Eenvoudige in-house ultra-high performance capillaire kolomproductie met de FlashPack-aanpak

Het verpakkingsprotocol bestaat uit vijf stappen(figuur 1): 1)Pakstationvoorbereiding, 2) capillaire bereiding, 3) sorptiemiddeldrijfmestbereiding, 4) capillaire verpakking in de drukbom en 5) kolomverpakking in het HPLC-systeem, snijden tot de grootte en UHPLC-verbindingsinstallatie. De FlashPack-optimalisatie vereist aanpassingen in secties 3 en 4 in vergelijking met het gemeenschappelijke protocol. 1. Montage van pakstations Bereid een gastank gevuld met stikstof, helium of argon voor, voorzien van een eentraps gasregelaar met een uitlaatdruk > 50 bar. De maximale druk wordt beperkt door de compatibiliteit van de drukbom. Sluit de regelaar aan op de ontluchtingsklep van de drukbom. Als de drukbom niet is uitgerust met een geïntegreerde magneetroerder, plaats de bom dan op een magneetroerder. Sluit een smalle ID-kunststofbuis (bijv. 0,13 mm) aan op de ontluchtingsuitlaat van de drukbom en plaats deze in een vat met water. 2. Capillaire bereiding Bereid een gefrituurd capillair met een geïntegreerde glazen frit gevormd uit Kasil en formamide15 of een getrokken emitter capillair bereid door een lasertrekker16. Het capillair is 10-15 cm langer gemaakt dan de beoogde kolomlengte.OPMERKING: Zie tabel 1 voor de bespreking van mogelijke problemen in verband met verschillende capillaire maten en frittypen. Tabel 2 bevat een voorbeeld van een P2000 laser puller programma voor het maken van pulled-emitter capillairen. Bescherm een getrokken emitteruiteinde met een gesneden pipetpunt met gelbelasting. Knip de punt zo dat deze strak om het 360 μm OD-capillair past (het kan langs het capillair worden bewogen, maar vereist enige inspanning om dat te doen). Schuif de gesneden pipetpunt vanuit de richting van de capillaire voorkant op het capillair en beweeg deze naar het uiteinde van de emitter. Schuif de beschermpunt naar achteren wanneer de kolom aan het spuiten is. Schuif de punt naar voren om de emitter in de punt te laten eindigen wanneer de kolom niet spuit (zelfs als de kolom onder de stroom zit, maar nog steeds niet spuit). 3. Sorbent slurry bereiding Bereid een injectieflacon met sorptiemiddel voor: Plaats ~50 mg droog sorptiemiddel in een centrifugebuis van 1,5 ml. Hier wordt Reprosil Pur C18 als voorbeeld gebruikt. Voeg 1 ml methanol toe aan de absorberende buis. Om het volledig te mengen, vortex de buis gedurende 10 s met behulp van een vortex mixer. Soniceer in een ultrasoonapparaatbad gedurende 10 s. Laat het sorptiemiddel 20-30 min goed weken. Draai dan en soniceer het nogmaals. Bereid een werkende injectieflacon met sorptiemiddel voor. Gebruik een conische injectieflacon met bodem die in de bom past.OPMERKING: Het kan een andere centrifugebuis van 1,5 ml of een andere injectieflacon zijn, afhankelijk van het specifieke drukbomontwerp. Voor dit experiment wordt gebruik gemaakt van conische onderste schroefdopbuis die tot de hoogte van de drukbom is gesneden. Resuspend het sorptiemiddel in de voorraadsorbentflacon en breng 500 μL over in de werkende injectieflacon met sorptiemiddel met een magneetbalk van 2 x 3 mm. Voeg methanol tot ~1 ml toe aan de werkflacon. Laat de werkflacon 10 minuten op tafel staan om het sorptiemiddel door de zwaartekracht te laten bezinken. Als de sorptielaag na het bezinken minder dan 4 mm is, voeg dan meer van de voorraadsorbent slurry toe en wacht tot het sorptiemiddel nog 10 minuten is bezinkt.OPMERKING: De voorbereide werkflacon is bedoeld voor de voorbereiding van meerdere kolommen gedurende maanden. Als de werkende injectieflacon met sorptiemiddel langer dan 2 uur zonder te roeren blijft, moet deze gedurende 10 s worden gevortexed, gedurende 10 s worden gesoniseerd en door de zwaartekracht worden bezinkt. Routinematig wordt het sorptiemiddel ‘s ochtends vóór het verpakken geresuspendeerd. Dan is het goed voor het inpakken voor de hele dag als er geen lange pauzes zijn tussen het sequentiële kolom verpakken. Als het sorptiemiddel in de werkflacon uitdroogt, voegt u methanol toe en voert u de volledige sorptiepreparaatprocedure uit zoals voor de injectieflacon met voorraadsorptie (stappen 3.2-3.5). 4. Capillaire verpakking in een drukbom LET OP: Draag altijd een beschermende bril wanneer u met de drukbom werkt. Draag geen handschoenen. Deze verminderen de tastzin die nodig is voor een goede behandeling van haarvaten met een kleine diameter ernstig en leiden tot fouten. Plaats de injectieflacon met sorptiemiddel in de drukbom en bevestig alle moeren stevig. Start de rotatie bij 60-100 tpm. Steek het gefrituurde of getrokken emitter capillair in de bom: duw het naar de bodem van de injectieflacon en til het vervolgens 2-3 mm op en bevestig de moer.OPMERKING: Pas een minimaal vereiste kracht toe om het capillair te fixeren om capillaire en ferruleschade te voorkomen. Het beste is het aanspannen van de hand. Als een inbussleutel wordt gebruikt, moet u minimaal voldoende inspanning leveren om aan te spannen. Controleer of het capillair goed is gefixeerd – het moet onmogelijk zijn om het capillair te bewegen door het met de hand uit te trekken. Open heel langzaam het drukbomventiel terwijl je het open uiteinde van het capillair van je gezicht gericht houdt. Bekijk de eerste stappen van het verpakkingsproces.OPMERKING: Onmiddellijk na drukvulling vult het sorptiemiddel het capillair en wordt het over de hele lengte ondoorzichtig. Zodra het sorptiemiddel zich in het distale uiteinde begint te verpakken, neemt de tegendruk toe, vertraagt de stroom en verandert de gelijkmatige sorbent slurry in het capillair in verschillende sorptiepakketten gescheiden door sorbentvrije openingen. Reeds verpakt sorptiemiddel is zichtbaar als een dichtgekleurd continu groeiend gebied. Houd de met sorptiemiddel gevulde gebieden gedurende de gehele duur van het verpakkingsproces op ten minste 70% van de capillaire lengte met kleine sorptievrije openingen. Er zijn verschillende veelvoorkomende problemen om in de gaten te houden tijdens het verpakkingsproces, die aanpassing van de installatie tijdens de vlucht vereisen om een efficiënte sorptiemiddelafgifte in het capillair te houden.OPMERKING: Meer details over de aanpassing van de efficiëntie van de sorptiemiddeltoevoer worden beschreven in tabel 3. Probleem 1: Wanneer nieuw sorptiemiddel stopt met het binnendringen van het capillair terwijl het sorptiemiddel dat er al in zit, blijft bewegen, volgt u de onderstaande stappen.OPMERKING: Dit is het meest voorkomende probleem. In de meeste gevallen wordt de capillaire ingang geblokkeerd door zelfaggregaterende sorptieclusters. Pas de volgende stappen één voor één toe totdat de sorptiestroom is hersteld en sla vervolgens de rest van de probleemgerelateerde stappen over. Verhoog de rotatiesnelheid tot 500 tpm en verlaag deze onmiddellijk terug naar 60-100 tpm. Meestal herstelt het de sorptiestroom. Controleer of de rotatiesnelheid ten minste 60 tpm is voor de rest van het verpakkingsproces. Als het niet helpt, ontlucht dan kort de verpakkingsbom en druk deze onmiddellijk terug. Als het niet helpt of de blokkering opnieuw gebeurt, verplaats dan het capillair in de absorberende laag. De afwezigheid van het sorptiemiddel kan te wijten zijn aan het feit dat het capillaire open uiteinde te hoog boven de magneetbalk is, zodat het kolomuiteinde het niet raakt, of dat het capillair in de bodem van de injectieflacon steekt. Ontlucht eerst de bom volledig, maak de moer los, duw het capillair naar de bodem en trek het vervolgens 2 mm naar achteren. Bevestig de moer. Als de blokkering aanhoudt, ontlucht u het systeem, haalt u de injectieflacon met het sorptiemiddel en de vortex eruit en maakt u deze opnieuw soniceren. Controleer het capillaire frontale uiteinde op schade onder de microscoop en snijd indien nodig ~ 5 mm van de voorkant. Probleem 2: Wanneer het sorptiemiddel slechts een klein deel van het capillair vult met lange lege gebieden, volgt u de onderstaande stappen. Controleer de rotatiesnelheid. Als de rotatie te langzaam is, is het breken van de koepel niet efficiënt genoeg. Verhoog de rotatiesnelheid tot ~150 rpm. Als de rotatie te snel is, wordt het sorptiemiddel geresuspendeerd in het grotere flaconvolume en is de lokale sorptiemiddelconcentratie rond de kolomingang laag. Vertraag de rotatiesnelheid tot 60-100 RPM. Controleer het sorptiegehalte. Hetzelfde probleem met weinig sorptiemiddel in het capillair wordt waargenomen wanneer er niet genoeg sorptiemiddel in de injectieflacon zit. Wanneer het sorptiemiddel is opgebruikt, vult u de injectieflacon met het nieuwe sorptiemiddel om de sorptielaag niet minder dan 4 mm hoog te houden na door zwaartekracht veroorzaakte bezinking. Blijf de kolom inpakken totdat de doelkolomlengte plus 5-7 cm is bereikt. Stop de rotatie en maak de bom heel langzaam onder druk. Open de bomklep een beetje en wacht tot de bubbel in de waterfles is gezakt. Open vervolgens de klep iets breder en wacht opnieuw tot de bel barst om te vertragen. Laat de druk in stappen los totdat er geen gas uit de klep komt.OPMERKING: Open de klep niet helemaal in één keer – dit zal leiden tot borrelen in het capillair en het sorptiemiddel dat teruggaat in de injectieflacon. Als dat gebeurt, zet je de bom onder druk en wacht je tot de kolom weer vol zit. Wanneer het gas niet meer uit de ontluchtingsklep komt, haalt u het verpakte capillair uit de drukbom.OPMERKING: Laat de kolom niet uitdrogen. Indien niet onmiddellijk aangesloten op het HPLC-systeem voor verdere verpakking, plaatst u het verpakte capillair in opslag door het in zijn geheel onder te dompelen in een 10% EtOH-oplossing. Een vloeistofdichte polypropyleen voedselopslagcontainer kan worden gebruikt voor capillaire opslag. Losgekoppelde HPLC-kolommen worden op dezelfde manier opgeslagen. Als er geen verdere verpakking gepland is, haalt u de injectieflacon met het absorberend middel uit de bom en sluit u deze goed af. Bewaar het voor verdere kolomverpakking. 5. Verpakking in de HPLC-kolom Sluit het verpakte capillair aan op het HPLC-systeem via een HPLC-verbinding. Start de stroom bij 95% oplosmiddel B (80 of 100% acetonitril, 0,1% mierenzuur (FA)) gericht op een druk van 250-300 bar. Gebruik voor 40 cm verpakt capillair het debiet van 200-300 nL / min.OPMERKING: Het pakdebiet is 200 nL/min voor een kolom van 40-50 cm met een ID van 100 μm verpakt met 2 μm sorptiemiddel. Enkele andere kolomgrootten zijn opgenomen in tabel 4. De stroomsnelheden voor andere kolomlengten en -ID’s worden geschat op basis van de directe evenredigheid tussen de tegendruk en de kolomlengte en doorsnede. Het exacte debiet wordt aangepast aan de werkelijke verpakte lengte, die standaard langer is dan de beoogde kolomlengte. Merk ook op dat de druk van 300 bar gericht is op de fysieke druklimiet van de HPLC-verbinding. Voor verbindingen met een hogere druk moeten hogere debieten tot aan de verbindingsdruklimiet worden gebruikt voor een snellere verpakking. Kijk uit of het losse sorptiemiddel in het capillair wordt verpakt en wordt toegevoegd aan de totale verpakte lengte. Zonder de stroom te stoppen, dompelt u het kolomlichaam twee keer in het ultrasoonapparaatbad.OPMERKING: Dompel kolomuiteinden en capillaire verbindingen niet onder – slechts een deel van het kolomlichaam. Sonicatiestap helpt de reproduceerbaarheid van kolommen te verbeteren, vooral voor extreem lange kolommen >50 cm lang (ongepubliceerde gegevens); het voegt echter een willekeurige kans toe om de zelfassemblerende sorptiefrie in het emitteruiteinde van het getrokken emittercapillair te breken en de kolom volledig te blokkeren. Hoewel ultrasoonapparaat universeel kan worden toegepast op alle kolommen met glazen fritten, raden we aan om getrokken emitterkolommen alleen te soniceren voor de kolomlengte > 50 cm. Wanneer het absorberende bed stopt met krimpen, dompelt u het kolomlichaam twee keer meer in het ultrasoonapparaatbad zonder de stroom te stoppen. Voer de kolom nog eens 10 minuten uit bij 300 bars. Stop de stroom, wacht tot de druk daalt tot onder de drie bar en koppel de kolom los. Inspecteer de kolom visueel op het ontbreken van openingen en verkleuringen. Als er een wordt gevonden, kan ultrasoonapparaat onder de stroom worden herhaald. Voor kritische experimenten kunt u overwegen een nieuwe kolom te maken. Knip de kolom op de gewenste lengte.OPMERKING: Goed gedaan snijden is een voorwaarde voor kolomefficiëntie. Maak een inkeping in polyimidecoating met de scribent, kraak het capillair gedeeltelijk en trek twee stukken uit elkaar. Polijst de voorkant van de kolom op een keramische wafer of met lappende film. Sluit de kolom opnieuw aan op het LC-systeem met behulp van een UHPLC-verbinding. Start het werkdebiet bij 2% B, afhankelijk van de kolom-ID volgens tabel 4. Wacht tot de druk in evenwicht is en controleer de kolomrugdruk.OPMERKING: Het werkdebiet wordt aangepast aan de kolomparameters. Een 30 cm lange 100 μm ID-kolom wordt bijvoorbeeld uitgevoerd op 500 nL / min. Zorg ervoor dat de tegendruk binnen 5% van de verwachte waarde ligt (zie tabel 5), Dit bevestigt dat de kolom goed is verpakt en klaar is voor gebruik.OPMERKING: De kolomtegendruk is de totale druk in het gradiëntkanaal van het HPLC-systeem met de kolom verbonden minus de tegendruk van de haarvaten vóór de kolom. Tegelijkertijd zijn de waarden in tabel 5 willekeurig (ze geven een willekeurige schaal van wat te verwachten). De intralaboratorium-gelijkenis van de tegendruk van kolom tot kolom is een belangrijkere indicator dat alles naar behoren werkt. De werkelijke absolute tegendruk hangt af van vele parameters, zoals de grootte en kenmerken van het sorptiemiddel, de capillaire ID, fabrikant en batch, de vorm van het getrokken emitteruiteinde of de dichtheid en lengte van de glasfriet, de oplosmiddeleigenschappen en de omgevingstemperatuur in de kamer, enz. Als de tegendruk te hoog is, zie tabel 1 voor mogelijke problemen.