale capillare per danni al microscopio e tagliare ~ 5 mm della parte anteriore, se necessario. Problema 2: Quando l’assorbente riempie solo una piccola parte del capillare con lunghe regioni vuote, seguire i passaggi seguenti. Controllare la velocità di rotazione. Se la rotazione è troppo lenta, la rottura della cupola non è abbastanza efficiente. Aumentare la velocità di rotazione a ~ 150 giri / min. Se la rotazione è troppo veloce, l’assorbente viene ricaspenato nel volume del flaconcino più grande e la concentrazione locale di assorbente intorno all’ingresso della colonna è bassa. Rallenta la velocità di rotazione fino a 60-100 RPM. Controllare il livello assorbente. Lo stesso problema con poco assorbente all’interno del capillare si osserva quando non c’è abbastanza assorbente nel flaconcino. Quando il sorbente si ecloda, riempire il flaconcino con il nuovo assorbente per mantenere lo strato assorbente alto non meno di 4 mm dopo la sedimentazione indotta dalla gravità. Continuare a imballare la colonna fino a raggiungere la lunghezza della colonna target più 5-7 cm. Fermare la rotazione e depressurizzare molto lentamente la bomba. Apri un po ‘la valvola della bomba e attendi che la bolla scoppi all’interno della bottiglia d’acqua si plachi. Quindi, aprire la valvola un po ‘più ampia e attendere nuovamente che la bolla scoppi rallenti. Rilasciare la pressione a incrementi fino a quando nessun gas esce dalla valvola.NOTA: Non aprire la valvola fino in fondo in una sola volta – porterà a gorgogliare all’interno del capillare e il sorbente tornerà nel flaconcino. Se ciò accade, fai pressione sulla bomba e attendi che la colonna si impacchetta di nuovo. Quando il gas smette di uscire dalla valvola di sfiato, togliere il capillare imballato dalla bomba a pressione.NOTA: non lasciare asciugare la colonna. Se non si collega immediatamente al sistema HPLC per un ulteriore imballaggio, mettere il capillare imballato in stoccaggio immergendolo intero in una soluzione etOH al 10%. Un contenitore per alimenti in polipropilene a tenuta di liquido può essere utilizzato per la conservazione capillare. Le colonne HPLC disconnesse vengono archiviate nello stesso modo. Se non è previsto alcun ulteriore imballaggio, es togliere la fiala assorbente dalla bomba e chiuderla saldamente. Conservalo per un ulteriore imballaggio della colonna. 5. Imballaggio nella colonna HPLC Collegare il capillare imballato al sistema HPLC tramite una connessione HPLC. Avviare il flusso al 95% di solvente B (80 o 100% acetonitrile, 0,1% di acido formico (FA)) mirando a una pressione di 250-300 bar. Per capillari imballati di 40 cm, utilizzare la portata di 200-300 nL/min.NOTA: La portata di impacchettamento è di 200 nL/min per colonna da 40-50 cm con ID da 100 μm imballato con assorbente da 2 μm. Alcune altre dimensioni delle colonne sono elencate nella Tabella 4. Le portate per altre lunghezze di colonna e ID sono stimate in base alla proporzionalità diretta tra la contropressione e la lunghezza e la sezione trasversale della colonna. La portata esatta viene regolata in base alla lunghezza effettiva del pacco, che per impostazione predefinita è più lunga della lunghezza della colonna di destinazione. Si noti inoltre che la pressione di 300 bar si rivolge al limite di pressione fisica della connessione HPLC. Per i collegamenti a pressione più elevata, è necessario utilizzare portate più elevate fino al limite di pressione di connessione per un imballaggio più rapido. Fai attenzione che l’assorbente sciolto all’interno del capillare venga imballato e aggiunto alla lunghezza totale dell’imballaggio. Senza interrompere il flusso, immergere il corpo della colonna due volte nel bagno di sonicazione.NOTA: non immergere le estremità delle colonne e le connessioni capillari, solo una parte del corpo della colonna. La fase di sonicazione aiuta a migliorare la riproducibilità delle colonne, in particolare per colonne estremamente lunghe >50 cm (dati non pubblicati); tuttavia, aggiunge una possibilità casuale di rompere la fritta assorbente autoassemblante all’interno dell’estremità dell’emettitore tirato capillare e bloccare completamente la colonna. Mentre la sonicazione può essere applicata universalmente a qualsiasi colonna fritta di vetro, suggeriamo di sonicare colonne di emettitore tirato solo per la lunghezza della colonna > 50 cm. Quando il letto assorbente smette di restringersi, immergere il corpo della colonna nel bagno di sonicazione due volte di più senza interrompere il flusso. Eseguire la colonna per altri 10 minuti a 300 barre. Arrestare il flusso, attendere che la pressione scenda al di sotto di tre bar e scollegare la colonna. Ispezionare visivamente la colonna per la mancanza di spazi vuoti e scolorimenti. Se ne vengono trovati, la sonicazione sotto il flusso può essere ripetuta. Per gli esperimenti critici, prendi in considerazione la possibilità di creare una nuova colonna. Tagliare la colonna alla lunghezza desiderata.NOTA: il taglio eseguito correttamente è un prerequisito per l’efficienza della colonna. Fai una tacca in rivestimento in poliimmide con lo scriba, spezza parzialmente il capillare e separa due pezzi. Lucidare il frontale della colonna su un wafer ceramico o con pellicola di lappatura. Ricollegare la colonna al sistema LC utilizzando una connessione UHPLC. Avviare la portata di lavoro al 2% B a seconda dell’ID colonna secondo la Tabella 4. Attendere che la pressione si equilibra e controllare la contropressione della colonna.NOTA: la portata di lavoro viene regolata in base ai parametri della colonna. Ad esempio, una colonna ID lunga 30 cm e 100 μm viene eseguita a 500 nL/min. Assicurarsi che la contropressione sia entro il 5% del valore previsto (vedere Tabella 5), Questo conferma che la colonna è imballata correttamente ed è pronta per l’uso.NOTA: La contropressione della colonna è la pressione totale nel canale gradiente del sistema HPLC con la colonna collegata meno la contropressione dei capillari prima della colonna. Allo stesso tempo, i valori nella Tabella 5 sono arbitrari (danno una scala arbitraria di cosa aspettarsi). La somiglianza intra-laboratorio della contropressione da colonna a colonna è un indicatore più importante che tutto funzioni correttamente. L’effettiva contropressione assoluta dipende da molti parametri, come la dimensione e le caratteristiche dell’assorbente, l’ID capillare, il produttore e il lotto, la forma dell’estremità dell’emettitore tirato o la densità e la lunghezza della fritta di vetro, le caratteristiche del solvente e la temperatura ambiente nella stanza, ecc. Se la contropressione è troppo alta, vedere la Tabella 1 per possibili problemi.

Representative Results

L’approccio FlashPack si basa sulla configurazione standard di imballaggio e segue la stessa pipeline di imballaggio. L’imballaggio viene effettuato in capillari standard di emettitore fritti o tirati. L’ottimizzazione principale risiede nella concentrazione di liquame assorbente: il metodo standard è incompatibile con una sospensione assorbente ad alta concentrazione utilizzata in FlashPack. Il risultato è un metodo di produzione veloce per colonne UHPLC lunghe, ad esempio una colonna imballata per 50 cm di lunghezza con assorbente da 1,9 μm in meno di 1 ora (Figura 2). Per dimostrare l’applicazione dell’approccio FlashPack, è stata preparata una colonna capillare ID da 30 cm e 100 μm (Tabella 6). L’imballaggio del assorbente ReprosilPur C18 da 1,9 μm è stato effettuato a 60 bar in un capillare emettitore tirato ID lungo 50 cm, preparato da un estrattore laser P2000. Il capillare è stato imballato a ~ 40 cm in 40 minuti con un po ‘più di assorbente sciolto lasciato all’interno del capillare. Il capillare imballato è stato collegato a un sistema HPLC e funzionato a 300 nL/min con solvente B (80% acetonitrile, 0,1% FA). Dopo due cicli di sonicazione di 5 s, la lunghezza finale imballata era di 43 cm. La colonna è stata scollegata, tagliata a 30 cm e collegata al sistema HPLC tramite una connessione UHPLC. Utilizziamo abitualmente ghiera in PEEK senza maniche da 360 μm e unione in acciaio inossidabile da 360 μm. Questa combinazione contiene almeno fino a 700 barre se stretta fortemente. La colonna fabbricata ha una contropressione di 520 bar al 2% di solvente B a 500 nL/min, che è coerente con l’intervallo di valori attesi (Tabella 5). Come dimostrazione dell’efficienza della colonna, abbiamo utilizzato la colonna da 30 cm fabbricata per separare 50 fmol di un digest triptico della proteina del citocromo C in un gradiente di 15 minuti dal 2% al 50% B. I cromatogrammi ionici estratti hanno mostrato che i picchi sono altamente simmetrici con un minimo di coda. L’FWHM medio era di circa 3 s (Figura 3). Tabella 1: Risoluzione dei problemi per l’elevata contropressione di lavoro della colonna. Fare clic qui per scaricare questa tabella. Tabella 2: programma di estrattore laser P2000 / F. Programma di estrattore laser P2000/F per la preparazione di capillari emettitore tirati da 360 μm OD 100 μm ID capillari rivestiti in poliimmide di silice fusa senza rivestimento interno a temperature ambiente 23-25 °C. Clicca qui per scaricare questa tabella. Tabella 3: Problemi di imballaggio specifici di FlashPack e punti di controllo da controllare durante il processo di imballaggio. Fare clic qui per scaricare questa tabella. Tabella 4: Impacchettamento esemplare e portate di lavoro per diversi id di colonna e lunghezza. Fare clic qui per scaricare questa tabella. Tabella 5: Contropressione prevista per una colonna imballata con assorbentisferici da 2 μm e funzionante alla portata di lavoro (secondo l’ID colonna) nel sistema a solvente RP di RT. Fare clic qui per scaricare questa tabella. Tabella 6: Imballaggio esemplare di colonna UHPLC da 30 cm. Fare clic qui per scaricare questa tabella. Figura 1: Schema di imballaggio della colonna capillare. Le fasi da 1 a 3 sono preparatorie, seguite dall’imballaggio della bomba a pressione e completate dall’imballaggio HPLC. Le fasi 3 e 4 sono modificate per il protocollo FlashPack ultra-efficiente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Velocità di imballaggio per un ID capillare fritto da 100 μm con ReprosilPur C18 AQ 1,9 μm a 100 bar in metanolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Cromatogrammi ionici estratti di peptidi trittici del citocromo C. Cromatogrammi ionici estratti di peptidi trittici del citocromo C dopo separazione di 50 fmol in 30 cm di lunghezza 100 mm ID tirato emettitore capillare colonna imballata con ReprosilPur C18 AQ 1,9 μm in un gradiente di tampone B (80% acetonitrile, 0,1% FA) e nel tampone A (2% acetonitrile, 0,1% FA) dal 2% al 40% B in 15 min a 500 nL/min a RT. Il rilevamento è stato eseguito utilizzando uno spettrometro di massa. Le intensità assolute e gli intervalli m/z estratti per ciascun peptide sono mostrati a destra degli spettri. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

L’imballaggio interno di colonne capillari è molto popolare nei grandi laboratori che lavorano su più progetti indipendenti. Tuttavia, un metodo di imballaggio comune da una sospensione assorbente a bassa concentrazione presenta importanti limitazioni nella velocità e non è in grado di produrre lunghe colonne UHPLC.

FlashPack è una modifica della procedura di imballaggio standard che rende possibile l’imballaggio da una concentrazione di assorbente molto elevata. La base teorica del metodo risiede nella destabilizzazione continua della cupola assorbente all’ingresso della colonna per l’intera durata dell’imballaggio. Quest’ultimo è tecnicamente ottenuto dall’ingresso della colonna che viene continuamente colpito con una barra magnetica. Il metodo di destabilizzazione della cupola è intenzionalmente sviluppato per avere la configurazione dell’imballaggio completamente simile al comune processo di imballaggio, ma il trucco di FlashPack risiede nei dettagli della preparazione del liquame assorbente, del posizionamento capillare e dell’uso della barra magnetica durante il processo di imballaggio.

Il liquame assorbente viene preparato come strato assorbente di sedimenti in un grande volume di solvente. È interessante notare che l’imballaggio a pressione basato sulla bomba non richiede le stesse condizioni di imballaggio per colonna a colonna. In FlashPack, non conosciamo mai l’esatta concentrazione di liquami assorbenti intorno all’ingresso della colonna. È impossibile misurare e controllare esattamente, poiché cambia anche durante il processo di imballaggio. Tuttavia, le colonne finali sono ancora molto riproducibili4 indipendentemente da come è stato realizzato l’imballaggio.

La base per l’imballaggio veloce risiede nell’efficiente destabilizzazione della cupola assorbente. Per questo motivo, è importante controllare l’assorbimento che entra nel capillare e mantenere le condizioni ottimali di destabilizzazione della cupola per tutta la durata dell’imballaggio. Ci sono diversi possibili problemi che potrebbero impedire una consegna efficiente dell’assorbente. Alcuni esempi di questi sono la ripresa dello strato assorbente mediante rotazione rapida della barra magnetica, la destabilizzazione inefficiente della cupola dovuta al posizionamento errato della barra del magnete o alla rotazione troppo lenta della barra magnetica. Le questioni stesse e il modo in cui devono essere affrontate sono discusse in dettaglio nella sezione protocollo.

Dopo che la colonna è stata imballata, il parametro principale della colonna da controllare è la contropressione della colonna. I valori di pressione elencati nella Tabella 5 forniscono un punto di riferimento a ciò che ci si aspetta per uno dei più diffusi assorbenti-ReproSil PUR C18 AQ (1,9 μm) di dimensioni inferiori a 2 μm. Allo stesso tempo, la contropressione aggiuntiva potrebbe essere aggiunta dalla fritta o da un emettitore tirato troppo strettamente e si dovrebbe monitorare costantemente per questo. Se l’imballaggio viene effettuato in un emettitore tirato, suggeriamo comunque di misurare la contropressione della colonna prevista per il particolare assorbente in uso imballando prima i capillari fritti e poi per vedere se la fritta autoassemblante aggiunge troppo. Per eventuali problemi di alta pressione, utilizzare le linee guida fornite nella Tabella 1 per individuare il problema.

Nella nostra esperienza, una colonna imballata senza scolorimenti, spazi vuoti e con la corretta contropressione funziona nel 100% dei casi e conferisce alla qualità di separazione una qualità vicina a ciò che ci si può aspettare dalla lunghezza della colonna e dalle caratteristiche assorbenti. Una colonna con scolorimenti non è garantita per funzionare correttamente, ma può comunque dare risultati soddisfacenti.

Il più delle volte, se ci sono problemi con la qualità della separazione, non provengono dalla colonna stessa, ma piuttosto da altre parti del sistema di separazione, vale a dire pompe, solventi o connessioni. Particolarmente dannose sono le connessioni post-colonna. Una cattiva connessione con un volume morto tra l’emettitore e la colonna fritta porta a un importante allargamento e coda del picco a causa di portate molto basse nella cromatografia capillare.

Un altro problema importante specifico per l’approccio FlashPack è che utilizza molti assorbenti costosi in una fiala di liquame assorbente funzionante. Si ricorda che il liquame assorbente in FlashPack è destinato a un uso multiplo. Prenditi cura del assorbente. Evitare inutili agitazioni della barra magnetica per ridurre la macinazione assorbente, ricordarsi di interrompere la rotazione non appena l’imballaggio è terminato. E non lasciare il flaconcino assorbente aperto nella bomba a pressione per evitare l’essiccazione assorbente. Sebbene il assorbente possa ancora essere utilizzato dopo, ci vuole tempo per rifare il liquame assorbente.

Il metodo funziona ugualmente bene sia per i capillari fritti che per i capillari a emettitore tirato. Il principio FlashPack aumenta la velocità di impacchettamento per gli ID capillari da 20 a 250 μm (piccoli e più grandi non sono stati testati). È anche applicabile a tutti gli assorbenti, sia completamente che superficialmente porosi, che potremmo testare (riflettendo che la formazione della cupola assorbente in alta concentrazione di liquame assorbente non è limitata specificamente agli assorbenti RP). Inoltre, i parametri del solvente influenzano chiaramente l’imballaggio in base alle loro caratteristiche fisiche e chimiche. Ad esempio, meno acetone viscoso dà una velocità di imballaggio ancora più elevata rispetto al metanolo alla stessa pressione di imballaggio. Tuttavia, è anche meno polare del metanolo e riduce le particelle assorbenti che si attaccano l’una all’altra. L’effetto di per sé impedisce la formazione di cupole assorbenti all’inizio dell’imballaggio quando la portata è ancora elevata. Tuttavia, la riduzione dell’interazione delle particelle assorbenti porta anche a una formazione di fritta autoassemblante meno affidabile e a un blocco più frequente dell’estremità tirata durante l’imballaggio. Quindi, mentre l’acetone è migliore per l’imballaggio di capillari fritti, è meno adatto per i capillari emettitori tirati, con il metanolo come solvente per liquami più lento ma adatto a entrambi i tipi di terminazione. L’imballaggio da esano o diclorometano (DCM) sono casi estremi di passaggio all’acetone dal metanolo: sono ancora meno polari, quindi impediscono completamente la formazione di cupola assorbente, tuttavia non sono affatto adatti per l’imballaggio dell’emettitore tirato. Inoltre, è stato notato che una polarità DCM estremamente bassa porta a particelle assorbenti che si attaccano alla parete capillare interna e creano uno spesso strato su di essa. Lo spessore dello strato cresce gradualmente e si formano blocchi locali casuali con il risultato che la colonna è imballata in più parti separate da regioni senza assorbente. Tale effetto è stato osservato per il peptide C18 Aeris assorbente.

Un altro problema osservato è stato che il sorbente YMC Triart C18 non è stato sospeso correttamente nel metanolo, ma per formare una sorta di fiocchi. Tuttavia, ciò non gli impedisce di essere imballato con il FlashPack e di dare un’efficienza di separazione molto decente (dati non pubblicati). Pertanto, pur non essendo ottimale per alcuni casi, il metanolo era il solvente più universale per funzionare per tutti gli assorbenti e le colonne testati. È necessario ricordare che non abbiamo ancora analizzato come i diversi solventi per liquami influenzano l’efficienza di separazione delle colonne. Allo stesso tempo, l’efficienza delle colonne imballate con metanolo è già completamente uguale alle colonne commerciali per gli stessi assorbenti4.

FlashPack non è l’unico approccio esistente per migliorare la velocità di imballaggio delle colonne UHPLC. L’imballaggio rapido da un’elevata concentrazione di liquami assorbenti è possibile anche con l’uso di imballaggi ad altissimapressione 7. Il vantaggio di FlashPack è che è molto più semplice in quanto non richiede speciali pompe ad altissima pressione e bombe a pressione per l’erogazione assorbente e le connessioni capillari. Allo stesso tempo, è stato dimostrato che le colonne imballate a pressioni estreme possono avere un’efficienza di separazione superiore alle colonne a pressione inferiore17. E mentre FlashPack produce colonne identiche a quelle commerciali utilizzate nel confronto4, per le quali non conosciamo il metodo di imballaggio, non è stato ancora testato come le colonne FlashPack si fermatono contro le colonne ad altissima pressione.

In sintesi, il metodo FlashPack descritto può essere facilmente adattato al protocollo di imballaggio esistente in laboratorio con alcune modifiche apportate al protocollo, mentre l’installazione rimane completamente la stessa. Accelera l’imballaggio della colonna capillare HPLC a pochi minuti e consente la produzione di lunghe colonne capillari UHP, il che è chiaramente impossibile con la procedura di imballaggio standard. L’economia complessiva nel tempo e nel denaro per il laboratorio mediante l’applicazione dell’approccio FlashPack può essere contata in decine di migliaia di euro all’anno. Inoltre, la possibilità di produrre localmente colonne capillari UHP apre le possibilità di personalizzazione degli esperimenti impossibili con i prodotti commerciali disponibili.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Il lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione RSF 20-14-00121. Gli autori ringraziano P. V. Shliaha (Memorial Sloan Kettering Cancer Center) per le fruttuose discussioni.

Materials

Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid Merck 1.59002
centrifuge tube 1.5 mL Eppendorf
Ceramic Scoring Wafer Restek 20116 any ceramic wafer is suitable for capillary polishing
Diamond-chip bladed scribe NewObjective Diamond-chip bladed scribe recommended for capillary cutting
fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD CM Scientific TSP100375
GELoader tips Eppendorf 30001222
HPLC system ThermoScientific Ultimate3000 RSLCnano
laser puller Sutter P2000/F
magnet bar 2×5 mm Merck Z283819
MeOH Merck 1.06018
microspatula Merck Z193216
PEEK ferrule 360 mm VICI JR-C360NFPK use to connect the column to UPLC union
pipette tip, 1000 uL Merck Z740095
pipette, 1000 uL Gilson Pipetman L P1000L
pressure bomb NextAdvance PC-77 MAG
regulator GCE Jetcontrol 600 200/103
Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm Dr. Maisch r13.aq.0001
Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL Merck AXYST050SS
Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL Merck AXYST150SS
Screw caps with O-rings Merck AXYSCOC
sonication bath Elma Elmasonic S30 H
union HPLC VICI JR-C360RU1PK6 HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column
union UPLC VICI JR-C360RU1FS6 UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column
vortex BioSan V-1plus
Water with 0.1% (v/v) Formic acid Merck 1.59013
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References

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In-house Capillary Column ManufacturingFlashPack ApproachUltra-high Performance Capillary Liquid ChromatographyLC-MS ProteomicsPeptide SeparationCapillary ColumnsSorbent PackingHigh Sorbent Slurry ConcentrationPressure Bomb PackingMagnet BarPacking RateUltra-high Performance SorbentsLong ColumnsColumn Preparation ProcedurePacking StationNitrogen Gas TankPressure BombMagnetic StirrerPEEK Capillary

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Kovalchuk, S. I., Ziganshin, R., Shelukhina, I. Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach. J. Vis. Exp. (178), e62522, doi:10.3791/62522 (2021).
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