Perfil proteómico de EPS-Urine a través de la Digestión FASP y análisis independiente de datos

El estudio fue aprobado por el Comité Ético Institucional de la Universidad Magna Graecia de Catanzaro, RP 41/2018. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes inscritos en el estudio. 1. Preparación de muestras Centrífuga muestras de EPS-orina dentro de 2 h de recolección a 2.100 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente (RT). Guarde el sobrenadante a -80 °C hasta su uso. 2. Descongelación de muestras Transfiera la muestra de -80 °C a -20 °C el día anterior a la digestión. Antes del procesamiento de muestras, transfiera la muestra durante 15-20 minutos a 4 °C y luego a RT. 3. Preparación de reactivos para fasp El mismo día, prepare las siguientes soluciones: búfer de urea, iodoacetamida de 50 mM (IAA) en búfer de urea, bicarbonato de trietillammonio de 50 mM y ditiotiotioteitol de 50 mM (TDT). Preparar el buffer de urea (urea 8 M, 100 mM Tris-HCl pH 8): para 10 ml, pesar 4.800 mg de urea y disolverlo en la cantidad adecuada de agua HPLC después de añadir 1 ml de 1 M Tris pH 8. Se necesita un volumen de 800 μL de urea para cada muestra. Preparar 500 mM dithiothreitol (TDT): disolver 38,5 mg de TDT en 500 μL de agua HPLC. Para cada muestra, se necesitan 66,7 μL de TDT. Preparar 50 mM IAA en Urea Buffer: disolver 9,25 mg de AIEA en 1 ml de búfer de urea. Para cada muestra se necesitan 50 μL de AIEA. Preparar bicarbonato de trietillammonio de 50 mM (TEAB). Añadir 150 μL de 1 M TEAB a 2,85 ml de agua HPLC. Para cada muestra se necesitan 460 μL de TEAB. Preparar una solución de trippsina (100 ng/μL) en agua HPLC. Esta solución se puede almacenar a -80 °C y descongelarse inmediatamente antes de su uso. Para cada muestra, se necesitan 2 μL (200 ng). 4. Digestión de proteínas por FASP Diluir 500 μL de cada muestra de EPS-orina con 66,7 μL de sulfato de dodecilo sódico (SDS) del 10% (w/v), 66,7 μL de TDT de 500 mM y 33,3 μL de 1 M Tris pH 8 para solubilizar proteínas y reducir los enlaces de disulfuro. Incubar 10 minutos a 95 °C con suave agitación. Añadir 300 μL de muestra de EPS-orina diluida en la unidad de filtro (10 kDa) y centrífuga a 14.000 x g durante 20 minutos. Añadir 200 μL de búfer de urea al filtro y centrífuga a 14.000 x g durante 15 minutos. Repita este paso y, a continuación, descarte el flujo. Añadir 50 μL de solución y centrífuga del AIEA a 6.000 x g durante 25 minutos. Añadir 200 μL de búfer de urea y centrífuga a 14.000 x g durante 20 minutos. Repita este paso y, a continuación, descarte el flujo. Añadir 200 μL de 50 mM trillalammonium bicarbonato buffer (TEAB) y centrífuga a 14.000 x g durante 20 minutos. Repita este paso. Transfiera la unidad de filtro a un nuevo tubo de recogida. Añadir 60 μL de 50 mM de tampón TEAB y 200 ng de trippsina e incubar la muestra en un termo-mezclador a 37 °C durante la noche.NOTA: Para evitar la evaporación de la muestra durante la incubación nocturna, envuelva cada unidad de filtro con una capa de papel de aluminio y luego una capa de parafilm. Después de la incubación de trypsina, añadir 140 μL de agua y centrifugar el vial a 14.000 x g durante 25 minutos para recoger el volumen de digestión (180-200 μL). 5. Preparación de reactivos para la purificación SCX Preparar 1 ml de lavado 1 (0,5% ácido fórmico (FA) y 20% acetonítrilo (ACN)) de la siguiente manera: añadir 50 μL de 10% FA y 200 μL de 100% ACN a 750 μL de agua HLPC. Para cada muestra, se necesitan 100 μL de lavado 1. Preparar 1,5 ml de lavado 2 (0,5% FA y 80% de ACN) de la siguiente manera: añadir 75 μL del 10 % FA y 1,2 ml de 100% ACN a 225 μL de agua HPLC. Para cada muestra se necesitan 190 μL de lavado 2. Preparar 100 μL de solución de eluting (acetato de amonio de 500 mM (AA) y 20% de ACN): añadir 25 μL de 2 M AA y 20 μL de 100% ACN a 55 μL de agua HPLC. Prepare las sugerencias de etapas de la siguiente manera. Empaquete una punta de pipeta de 200 μL con una capa de resina SCX con una aguja de jeringa de extremo contundente (calibre 16). Inserte la punta de escenario en una tapa de microcentrífuga que haya sido perforada previamente para acomodar la microcolumn. Monte la tapa en una microcentrífuga de 2 ml de la que se extrajo la tapa original. El dispositivo centrífugo micro-SPE que acaba de montarse debe caber en una centrífuga de sobremesa. Dado que las tapas perforadas son tediosas para prepararse, se pueden utilizar varias veces. 6. Purificación SCX Diluir 30 μL de cada muestra a 120 μL usando lavado 2. Condicionar la punta de escenario añadiendo 50 μL de lavado 1 encima de la resina de extracción y centrífuga a 400 x g durante 2 minutos. Dado que la resistencia al flujo depende de la fuerza con la que la resina de extracción se embaló en la punta de la pipeta, es posible que sea necesario ajustar la velocidad de la centrífuga para obtener un caudal de 20-30 μL/min. Trate de no dejar la punta seca durante la carga y el lavado de la muestra. Equilibrar la punta de escenario con 50 μL de lavado 2 y centrífuga a 400 x g durante 2 minutos. Cargue la muestra diluida (120 μL) utilizando una velocidad de giro más baja. Lave la punta de escenario con 50 μL de lavado 2 y centrífuga a 400 x g durante 2 minutos. Repita con 50 μL de lavado 1.NOTA: Después de este lavado la resina debe estar completamente seca. Mezcla de péptido eluto con 7 μL de solución de eluato (acetato de amonio de 500 mM (AA) y 20% de ACN) utilizando lentamente una velocidad de giro más baja. Añadir 27 μL de 0.1% FA para diluir AA y obtener una muestra para la inyección preliminar de LC-MS/MS. La dilución final a 34 μL dará lugar a una relación volumétrica de 1:1 entre la orina y la solución de péptido (1 μL de digestión purificada corresponderá a 1 μL de muestra de orina original). 7. Cuantificación de proteínas por norma externa mediante análisis DDA (Figura 2) Determine la cantidad de proteínas en las muestras inyectando 2 μL del resumen de péptidos resultante en LC-MS/MS e interpolando el área total resultante del péptido con una curva de calibración construida de la siguiente manera: Preparar cinco soluciones de resumen HeLa diferentes (1 ng/μL, 2,5 ng/μL, 7,5 ng/μL, 25 ng/μL, 75 ng/μL) utilizando un caldo de resumen HeLa (100 μg/μL). Inyecte cada solución de Hela en duplicado (2 μL). Establezca el método LC-MS/MS. Inyecte 2 μL de las cinco mezclas de péptidos HeLa y separe péptidos a través de un gradiente lineal de 75 minutos a un caudal de 230 nL/minuto en una columna i.d de 15 cm y 75 μm llena de partículas de sílice C18 de 3 μm. Utilice un degradado binario constituido por la fase móvil A (0,1% FA, 2% ACN) y la fase móvil B (0,1% FA y 80% de ACN). Realice la elución de gradiente aumentando el contenido de fase B móvil del 6% al 42% en 60 minutos y del 42% al 100% en 8 minutos adicionales. Mantenga durante 5 minutos 100% B y luego vuelva al 0% B en dos minutos. Opere en modo DDA utilizando un método top-12 y establezca el rango de escaneo completo de EM en 350-1800 m/z,resolución 70.000, objetivo ACG 1e6 y tiempo máximo de inyección de 50 ms. Ajuste la ventana de masa para el aislamiento de iones precursores en 1,6 m/z,resolución 35.000, objetivo ACG 1e5, tiempo máximo de inyección 120 ms, fragmentación de HCD a partir de 25 NCE (energía de colisión normalizada) y exclusión dinámica 15 segundos. Analice los archivos sin procesar utilizando Sequest como motor de búsqueda y la secuencia de proteínas COMPLETA HUMAN Uniprot como base de datos. En los experimentos presentados aquí, la base de datos se descargó en marzo de 2016 y contenía 42.013 secuencias. Utilice los siguientes ajustes: Tolerancia MS 15 ppm, TOLERANCIA MS/MS 0.02 Da, trypsin como enzima estableciendo dos sitios de escote perdidos. Establecer la carbamidometilación de lisina, serina, trionina, tirosina (+57.021) y la oxidación de las metioninas como modificaciones dinámicas y la carbamidometilación de cisteínas (+57.021) como modificaciones estáticas. Utilice el corte de la tasa de descubrimiento falso (FDR) para la identificación de péptidos y proteínas a 0,01 y filtrar por percolador. Calcule el área pico para todas las señales de péptido MS1. Calcule el área total de los péptidos. Inyecte 2 μL de mezclas de péptidos obtenidas de muestras de EPS-orina utilizando el mismo método LC-MS/MS utilizado para las muestras de HeLa y analice el archivo sin procesar utilizando los mismos parámetros utilizados para el procesamiento de datos HeLa. Calcule la intensidad total de las señales de péptido resumiendo los valores de área de todos los péptidos identificados e interpolando la curva estándar externa. Esto proporcionará una estimación aceptable de la cantidad de péptidos presentes en el resumen de proteínas EPS-orina. 8. Preparación de reactivos para el protocolo C18 StageTip Preparar 500 μL de la solución A (0,1% ácido trifluoroacético (TFA), 50% ACN): añadir 250 μL de 100% ACN y 10 μL de 5% de TFA a 240 μL de agua HPLC. Preparar 2 ml de solución B (0,1 % TFA): añadir 40 μL de 5% de TFA a 1960 μL de agua HPLC. Preparar 100 μL de solución de eluting (0,1% FA, 50% ACN): añadir 1 μL del 10% FA y 50 μL del 100% ACN a 49 μL de agua HPLC. Prepare las sugerencias de etapas como se describió anteriormente. En este caso, se utilizan discos de extracción C18. 9. Protocolo de la punta de escenario SCX/C18 NOTA: Purifique los resúmenes eps-orina mediante el protocolo C18 StageTip para eliminar las sales. A partir de 2 μg de péptidos (cuantificados por la inyección preliminar). Diluir la solución de digestión 4 veces en lavado 2 SCX y proceder como se describió anteriormente (en la sección “Purificación SCX”). Elute la mezcla de péptidos con 7 μL de solución de eluato (acetato de amonio de 500 mM (AA) y 20% de ACN) utilizando lentamente una velocidad de giro más baja (caudal de 5 μL/min). Acidificar el eluato SCX con 150 μL del 0,1% del ácido trifluoroacético (TFA) para lograr un pH inferior a 3 y una concentración de disolvente orgánico por debajo del 5%. Condiciona la punta de escenario C18 con 50 μL de solución A y centrífuga a 400 x g durante 2 minutos. Equilibrio C18 StageTip con 50 μL de solución B y centrífuga a 400 x g durante 2 minutos. Cargue la muestra en la punta del escenario lentamente utilizando una velocidad de giro más baja. Lave la punta de escenario C18 con 50 μL de solución B y centrífuga. Elicuente lentamente la mezcla de péptidos con 10 μL de solución de elución utilizando una velocidad de giro más baja. Seque el eluato (10 μL) a 30 °C en una centrífuga de vacío durante 3 minutos. Añadir 47 μL de 0.1% FA. La concentración esperada de péptidos será de 40 ng/ μL. Analizar por LC-MS/MS en modo DIA. 10. Análisis DIA (Figura 3) separación de nanoLC: Separe la mezcla de péptidos utilizando un gradiente lineal de 140 minutos a un caudal de 230 nL/min en una columna de identificación de 15 cm y 75 μm llena de partículas de sílice C18 de 3 μm. Realice la elución de gradiente a un caudal de 230 nL/minuto y aumente el contenido de fase B móvil del 3% al 25% en 90 minutos, luego del 25% al 40% en 30 minutos y finalmente del 40% al 100% en 8 minutos. Después de 10 minutos al 100% B, equilibra la columna con la fase móvil A durante 15 min. Parámetros espectrométricos de masa: realizar análisis DIA utilizando un método que emplea el siguiente ciclo de escaneo: (i) un evento ms de análisis completo a una resolución de 17.500 (objetivo 1e6 de AGC, tiempo máximo de inyección 50 ms) seguido de (ii) 20 ventanas a 20 m/z de ancho de aislamiento, a partir de m/z 350, (ii) 5 ventanas a 50 m/z de ancho de aislamiento y (iv) 1 ventana a 200 m/z de ancho de aislamiento, terminando el rango de escaneo de DIA a 1200 m/z. Realice exploraciones DIA a la resolución 35.000 (objetivo 5e5 de AGC, tiempo máximo de inyección 120 ms y 25 NCE). 11. Fraccionamiento de fase C18 invertido de alto pH para la generación de bibliotecas NOTA: Pool EPS-urine muestras representativas en una cantidad superior a 10 μg con el fin de construir una biblioteca dependiente de datos para el análisis DIA mediante el siguiente procedimiento: Acidifique la mezcla de péptidos (11 μg) en un 0,2% de TFA y cargue la solución resultante en una punta de escenario C18 repleta de dos capas de discos de extracción para permitir una mayor capacidad. Estimamos que la capacidad de carga de un solo micro disco (a partir de una aguja de jeringa de calibre 16) estaba en el rango de 5-10 μg. Condición y equilibrio de la fase estacionaria como ya se ha descrito para la purificación C18. Llevar a cabo el fraccionamiento de péptidos por elución escalonada (n=10) desde la fase alta de pH invertido C18 utilizando soluciones de elución que contengan el 0,2% del hidróxido de amonio, TEAB de 10 mM y concentraciones crecientes de V/v de ACN (4%, 8%, 12%, 16%, 20%, 24%, 28%, 32%, 40%, 80%). Analice las 10 fracciones utilizando los mismos parámetros cromatográficos del método DIA. Utilice el espectrómetro de masas en modo DDA utilizando los ajustes adoptados anteriormente para el análisis preliminar (consulte “Cuantificación de proteínas por norma externa mediante el análisis DDA”). 12. Análisis de datos Genere la biblioteca espectral importando los resultados de identificación de proteínas obtenidos de los experimentos DDA LC-MS/MS de fraccionamiento C18 de fase alta invertida en un software dedicado al análisis DIA. Establezca el número mínimo y máximo de iones de fragmento utilizados para la identificación y cuantificación en 3 y 6, respectivamente. Filtre los resultados obtenidos por un valor Q de 0,01. Importe los archivos sin procesar DIA y asocie a cada archivo sin procesar el mismo archivo FASTA utilizado para crear la biblioteca espectral. Establezca el número mínimo y máximo de péptidos únicos utilizados para la cuantificación de proteínas en 1 y 10, respectivamente. Calcule la intensidad de cada proteína sumando el área pico de iones de fragmento. Generar una matriz con la intensidad de las proteínas cuantificadas en cada muestra.