Протеомный профиль EPS-Urine через FASP пищеварение и независимый анализ данных

Исследование было одобрено Институциональным этическим комитетом Университета Магна Граесия в Катансаро, RP 41/2018. Письменное информированное согласие было получено от всех пациентов, зачисленных в исследование. 1. Пример подготовки Центрифуга EPS-мочи в пределах 2 ч сбора при 2100 х г в течение 10 минут при комнатной температуре (RT). Храните супернатант при -80 градусов по Цельсию до его использования. 2. Образец оттаивания Перенесите образец с -80 градусов по Цельсию на -20 градусов по Цельсию за день до пищеварения. Перед обработкой проб перенесите образец на 15-20 минут при 4 градусов по Цельсию, а затем на RT. 3. Подготовка реагентов к FASP В тот же день приготовьте следующие решения: буфер мочевины, 50 мМ иодоацетамида (IAA) в буфере мочевины, 50 мм триэтиламмония бикарбоната и 500 мМ дитиотрейтол (DTT). Подготовка буфера мочевины (мочевина 8 M, 100 мМ Tris-HCl pH 8): для 10 мл, вес 4800 мг мочевины и растворить его в соответствующем количестве воды HPLC после добавления 1 мл 1 M Tris pH 8. Для каждого образца требуется объем в 800 мкл мочевины. Приготовьте 500 мМ дитиотрейтол (DTT): растворите 38,5 мг ДЛТ в 500 мкл воды HPLC. Для каждого образца требуется 66,7 МКЛ ДЛТ. Подготовка 50 мММ IAA в буфере мочевины: растворить 9,25 мг IAA в 1 мл буфера мочевины. Для каждого образца требуется 50 МКЛ IAA. Подготовка 50 мМ триэтиламмония бикарбоната (TEAB). Добавьте 150 л 1 M TEAB к 2,85 мл воды HPLC. Для каждого образца требуется 460 МКЛ TEAB. Подготовь решение трипсина (100 нг/Л) в воде HPLC. Это решение можно хранить при -80 градусов по Цельсию и оттаивать непосредственно перед использованием. Для каждого образца требуется 2 йл (200 нг). 4. Переваривание белка ФАСП Разбавить 500 л каждого образца EPS-мочи с 66,7 л 10% (w/v) додекилового сульфата натрия (SDS), 66,7 л 500 мМ ДЛ и 33,3 л 1 M Tris pH 8 для раствора белков и уменьшения дисульфидных связей. Инкубировать 10 минут при 95 градусов по Цельсию с нежной тряской. Добавьте 300 МКЛ разбавленного образца ЭПС-мочи на блок фильтра (10 кДа) и центрифугу при 14 000 х г в течение 20 минут. Добавьте 200 мкл буфера мочевины к фильтру и центрифуге при 14 000 х г в течение 15 минут. Повторите этот шаг, а затем отбросьте поток через. Добавьте 50 мкл раствора IAA и центрифуги при 6000 х г в течение 25 минут. Добавьте 200 МКЛ буфера мочевины и центрифуги при 14 000 х г в течение 20 минут. Повторите этот шаг, а затем отбросьте поток через. Добавьте 200 мкл буфера триэтиламмония триэтиламмония (TEAB) и центрифугу при 14 000 х г в течение 20 минут. Повторите этот шаг. Перенесите блок фильтра в новую трубку коллекции. Добавьте 60 мкл буфера 50 мМ TEAB и 200 нг трипсина и инкубировать образец в термомешере при 37 градусах Цельсия за ночь.ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать испарения образца во время ночной инкубации, оберните каждый фильтр единицы с слоем алюминиевой фольги, а затем слой парафильма. После инкубации трипсина добавьте 140 мл воды и центрифуг в флаконе на 14 000 х г в течение 25 минут, чтобы собрать объем дайджеста (180-200 МКЛ). 5. Реагент подготовка к очистке SCX Подготовка 1 мл мытья 1 (0,5% фамической кислоты (FA) и 20% ацетонитрила (ACN)) следующим образом: добавить 50 йл 10% FA и 200 йл 100% ACN до 750 йл воды HLPC. Для каждого образца, 100 йл мыть 1 необходимы. Подготовка 1,5 мл мытья 2 (0,5% FA и 80% ACN) следующим образом: добавить 75 л 10% FA и 1,2 мл 100% ACN до 225 л воды HPLC. Для каждого образца требуется 190 МКЛ мытья 2. Подготовь 100 л раствора элутирования (ацетат аммония мММ (АА) и 20% ACN): добавьте 25 л 2 М АА и 20 л 100% ACN до 55 л воды HPLC. Подготовка StageTips следующим образом. Упакуйте наконечник пипетки из 200 йл слоем смолы SCX с помощью тупой иглы шприца (калибр 16). Вставьте StageTip в крышку микроцентрифуга, которая ранее была проколота для размещения микроколумна. Соберите крышку на микроцентрифуг 2 мл, из которого была удалена оригинальная крышка. Только что собранное устройство для центробежки micro-SPE должно поместиться в центрифугу скамейки. Так как перфорированные крышки утомительно готовить, они могут быть использованы несколько раз. 6. Очистка SCX Разбавить 30 йл каждого образца до 120 йл с помощью мытья 2. Состояние StageTip, добавив 50 йл мыть 1 на вершине смолы и центрифуги на 400 х г в течение 2 минут. Поскольку устойчивость потока зависит от того, насколько сильно смола извлечения была упакована в кончик пипетки, скорость центрифуги, возможно, потребуется скорректировать, чтобы получить скорость потока 20-30 йл/мин. Старайтесь не оставлять кончик сухим во время загрузки и мытья образца. Эквилибруата StageTip с 50 йл мыть 2 и центрифуги на 400 х г в течение 2 минут. Загрузите разбавленный образец (120 йл) с использованием более низкой скорости вращения. Вымойте StageTip с 50 йл мыть 2 и центрифуги на 400 х г в течение 2 минут. Повторите с 50 йл мытья 1.ПРИМЕЧАНИЕ: После этой стирки смола должна быть полностью сухой. Elute пептидная смесь с 7 йл раствора элуата (500 мМ аммония ацетата (АА) и 20% ACN) медленно, используя более низкую скорость спина. Добавьте 27 л 0,1% FA, чтобы разбавить АА и получить образец для предварительной инъекции LC-MS/MS. Окончательное разбавление до 34 МКЛ приведет к соотношению объема между мочой и пептидным раствором 1 МКЛ очищенного дайджеста, что соответствует 1 МКЛ исходного образца мочи). 7. Белковая количественная оценка по внешнему стандарту с использованием анализа DDA(рисунок 2) Определите количество белка в образцах путем введения 2 л полученного пептидного дайджеста в LC-MS/MS и интерполируя полученную общую пептидную область с кривой калибровки, построенной следующим образом: Подготовь пять различных растворов для переваривания HeLa (1 нг/йл, 2,5 нг/йл, 7,5 нг/йл, 25 нг/ДЛ, 75 нг/йл) с использованием дайджестного запаса HeLa (100 мкг/ОЛ). Ввись каждый раствор Hela в дубликат (2 йл). Установите метод LC-MS/MS. Введите 2 МКЛ из пяти пептидных смесей HeLa и отдельных пептидов через линейный градиент 75 минут со скоростью потока 230 нл/минута на 15 см, 75 мкм колонки, упакованной с 3 мкм C18 частиц кремнезема. Используйте бинарный градиент, образовавшийся в мобильной фазе А (0,1% FA, 2% ACN) и мобильной фазе B (0,1% FA и 80% ACN). Выполняем градиент elution, увеличивая содержание мобильной фазы B с 6% до 42% за 60 минут и с 42% до 100% за дополнительные 8 минут. Поддерживайте в течение 5 минут 100% B, а затем вернуться к 0% B в течение двух минут. Работайте в режиме DDA по методу топ-12 и установите полный диапазон сканирования MS на уровне 350-1800 м/з,разрешение 70 000, цель ACG 1e6 и максимальное время впрыска 50 мс. Установите массовое окно для изоляции ионов прекурсоров на уровне 1,6 м/з,разрешение 35 000, цель ACG 1e5, максимальное время впрыска 120 мс, фрагментация HCD при 25 NCE (нормализованная энергия столкновения) и динамическое исключение 15 секунд. Анализ необработанных файлов с помощью Sequest в качестве поисковой системы, и HUMAN Uniprot Полная последовательность белка в качестве базы данных. В экспериментах, представленных здесь, база данных была загружена в марте 2016 года и содержала 42.013 последовательностей. Используйте следующие настройки: MS толерантность 15 промилле, MS / MS толерантность 0,02 Da, трипсин в качестве фермента, установив два пропущенных сайтов расщепления. В качестве статических модификаций установите карбамидометилирование лизина, серина, трионина, тирозина (57,021 евро) и окисление метионинов в качестве динамических модификаций и карбамидометилирования цистесинов ( 57,021 евро). Используйте отключку ложной скорости обнаружения (FDR) для идентификации пептидов и белков до 0,01 и отфильтруемой перколатором. Рассчитайте пиковую область для всех пептидных сигналов MS1. Рассчитайте общую площадь пептидов. Введите 2 л пептидных смесей, полученных из образцов EPS-мочи, используя тот же метод LC-MS/MS, используемый для образцов HeLa, и проанализируйте необработанный файл, используя те же параметры, что и для обработки данных HeLa. Рассчитать общую интенсивность пептидных сигналов, подводя итоги площади всех выявленных пептидов и интерполировать внешнюю стандартную кривую. Это обеспечит приемлемую оценку количества пептида, присутствуют в дайджесте белка EPS-мочи. 8. Подготовка реагентов к протоколу C18 StageTip Подготовь 500 л раствора А (0,1% трифтороацептной кислоты (TFA), 50% ACN): добавьте 250 л 100% ACN и 10 МКЛ 5% TFA до 240 л воды HPLC. Подготовка 2 мл раствора B (0,1% TFA): добавить 40 л 5% TFA до 1960 л воды HPLC. Подготовь 100 л раствора элутирования (0,1% FA, 50% ACN): добавьте 1 МЛ 10% FA и 50 МКЛ 100% ACN до 49 л воды HPLC. Подготовьтесь к StageTips, как описано ранее. В этом случае используются диски извлечения C18. 9. Протокол SCX/C18 StageTip ПРИМЕЧАНИЕ: Очистить EPS-моча дайджесты C18 StageTip протокол для удаления солей. Начните с 2 мкг пептидов (как количественно предварительной инъекции). Разбавить раствор дайджеста 4 раза в мытье 2 SCX и продолжить, как описано выше (в разделе “SCX очистки”). Elute пептидная смесь с 7 МКЛ раствора элуата (500 мМ ацетата аммония (АА) и 20% ACN) медленно, используя более низкую скорость вращения (5 йл/мин скорость потока). Кислота SCX eluate с 150 йл 0,1% трифтороацептической кислоты (TFA) для достижения рН ниже 3 и концентрации органического растворителя ниже 5%. Состояние C18 StageTip с 50 йл раствора А и центрифуги на 400 х г в течение 2 минут. Эквилибрировать C18 StageTip с 50 мл раствора B и центрифуги при 400 x g в течение 2 минут. Загрузите образец на кончике сцены медленно, используя более низкую скорость вращения. Вымойте C18 StageTip с 50 йл раствора B и центрифуги. Медленно elute пептидной смеси с 10 йл раствора элюции с использованием более низкой скорости спина. Высушите элуат (10 МКЛ) при 30 градусах Цельсия в вакуумной центрифуге в течение 3 минут. Добавьте 47 л 0,1% FA. Ожидаемая концентрация пептида будет 40 нг/л. Анализ LC-MS/MS в режиме DIA. 10. Анализ DIA(рисунок 3) nanoLC разделение: Отделить пептидную смесь с помощью линейного градиента 140 минут при скорости потока 230 нл/мин на 15 см, 75 мкм ID колонки упакованы с 3 мкм C18 частиц кремнезема. Выполните градиент elution на скорости 230 nL/minute потока и увеличьте содержание мобильной фазы B с 3% до 25% за 90 минут, затем с 25% до 40% за 30 минут и, наконец, с 40% до 100% за 8 минут. Через 10 минут при 100% B, уравночные столбец с мобильной фазы А в течение 15 минут. Масс-спектрометрические параметры: выполнить анализ DIA с помощью метода, используя следующий цикл сканирования: i) полное сканирование MS событие с разрешением 17500 (цель AGC 1e6, максимальное время впрыска 50 мс) с последующим (ii) 20 окнами шириной 20 м/z, начиная с м/z 350, (ii) 5 окон при ширине изоляции 50 м/z и (iv) 1 окна на ширине изоляции 200 м/z, заканчивая диапазон сканирования DIA на 1200 м/z. Выполните сканирование DIA с разрешением 35 000 (цель AGC 5e5, максимальное время инъекции 120 мс и 25 NCE). 11. Высокий рН отменил фракционирование фазы C18 для генерации библиотек ПРИМЕЧАНИЕ: Бассейн EPS-мочи репрезентативных образцов в количестве выше 10 мкг для того, чтобы построить зависящие от данных библиотеки для анализа DIA по следующей процедуре: Подкисляйте пептидную смесь (11 мкг) на 0,2% от TFA и загружайте полученное раствор на C18 StageTip, упакованный с двумя слоями дисков экстракции, чтобы обеспечить более высокую емкость. Мы оценили грузоподъемность одного микро-диска (от иглы шприца 16 калибра) в диапазоне 5-10 мкг. Состояние и равноуливная стационарная фаза, как уже описано для очистки C18. Проведение пептидной фракционности поэтапной элюцией (n’10) от высокой рН обратной фазы C18 с использованием элюционных растворов, содержащих 0,2% гидроксида аммония, 10 мМ ГТЭБ, и увеличение концентраций в/в ACN (4%, 8%, 12%, 16%, 20%, 24%, 28%, 32%, 40%, 80%). Проанализируйте 10 фракций с использованием тех же хроматографических параметров метода DIA. Работайте масс-спектрометр в режиме DDA с использованием параметров, ранее принятых для предварительного анализа (см. “Белковая квантификация по внешнему стандарту с использованием анализа DDA”). 12. Анализ данных Создать спектральную библиотеку путем импорта результатов идентификации белка, полученных в результате экспериментов DDA LC-MS/MS высокоотвернёной фракционации фазы C18 в программном обеспечении, посвященном анализу DIA. Установите минимальное и максимальное количество ионов фрагментов, используемых для идентификации и количественной оценки, до 3 и 6, соответственно. Фильтр полученных результатов по цене 0,01 евро. Импортируют необработанные файлы DIA и связывают с каждым необработанным файлом один и тот же файл FASTA, используемый для создания спектральной библиотеки. Установите минимальное и максимальное количество уникальных пептидов, используемых для количественной оценки белка, до 1 и 10, соответственно. Рассчитайте интенсивность для каждого белка, подводя итоги фрагмента ионные пиковые области. Создать матрицу с интенсивностью количественных белков в каждом образце.