FASP Sindirimi ve Veriden Bağımsız Analiz yoluyla EPS-İdrarın Proteomik Profili

Çalışma, Catanzaro Magna Graecia Üniversitesi Kurumsal Etik Komitesi tarafından RP 41/2018 tarafından onaylandı. Çalışmaya kayıtlı tüm hastalardan yazılı bilgilendirilmiş onam alındı. 1. Numune hazırlama Oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca 2.100 x g’da 2 saat içinde eps-idrar örnekleri santrifüj. Süpernatant kullanılana kadar -80 °C’de saklayın. 2. Örnek çözülme Numuneyi sindirimden bir gün önce -80 °C’den -20 °C’ye aktarın. Numune işlemeden önce, numuneyi 4 °C’de 15-20 dakika ve ardından RT’de aktarın. 3. FASP için reaktif hazırlığı Aynı gün, aşağıdaki çözümleri hazırlayın: üre tamponu, üre tamponunda 50 mM iodoasetamid (IAA), 50 mM trietilammonyum bikarbonat ve 500 mM dithiothreitol (DTT). Üre tamponu hazırlayın (üre 8 M, 100 mM Tris-HCl pH 8): 10 mL için 4.800 mg üre ağırlığında ve 1 mL 1 M Tris pH 8 ekledikten sonra uygun miktarda HPLC suyunda çözün. Her numune için 800 μL üre hacmi gereklidir. 500 mM dithiothreitol (DTT) hazırlayın: 500 μL HPLC suda 38,5 mg DTT çözün. Her numune için 66,7 μL DTT gereklidir. Üre Tamponunda 50 mM IAA hazırlayın: 1 mL üre tamponunda 9,25 mg IAA çözün. Her numune için 50 μL IAA gereklidir. 50 mM trietilammonyum bikarbonat (TEAB) hazırlayın. 2,85 mL HPLC suya 150 μL 1 M TEAB ekleyin. Her numune için 460 μL TEAB gereklidir. HPLC suyunda bir tripsin çözeltisi (100 ng/μL) hazırlayın. Bu çözelti -80 °C’de saklanabilir ve kullanımdan hemen önce çözülebilir. Her numune için 2 μL (200 ng) gereklidir. 4. FASP tarafından protein sindirimi Proteinleri yatıştırmak ve disülfit bağlarını azaltmak için her EPS-idrar örneğinin 500 μL’sini ‘luk (w/v) sodyum dodecyl sülfat (SDS) 66,7 μL ve 1 M Tris pH 8’in 33,3 μL’si ile seyreltin. Hafifçe sallanarak 95 °C’de 10 dakika kuluçkaya yaslayın. Filtre ünitesine (10 kDa) 300 μL seyreltilmiş EPS-idrar örneği ve 20 dakika boyunca 14.000 x g’da santrifüj ekleyin. Filtreye 200 μL üre tamponu ekleyin ve 15 dakika boyunca 14.000 x g’da santrifüj ekleyin. Bu adımı yineleyin ve akışa atın. 25 dakika boyunca 6.000 x g’da 50 μL IAA çözeltisi ve santrifüj ekleyin. 200 dakika boyunca 14.000 x g’da 200 μL üre tamponu ve santrifüj ekleyin. Bu adımı yineleyin ve akışa atın. 200 μL 50 mM trietilamonyum bikarbonat tampon (TEAB) ve 20 dakika boyunca 14.000 x g’da santrifüj ekleyin. Bu adımı yineleyin. Filtre ünitesini yeni bir toplama tüpüne aktarın. 60 μL 50 mM TEAB tampon ve 200 ng tripsin ekleyin ve numuneyi bir gecede 37 °C’de bir termo-karıştırıcıda kuluçkaya yatırın.NOT: Gece kuluçka sırasında numune buharlaşmasını önlemek için, her filtre ünitesini bir alüminyum folyo tabakası ve ardından bir parafilm tabakası ile sarın. Tripsin inkübasyonundan sonra, 140 μL su ekleyin ve hazne hacmini (180-200 μL) toplamak için şişeyi 25 dakika boyunca 14.000 x g’da santrifüjleyin. 5. SCX saflaştırması için reaktif hazırlığı Aşağıdaki gibi 1 mL yıkama 1 (%0,5 formik asit (FA) ve asetonitril (ACN)) hazırlayın: 750 μL HLPC suya FA’nın 50 μL’sini ve 0 ACN’nin 200 μL’sini ekleyin. Her numune için 100 μL yıkama 1 gereklidir. 1,5 mL yıkama 2 (%0,5 FA ve ACN) hazırlayın: 225 μL HPLC suya FA 75 μL ve 0 ACN’nin 1,2 mL’sini ekleyin. Her numune için 190 μL yıkama 2 gereklidir. 100 μL eluting çözeltisi (500 mM amonyum asetat (AA) ve ACN’nin% 20’si hazırlayın: 25 μL 2 M AA ve 20 μL% 100 ACN ila 55 μL HPLC suyu ekleyin. Sahne İpuçlarını aşağıdaki gibi hazırlayın. 200 μL pipet ucunu künt uçlu bir şırınga iğnesi (gösterge 16) kullanarak scx reçine tabakası ile paketleyin. StageTip’i, mikrokolumu yerleştirmek için daha önce delinmiş bir mikrosantrifüj kapağına yerleştirin. Kapağı, orijinal kapağın çıkarıldığı 2 mL’lik bir mikrosantrifüje monte edin. Yeni monte edilen mikro SPE santrifüj cihazı tezgah üstü santrifüje sığmalıdır. Delikli kapakların hazırlanması sıkıcı olduğundan, birden fazla kez kullanılabilirler. 6. SCX saflaştırma Yıkama 2 kullanarak her numunenin 30 μL’sini 120 μL’ye seyreltin. Ekstraksiyon reçinesinin üzerine 50 μL yıkama 1 ekleyerek StageTip’i şart koşun ve 2 dakika boyunca 400 x g’da santrifüj yapın. Akış direnci, ekstraksiyon reçinesinin pipet ucuna ne kadar güçlü bir şekilde paketlediğine bağlı olduğundan, 20-30 μL / dk akış hızı elde etmek için santrifüj hızının ayarlanması gerekebilir. Numune yükleme ve yıkama sırasında ucu kuru bırakmamaya çalışın. StageTip’i 50 μL yıkama 2 ve santrifüj 400 x g’da 2 dakika boyunca aşındırın. Seyreltilmiş numuneyi (120 μL) daha düşük bir dönüş hızı kullanarak yükleyin. StageTip’i 50 μL yıkama 2 ve santrifüj ile 400 x g’da 2 dakika yıkayın. 50 μL yıkama 1 ile tekrarlayın.NOT: Bu yıkamadan sonra reçine tamamen kuru olmalıdır. 7 μL elüat çözeltisi (500 mM amonyum asetat (AA) ve ACN’nin% 20’si) ile elute peptit karışımı yavaşça daha düşük bir dönüş hızı kullanarak. AA’yı seyreltmek ve LC-MS/MS ön enjeksiyonu için bir örnek elde etmek için 27 μL% 0.1 FA ekleyin. 34 μL’ye son seyreltme, idrar ve peptit çözeltisi arasında 1:1 hacimsel bir orana neden olacaktır (1 μL saflaştırılmış sindirim, 1 μL orijinal idrar örneğine karşılık gelecektir). 7. DDA analizi kullanılarak dış standarda göre protein nicelemesi (Şekil 2) Elde edilen peptit sindirmenin 2 μL’lik kısmını LC-MS/MS’e enjekte ederek ve elde edilen toplam peptit alanını aşağıdaki gibi oluşturulmuş bir kalibrasyon eğrisiyle enterpolasyonlayarak numunelerdeki protein miktarını belirleyin: HeLa sindirme stoğu (100 μg/μL) kullanarak beş farklı HeLa sindirme çözeltisi (1 ng/μL, 2,5 ng/μL, 7,5 ng/μL, 75 ng/μL) hazırlayın. Her Hela çözeltisi içine yinelenen (2 μL) enjekte edin. LC-MS/MS yöntemini ayarlayın. Beş HeLa peptit karışımından 2 μL enjekte edin ve peptitleri 3 μm C18 silika parçacıkları ile dolu 15 cm, 75 μm i.d sütun üzerinde 230 nL / dakika akış hızında 75 dakikalık doğrusal bir degradeden geçirin. Mobil faz A (%0,1 FA, %2 ACN) ve mobil B aşaması (%0,1 FA ve ACN) tarafından oluşturulmuş ikili gradyan kullanın. Mobil faz B içeriğini 60 dakikada %6’dan ‘ye, ek 8 dakikada ‘den 0’e yükselterek degrade emisyon gerçekleştirin. 5 dakika boyunca 0 B’yi koruyun ve iki dakika içinde %0 B’ye geri dönün. En iyi 12 yöntemini kullanarak DDA modunda çalıştırın ve MS tam tarama aralığını 350-1800 m/z,çözünürlük 70.000, ACG hedef 1e6 ve maksimum enjeksiyon süresi 50 ms olarak ayarlayın. Öncü iyon yalıtımı için kütle penceresini 1,6 m/z, çözünürlük 35.000, ACG hedefi 1e5, maksimum enjeksiyon süresi 120 ms, HCD parçalanması 25 NCE (normalleştirilmiş çarpışma enerjisi) ve dinamik dışlama 15 saniye olarak ayarlayın. Arama motoru olarak Sequest ve veritabanı olarak HUMAN Uniprot Complete protein dizisini kullanarak ham dosyaları analiz edin. Burada sunulan deneylerde, veritabanı Mart 2016’da indirildi ve 42.013 dizi içeriyordu. Aşağıdaki ayarları kullanın: MS toleransı 15 ppm, MS/MS toleransı 0.02 Da, iki kaçırılan bölünme bölgesi ayarlayarak enzim olarak tripsin. Lizin, serine, threonine, tirozin (+57.021) ve metiyoninlerin oksidasyonunun dinamik modifikasyonlar ve sisteinlerin karbamidometilasyonu (+57.021) karbamidometilasyonunu statik değişiklikler olarak ayarlayın. Peptitler ve proteinlerin 0,01’e tanımlanması için yanlış keşif oranının (FDR) kesilmesini kullanın ve perkolatör tarafından filtreleyin. Tüm MS1 peptit sinyalleri için tepe alanını hesaplayın. Peptitlerin toplam alanını hesaplayın. HeLa örnekleri için kullanılan aynı LC-MS/MS yöntemini kullanarak EPS-idrar örneklerinden elde edilen 2 μL peptit karışımlarını enjekte edin ve HeLa veri işleme için kullanılan parametreleri kullanarak ham dosyayı analiz edin. Tanımlanan tüm peptitlerin alan değerlerini özetleyerek peptit sinyallerinin toplam yoğunluğunu hesaplayın ve dış standart eğriyi enterpolasyonlayın. Bu, EPS-idrar proteini sindirmesinde bulunan peptit miktarının kabul edilebilir bir tahminini sağlayacaktır. 8. C18 StageTip protokolü için reaktif hazırlığı 500 μL çözelti A (%0,1 Trifluoroasetik asit (TFA), ACN hazırlayın): 240 μL HPLC suya 0 ACN 250 μL ve %5 TFA’nın 10 μL’sini ekleyin. 2 mL çözelti B (%0,1 TFA) hazırlayın: 1960 μL HPLC suya %5 TFA’nın 40 μL’sini ekleyin. 100 μL eluting çözeltisi hazırlayın (%0,1 FA, ACN): 49 μL HPLC suya FA’nın 1 μL’sini ve 0 ACN’nin 50 μL’sini ekleyin. Sahne İpuçlarını daha önce açıklandığı gibi hazırlayın. Bu durumda, C18 ayıklama diskleri kullanılır. 9. SCX/C18 Aşama İpucu protokolü NOT: Tuzları çıkarmak için EPS-idrar sindirmelerini C18 StageTip protokolü ile arındırin. 2 μg peptitten başlayın (ön enjeksiyonla ölçtülmüş olarak). Yıkama 2 SCX’te sindirme çözeltisini 4 kat seyreltin ve yukarıda açıklandığı gibi devam edin (bölüm “SCX saflaştırma”). Peptit karışımını 7 μL elüat çözeltisi (500 mM amonyum asetat (AA) ve ACN’nin% 20’si) ile yavaşça daha düşük bir dönüş hızı (5 μL / dk akış hızı) kullanarak elute edin. SCX eluatını 3’ten düşük bir pH ve% 5’in altında bir organik çözücü konsantrasyonu elde etmek için trifluoroasetik asidin (TFA)% 0.1’inin 150 μL’si ile asitleştirin. C18 StageTip’i 50 μL çözelti A ve santrifüj 400 x g’da 2 dakika boyunca koşullandırılmıştır. 50 μL çözelti B ve santrifüj ile 2 dakika boyunca 400 x g’da C18 StageTip’i dengeleyin. Numuneyi daha düşük bir dönüş hızı kullanarak sahne ucuna yavaşça yükleyin. C18 StageTip’i 50 μL çözelti B ve santrifüj ile yıkayın. Peptit karışımını daha düşük bir dönüş hızı kullanarak 10 μL elution çözeltisi ile yavaşça elüte edin. Eluat’ı (10 μL) 30 °C’de vakumlu santrifüjde 3 dakika kurutun. 47 μL% 0.1 FA ekleyin. Beklenen peptit konsantrasyonu 40 ng / μL olacaktır. 10. DIA Analizi (Şekil 3) nanoLC ayrımı: Peptit karışımını, 3 μm C18 silika parçacıkları ile dolu 15 cm, 75 μm ID sütununda 230 nL/dk akış hızında 140 dakikalık doğrusal bir gradyan kullanarak ayırın. 230 nL/dakika akış hızında degrade elüasyon gerçekleştirin ve mobil faz B içeriğini 90 dakikada %3’ten ‘e, ardından 30 dakikada ‘ten ‘a ve son olarak 8 dakikada ‘tan 0’e çıkarın. 0 B’de 10 dakika sonra, sütunu 15 dakika boyunca mobil faz A ile aşındırın. Kütle spektrometrik parametreleri: aşağıdaki tarama döngüsünü kullanan bir yöntem kullanarak DIA analizi yapın: (i) 17.500 çözünürlükte tam tarama MS olayı (AGC hedef 1e6, maksimum enjeksiyon süresi 50 ms) ardından (ii) 20 m/z izolasyon genişliğinde 20 pencere, m/z 350’den başlayarak,(ii) 50 m/z izolasyon genişliğinde 5 pencere ve (iv) 200 m/z izolasyon genişliğinde 1 pencere, DIA tarama aralığını 1200 m/z’desona erdirin. DIA taramalarını 35.000 çözünürlükte gerçekleştirin (AGC hedef 5e5, maksimum enjeksiyon süresi 120 ms ve 25 NCE). 11. Kütüphane üretimi için yüksek pH ters faz C18 fraksiyonasyonu NOT: Aşağıdaki prosedürle DIA analizi için veriye bağımlı bir kitaplık oluşturmak için 10 μg’den daha yüksek bir miktarda havuz EPS-idrar temsilcisi örnekleri: Peptit karışımını (11 μg) TFA’nın % 0,2’si kadar asitleştirin ve elde edilen çözeltiyi daha yüksek kapasiteye izin vermek için iki kat ekstraksiyon diski ile dolu bir C18 StageTip’e yükleyin. Tek bir mikro diskin (16 kalibrelik şırınga iğnesinden) yükleme kapasitesinin 5-10 μg aralığında olduğunu tahmin ettik. C18 saflaştırma için daha önce açıklandığı gibi koşul ve denge sabit fazı. Amonyum hidroksitin %0,2’sini içeren elütasyon çözeltileri kullanarak yüksek pH ters faz C18’den adım adım elüsiyon (n=10) ile peptit fraksiyonasyonu yapmak, 10 mM TEAB ve acn v/v konsantrasyonları artan (4%, 8%, 12%, 16%, 20%, 24%, 28%, 32%, 40%, 80%). DIA yönteminin aynı kromatografik parametrelerini kullanarak 10 kesir analiz edin. Ön analiz için daha önce benimsenen ayarları kullanarak kütle spektrometresini DDA modunda çalıştırın (bkz. “DDA analizi kullanılarak harici standarda göre protein nicelemesi”). 12. Veri analizi DIA analizine adanmış bir yazılımda yüksek ters faz C18 fraksiyonasyonunun DDA LC-MS/MS deneylerinden elde edilen protein tanımlama sonuçlarını içe aktararak spektral kütüphaneyi oluşturun. Tanımlama ve niceleme için kullanılan parça iyonlarının minimum ve maksimum sayısını sırasıyla 3 ve 6 olarak ayarlayın. Elde edilen sonuçları 0,01 Q değerine göre filtreleyin. DIA ham dosyalarını içe aktarın ve her ham dosyayla spektral kitaplığı oluşturmak için kullanılan aynı FASTA dosyasını ilişkilendirin. Protein nicelemesi için kullanılan minimum ve maksimum benzersiz peptit sayısını sırasıyla 1 ve 10 olarak ayarlayın. Parça iyon tepe alanını özetleyerek her proteinin yoğunluğunu hesaplayın. Her numunedeki nicel proteinlerin yoğunluğuna sahip bir matris oluşturun.