FASP消化とデータ非依存分析によるEPS-尿のプロテオミクスプロファイル

この研究は、マグナ・グレシア大学カタンツァーロ大学の制度倫理委員会(RP 41/2018)によって承認されました。書面によるインフォームド・コンセントは、研究に登録されたすべての患者から得られた。 1. サンプル準備 遠心分離機EPS尿サンプルは、2,100 x g で2時間の回収で、室温(RT)で10分間採取した。上清は使用するまで-80°Cで保管してください。 2. サンプルの解凍 サンプルを-80°Cから-20°Cに、消化の前日に移します。 サンプル処理の前に、サンプルを4°Cで15~20分間、RTで転送します。 3. FASP用試薬の準備 同日、尿素バッファー、50 mM ヨードロセトアセトアミド(IAA)、50 mMトリエチルランモニウム重炭酸塩、500 mMジチオスライトール(DTT)の溶液を準備します。 尿素バッファー(尿素8 M、100 mM Tris-HCl pH 8):10mLの場合、尿素の4,800mgの重量を量り、1 MトリスpH8の1mLを添加した後、適切な量のHPLC水に溶解します。各サンプルに800 μLの尿素が必要です。 500 mM ジチオトレイトール (DTT): 38.5 mg の DTT を 500 μL の HPLC 水に溶解します。各サンプルに対して、66.7 μL の DTT が必要です。 尿素バッファーに50 mM IAAを調製:尿素バッファーの1 mLにIAAの9.25 mgを溶解します。各サンプルに対して、IAAの50 μLが必要です。 50 mM トリエチルランモニウム重炭酸 (TEAB) を準備します。1 M TEABの150 μLを2.85 mLのHPLC水に加えます。各サンプルに460 μLのTEABが必要です。 HPLC水中のトリプシン(100 ng/μL)の溶液を調製します。この溶液は-80°Cで保存し、使用前にすぐに解凍することができます。各サンプルに対して、2 μL (200 ng) が必要です。 4. FASPによるタンパク質消化 各EPS尿サンプルの500μLを10%(w/v)のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、66.7 μLの500mM DTT、33.3 μLの1 M Tris pH 8で希釈してタンパク質を溶解し、ジスルフィド結合を減少させます。95°Cで10分間、穏やかな揺れをしてインキュベートします。 フィルターユニット(10 kDa)に300μLの希釈EPS尿サンプルを加え、遠心分離機を14,000 x g で20分間加えます。 200 μL の尿素バッファーをフィルターに加え、遠心分離機を 14,000 x g で 15 分間追加します。この手順を繰り返し、フロースルーを破棄します。 IAA溶液50μL、6,000 x g で25分間遠心分離機を加えます。 20分間、尿素バッファーと遠心分離機を14,000 x g で200 μL加えます。この手順を繰り返し、フロースルーを破棄します。 50 mM のトリエチルランモニウムのバッファー (TEAB) と遠心分離機を 14,000 x g で 20 分間加えます。この手順を繰り返します。 フィルターユニットを新しいコレクションチューブに移します。 50 mM TEAB バッファーの 60 μL と 200 ng のトリプシンを加え、一晩で 37 °C のサーモミキサーでサンプルをインキュベートします。注:一晩のインキュベーション中にサンプルの蒸発を避けるために、各フィルタユニットをアルミニウム箔の層でラップし、次にパラフィルムの層をラップします。 トリプシンインキュベーションの後、140 μLの水と遠心分離機を14,000 x gで25分間加えて、消化量(180~200 μL)を収集します。 5. SCX精製のための試薬の準備 1 mL の洗浄 1 (0.5% ギ酸 (FA) および 20% アセトニトリル (ACN)) を次のように準備します: 10% FA の 50 μL と 100% ACN の 200 μL を HLPC 水の 750 μL に加えます。各サンプルに対して、100 μLの洗浄 1 が必要です。 1.5 mLの洗浄2(0.5およびACNの80%)を、10の75 μL、100Nの1.2 mLを加えて225μLのHPLC水を225μLにします。各サンプル190 μLの洗浄2が必要です。 溶出液(500 mM酢酸アンモニウム(AA)とACNの20%)100μLを調製:2MAAの25μLと100%のACNの20μLを加えて55μLのHPLC水に加えます。 次のようにステージヒントを準備します。 鈍い終わりのスポイト針(ゲージ16)を使用して、SCX樹脂の層と200 μLピペットチップをパックします。マイクロコラムを収容するために、以前にピアスされたマイクロ遠心蓋に StageTip を挿入します。 元の蓋を取り外した2 mLマイクロ遠心分離機に蓋を組み立てます。組み立てたばかりのマイクロSPE遠心装置は、ベンチトップ遠心分離機に収まる必要があります。穿穿蓋は準備に面倒なので、複数回利用することができます。 6. SCX精製 洗浄2を使用して、各サンプルの30 μLを120 μLに希釈します。 抽出樹脂の上に50μLの洗浄1を加え、遠心分離機を400xgで2分間加えて、ステージチップを調整します。流れ抵抗は抽出樹脂がピペットチップにどれだけ強く詰め込まれたかによって決まるので、20-30 μL/minの流量を得るために遠心速度を調節する必要がある。サンプルのロードと洗浄中にチップを乾燥させないようにしてください。 50 μLの洗浄 2 と遠心分離機を 400 x g で 2 分間平衡させます。 低いスピン速度を使用して、希釈したサンプル(120 μL)をロードします。 50 μLの洗浄2と遠心分離機を400 x g で2分間洗浄します。50 μLの洗浄 1 を繰り返します。注:この洗浄後、樹脂は完全に乾燥している必要があります。 7 μLの溶出溶液(500 mM酢酸アンモニウム(AA)およびACNの20%)を用いたエルルートペプチド混合物は、低速スピン速度を使用してゆっくりと使用した。 0.1の27 μLを加え、AAを希釈し、LC-MS/MS予備注入用のサンプルを得ます。最終的に34 μLに希釈すると、尿とペプチド溶液の間に1:1の体積比が生じてしまいます(精製された消化物の1 μLは、元の尿サンプルの1 μLに相当します)。 7. DDA分析を用いた外部標準によるタンパク質定量 (図 2) 得られたペプチドダイジェストの2 μLをLC-MS/MSに注入し、結果として得られた総ペプチド領域を次のように構築した検量線で補間することによって、サンプル中のタンパク質量を決定します。 HeLaダイジェストストック(100 μg/μL)を使用して、5種類のHeLaダイジェストソリューション(1 ng/μL、2.5 ng/μL、7.5 ng/μL、25 ng/μL、75 ng/μL)を用意します。 各Hela溶液を重複(2μL)で注入します。 LC-MS/MS メソッドを設定します。 5つのHeLaペプチド混合物のうち2μLを注入し、3μm C18シリカ粒子を詰めた15cm、75μm i.dカラムで230 nL/分の流量で75分間の線形勾配を通して別々のペプチドを注入します。移動相A(FA0.1%、ACN2%)と移動相B(0.1およびACNの80%)によって構成されるバイナリ勾配を使用する。 移動相B含有量を60分で6%から42%、さらに8分間で42%から100%に増加させることで、勾配溶出を行います。5分間100%Bを維持し、2分で0%Bに戻します。 トップ12方式を使用してDDAモードで動作し、MSフルスキャン範囲を350-1800 m/z、解像度70,000、ACGターゲット1e6、最大射出時間50msに設定します。前駆体イオン分離のマスウィンドウを1.6 m/z、解像度35,000、ACGターゲット1e5、最大射出時間120ms、HCDフラグメンテーション25 NCE(正規化衝突エネルギー)、動的排除15秒に設定します。 検索エンジンとしてセクエストを使用して生のファイルを分析し、データベースとして、HUMANユニプロト完全タンパク質配列を使用します。ここで紹介した実験では、データベースは2016年3月にダウンロードされ、42.013のシーケンスが含まれていました。 以下の設定を使用してください:MS耐性15ppm、MS / MS耐性0.02 Da、2つの切断部位を設定することにより、酵素としてトリプシン。リジン、セリン、スレオニン、チロシン(+57.021)のカルバミドメチル化、メチオニンの酸化を動的修飾として設定し、システインのカルバミドメチル化(+57.021)を静的修飾として設定します。ペプチドおよびタンパク質同定に対する偽発見率(FDR)のカットオフを0.01に使用し、パーコレータでフィルタリングします。 すべてのMS1ペプチド信号のピーク面積を計算します。ペプチドの総面積を計算します。 HELaサンプルに使用したのと同じLC-MS/MS法を用いて、EPS-尿サンプルから得られた2μLのペプチド混合物を注入し、HeLaデータ処理に使用したのと同じパラメータを使用して生ファイルを分析します。 同定されたすべてのペプチドの面積値を合計してペプチドシグナルの総強度を計算し、外部標準曲線を補間します。これにより、EPS-尿タンパク質消化に存在するペプチド量の許容可能な推定値が得られます。 8. C18ステージチッププロトコル用試薬の準備 500 μLの溶液A(0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)、50N)を調製:100Nの250 μLと5%TFAの10 μLを加えて240 μLのHPLC水を240 μLにします。 2 mLの溶液B(0.1%TFA)を準備する:5%TFAの40 μLを1960 μLのHPLC水に加えます。 溶出液(0.1、50N)の100 μLを調製:10の1μLおよび100Nの50 μLを加えて49 μLのHPLC水を49 μLに加えます。 前に説明したようにステージヒントを準備します。この場合、C18 抽出ディスクが使用されます。 9. SCX/C18 ステージチッププロトコル 注:塩を除去するためにC18ステージチッププロトコルによってEPS尿消化を浄化します。 2 μgのペプチドから始める(予備注入で定量化される)。洗浄2 SCXで4倍の消化液を希釈し、上述の通り進行する(「SCX精製」セクションで)。7 μLの溶出溶液(500 mM酢酸アンモニウム(AA)およびACNの20%)でペプチド混合物をゆっくりと低いスピン速度(5 μL/min流量)で溶出させます。 3%未満のpHと5%未満の有機溶媒濃度を達成するために、トリフルオロ酢酸(TFA)の0.1%の150 μLでSCX溶離液を酸性化します。 C18ステージチップに50 μLの溶液Aと遠心分離機を400 x g で2分間条件を付けます。C18ステージチップを50 μLの溶液Bと遠心分離機を400 x g で2分間平衡化します。 低いスピン速度を使用して、サンプルをゆっくりとステージチップにロードします。 50 μLの溶液Bと遠心分離機でC18ステージチップを洗浄します。 より低いスピン速度を使用して、10 μLの溶出液でペプチド混合物をゆっくりと溶出させます。 30°Cで30°Cで溶出物(10μL)を真空遠心分離機で3分間乾燥させます。0.1の47 μLを加え、期待されるペプチド濃度は40 ng / μLになります。 10. DIA分析 (図 3) nanoLC分離:3μm C18シリカ粒子を詰めた15cm、75 μm IDカラム上の流速230 nL/minで140分間の線形勾配を使用してペプチド混合物を分離します。 230 nL/分流量で勾配溶出を行い、90分で移動相B含有量を3%から25%に、30分で25%から40%、最後に8分で40%から100%に上昇させます。 100%Bで10分後、15分間、移動相Aでカラムを平衡化する。 質量分析パラメータ: 以下のスキャンサイクルを採用した方法を用いてDIA分析を実行する:(i)17,500の解像度で完全スキャンMSイベント(AGC目標1e6、 最大射出時間 50 ms)に続いて、(ii) 20 m/z分離幅で 20 ウィンドウ、(ii) 50 m/z分離幅で 5 ウィンドウ、200 m/z 分離幅で 1 ウィンドウ、1200 m/zで DIA のスキャン範囲を終了する。 DIA スキャンは、解像度 35,000 (AGC ターゲット 5e5、最大射出時間 120 ms および 25 NCE) で実行します。 11. ライブラリ生成のための高-pH逆転相C18分画 注:次の手順でDIA分析のためのデータ依存ライブラリを構築するために、10 μgより高い量のEPS-尿代表サンプルをプールします。 ペプチド混合物(11 μg)をTFAの0.2%で酸性化し、得られた溶液を2層の抽出ディスクを詰めたC18 StageTipにロードして、より高い容量を可能にします。1つのマイクロディスクの積載容量(16ゲージの注射針から)は5-10 μgの範囲であると推定しました。 条件及びC18精製のために既に記載されているように定常相を平衡化する。 水酸化アンモニウムの0.2%、10mM TEAB、およびACNのv/v濃度を増加させる(4%、8%、12%、16%、20%、24%、28%、32%、40%、32%、40%、32%、40%、80%を含む溶出液を使用して、高pH逆転相C18から段階的に溶出(n=10)によるペプチド分画(n=10)を行う。 DIA法と同じクロマトグラフィーパラメータを使用して10分の1を分析します。予備分析に以前採用した設定を使用して、DDAモードで質量分析計を操作します(「DDA分析を用いた外部標準によるタンパク質定量」を参照)。 12. データ分析 DIA分析専用ソフトウェアで高逆転相C18分画のDDA LC-MS/MS実験から得られたタンパク質同定結果をインポートして、スペクトルライブラリを生成します。 識別と定量に使用するフラグメントイオンの最小数と最大数をそれぞれ3と6に設定します。取得した結果を Q 値 0.01 でフィルター処理します。 DIA RAW ファイルをインポートし、各 raw ファイルに、スペクトル ライブラリの作成に使用したのと同じ FASTA ファイルを関連付けます。 タンパク質定量に使用する固有のペプチドの最小数と最大数をそれぞれ 1 と 10 に設定します。 フラグメントイオンピーク領域を合計して、各タンパク質の強度を計算します。 各サンプルの定量化されたタンパク質の強度を持つマトリックスを生成します。