פרופיל פרוטאומי של EPS-שתן באמצעות עיכול FASP וניתוח נתונים עצמאיים

המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של אוניברסיטת מגנה גרציה בקטנזרו, RP 41/2018. הסכמה מדעת בכתב התקבלה מכל המטופלים שנרשמו למחקר. 1. הכנה לדוגמה דגימות שתן EPS צנטריפוגה בתוך 2 שעות של איסוף ב 2,100 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT). אחסן את supernatant ב -80 מעלות צלזיוס עד השימוש. 2. הפשרה לדוגמה מעבירים את הדגימה מ-80°C ל-20°C יום לפני העיכול. לפני עיבוד מדגם, להעביר את המדגם במשך 15-20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן ב RT. 3. הכנה ריאגנטית ל- FASP באותו יום, להכין את הפתרונות הבאים: מאגר אוריאה, 50 mM iodoacetamide (IAA) במאגר אוריאה, 50 mM טריאתילמוניום ביקרבונט ו 500 מ”מ דיתיוטריטול (DTT). הכן חיץ אוריאה (אוריאה 8 M, 100 mM Tris-HCl pH 8): עבור 10 מ”ל, לשקול 4,800 מ”ג של אוריאה ולהמיס אותו בכמות המתאימה של מים HPLC לאחר הוספת 1 מ”ל של 1 M Tris pH 8. נפח של 800 μL של אוריאה יש צורך עבור כל מדגם. הכן 500 מ”מ dithiothreitol (DTT): להמיס 38.5 מ”ג של DTT ב 500 μL של מים HPLC. עבור כל מדגם, 66.7 μL של DTT נדרשים. הכן 50 מ”מ IAA במאגר אוריאה: להמיס 9.25 מ”ג של IAA ב 1 מ”ל של מאגר אוריאה. עבור כל מדגם יש צורך ב-50 μL של רשות העתיקות. הכן 50 מ”מ טריאתילמוניום ביקרבונט (TEAB). הוסף 150 μL של 1 M TEAB ל 2.85 מ”ל של מים HPLC. עבור כל מדגם 460 μL של TEAB נדרשים. הכן פתרון של טריפסין (100 ng/μL) במים HPLC. פתרון זה יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס ומופשר מיד לפני השימוש. עבור כל מדגם, 2 μL (200 ng) יש צורך. 4. עיכול חלבונים על ידי FASP לדלל 500 μL של כל דגימת שתן EPS עם 66.7 μL של 10% (w / v) נתרן דודקיל סולפט (SDS), 66.7 μL של 500 מ”מ DTT ו 33.3 μL של 1 M Tris pH 8 כדי לסלוביל חלבונים ולהפחית אג”ח דיסולפיד. דגירה 10 דקות ב 95 מעלות צלזיוס עם טלטול עדין. הוסף 300 μL של דגימת שתן EPS מדולל על יחידת המסנן (10 kDa) וצנטריפוגה ב 14,000 x g במשך 20 דקות. הוסף 200 μL של מאגר אוריאה למסנן וצנטריפוגה ב 14,000 x g במשך 15 דקות. חזור על שלב זה ולאחר מכן בטל את הזרימה. הוסף 50 μL של פתרון IAA וצנטריפוגה ב 6,000 x g במשך 25 דקות. הוסף 200 μL של מאגר אוריאה וצנטריפוגה ב 14,000 x g במשך 20 דקות. חזור על שלב זה ולאחר מכן בטל את הזרימה. הוסף 200 μL של 50 מ”מ טריאתילמוניום ביקרבונט מאגר (TEAB) וצנטריפוגה ב 14,000 x גרם במשך 20 דקות. חזור על שלב זה. העבר את יחידת הסינון לצינור איסוף חדש. הוסף 60 μL של חיץ 50 מ”מ TEAB ו 200 ng של טריפסין ולהדגיר את המדגם תרמו-מערבל ב 37 °C (67 °F) לילה.הערה: כדי למנוע אידוי מדגם במהלך הדגירה בלילה, לעטוף כל יחידת מסנן עם שכבה של רדיד אלומיניום ולאחר מכן שכבה של parafilm. לאחר הדגירה טריפסין, להוסיף 140 μL של מים צנטריפוגה הבקבוקון ב 14,000 x g במשך 25 דקות כדי לאסוף את נפח העיכול (180-200 μL). 5. הכנה ריאגנטית לטיהור SCX הכן 1 מ”ל של לשטוף 1 (0.5% חומצה פורמית (FA) ו 20% אצטוניטריל (ACN)) כדלקמן: להוסיף 50 μL של 10% FA ו 200 μL של 100% ACN ל 750 μL של מי HLPC. עבור כל מדגם, 100 μL של לשטוף 1 נדרשים. הכן 1.5 מ”ל של לשטוף 2 (0.5% FA ו 80% של ACN) כדלקמן: להוסיף 75 μL של 10 % FA ו 1.2 מ”ל של 100% ACN ל 225 μL של מים HPLC. עבור כל מדגם 190 μL של לשטוף 2 יש צורך. הכן 100 μL של פתרון eluting (500 מ”מ אמוניום אצטט (AA) ו 20% של ACN): להוסיף 25 μL של 2 M AA ו 20 μL של 100% ACN ל 55 μL של מים HPLC. הכן תיאורי שלב באופן הבא. לארוז קצה פיפטה 200 μL עם שכבה של שרף SCX באמצעות מחט מזרק קהה הסתיים (מד 16). הכנס את תיאור StageTip למכסה מיקרוצנטריפוגה שנוקב בעבר כדי להתאים למיקרוקולום. להרכיב את המכסה על microcentrifuge 2 מ”ל שממנו הוסר המכסה המקורי. המכשיר הצנטריפוגלי מיקרו SPE רק התאספו צריך להתאים לתוך צנטריפוגה ספסל. מאז מכסים מחוררים הם מייגעים להכין, הם יכולים להיות מנוצלים מספר פעמים. 6. טיהור SCX לדלל 30 μL של כל מדגם ל 120 μL באמצעות לשטוף 2. מצב StageTip על ידי הוספת 50 μL של לשטוף 1 על גבי שרף החילוץ צנטריפוגה ב 400 x g במשך 2 דקות. מאז התנגדות זרימה תלויה כמה חזק את שאריות החילוץ היה ארוז לתוך קצה פיפטה, מהירות צנטריפוגה ייתכן שיהיה צורך להתאים על מנת לקבל קצב זרימה של 20-30 μL / min. נסו לא להשאיר את הקצה יבש במהלך הטעינה והכביסה לדוגמה. השווה את StageTip עם 50 μL של לשטוף 2 וצנטריפוגה ב 400 x g במשך 2 דקות. טען את המדגם המדולל (120 μL) באמצעות מהירות סיבוב נמוכה יותר. לשטוף את StageTip עם 50 μL של לשטוף 2 וצנטריפוגה ב 400 x g במשך 2 דקות. חוזרים על הפעולה עם 50 μL של שטיפה 1.הערה: לאחר שטיפה זו, על השפך להיות יבש לחלוטין. תערובת פפטיד Elute עם 7 μL של פתרון eluate (500 מ”מ אמוניום אצטט (AA) ו 20% של ACN) לאט באמצעות מהירות סיבוב נמוכה יותר. הוסף 27 μL של 0.1% FA כדי לדלל AA ולקבל מדגם עבור הזרקה ראשונית LC-MS/MS. הדילול הסופי ל 34 μL יגרום יחס נפחי 1:1 בין שתן ותמיסת פפטיד (1 μL של תקציר מטוהר יתאים 1 μL של דגימת שתן מקורית). 7. כימות חלבונים לפי תקן חיצוני באמצעות ניתוח DDA (איור 2) לקבוע את כמות החלבון בדגימות על ידי הזרקת 2 μL של תקציר פפטיד וכתוצאה מכך LC-MS/ MS ואינטרפולציה של האזור הכולל פפטיד וכתוצאה מכך עם עקומת כיול בנוי כדלקמן: הכן חמישה פתרונות תקציר HeLa שונים (1 ng / μL, 2.5 ng / μL, 7.5 ng / μL, 25 ng / μL, 75 ng / μL) באמצעות מלאי עיכול HeLa (100 מיקרוגרם / μL). להזריק כל פתרון הלה כפול (2 μL). הגדר את פעולת השירות LC-MS/MS. להזריק 2 μL של חמש תערובות פפטיד HeLa ופפטידים נפרדים דרך שיפוע ליניארי של 75 דקות בקצב זרימה של 230 nL / דקה על 15 ס”מ, 75 מיקרומטר i.d עמודה ארוז עם 3 חלקיקי סיליקה C18 מיקרומטר. השתמש במעבר צבע בינארי המהווה את השלב הנייד A (0.1% FA, 2% ACN) ובשלב B נייד (0.1% FA ו- 80% של ACN). בצע התרוממות צבע הדרגתית על-ידי הגדלת התוכן של שלב B לנייד מ- 6% ל- 42% ב- 60 דקות ומ- 42% ל- 100% ב- 8 דקות נוספות. לשמור במשך 5 דקות 100% B ולאחר מכן לחזור 0% B בשתי דקות. לפעול במצב DDA באמצעות שיטת העליון 12 ולהגדיר טווח סריקה מלאה MS ב 350-1800 m/z, רזולוציה 70,000, יעד ACG 1e6 וזמן הזרקה מרבי 50 ms. הגדר את חלון המסה לבידוד יון מבשר ב 1.6 m/z, רזולוציה 35,000, יעד ACG 1e5, זמן הזרקה מרבי 120 ms, פיצול HCD ב 25 NCE (אנרגיית התנגשות מנורמלת) והדרה דינמית 15 שניות. נתח קבצים גולמיים באמצעות Sequest כמנוע חיפוש, ואת רצף החלבון המלא של UNiprot של האדם כמסד הנתונים. בניסויים שהוצגו כאן, המאגר הורד במרץ 2016 והכיל 42.013 רצפים. השתמש בהגדרות הבאות: עמידות בפני MS 15 עמודים לדקה, עמידות MS/MS 0.02 Da, טריפסין כאנזים על-ידי הגדרת שני אתרי מחשוף שלא נענו. הגדר את carbamidomethylation של ליצין, סרין, threonine, טירוסין (+57.021) ואת החמצון של מתיונינים כמו שינויים דינמיים קרבמידומתילציה של ציסטאינים (+57.021) כמו שינויים סטטיים. השתמש בחיתוך של שיעור גילוי כוזב (FDR) לזיהוי פפטידים וחלבונים ל- 0.01 וסנן לפי פרקולטור. חשב את אזור השיא עבור כל אותות הפפטיד של MS1. חשב את האזור הכולל של הפפטידים. להזריק 2 μL של תערובות פפטיד המתקבל דגימות שתן EPS באמצעות אותה שיטה LC-MS/ MS המשמש עבור דגימות HeLa ולנתח את הקובץ גלם באמצעות אותם פרמטרים המשמשים לעיבוד נתונים HeLa. חשב את העוצמה הכוללת של אותות פפטיד על-ידי סיכום ערכי האזור של כל הפפטידים שזוהו ואינטרפולציית העקומה הסטנדרטית החיצונית. זה יספק הערכה מקובלת של כמות פפטיד נוכח בעיכול חלבון שתן EPS. 8. הכנה ריאגנטית לפרוטוקול תיאור שלב C18 הכן 500 μL של פתרון A (0.1% חומצה Trifluoroacetic (TFA), 50% ACN): להוסיף 250 μL של 100% ACN ו 10 μL של 5% TFA ל 240 μL של מים HPLC. הכן 2 מ”ל של פתרון B (0.1 % TFA): להוסיף 40 μL של 5% TFA ל 1960 μL של מים HPLC. הכן 100 μL של פתרון eluting (0.1% FA, 50% ACN): להוסיף 1 μL של 10% FA ו 50 μL של 100% ACN ל 49 μL של מים HPLC. הכן תיאורי שלב כמתואר לעיל. במקרה זה, נעשה שימוש בדיסקי חילוץ C18. 9. פרוטוקול תיאור שלב SCX/C18 הערה: לטהר EPS-שתן תקצירים על ידי פרוטוקול C18 StageTip כדי להסיר מלחים. התחל מ 2 מיקרוגרם של פפטידים (כפי שכמת על ידי הזריקה הראשונית). לדלל את פתרון העיכול פי 4 בכביסה 2 SCX ולהמשיך כמתואר לעיל (בסעיף “SCX טיהור”). אלוט את תערובת פפטיד עם 7 μL של פתרון eluate (500 מ”מ אמוניום אצטט (AA) ו 20% של ACN) לאט באמצעות מהירות סיבוב נמוכה יותר (5 μL / קצב זרימה דקה). חומצי SCX eluate עם 150 μL של 0.1% של חומצה trifluoroacetic (TFA) על מנת להשיג pH נמוך מ 3 וריכוז של ממס אורגני מתחת 5%. התנה את תיאור שלב C18 עם 50 μL של פתרון A וצנטריפוגה ב 400 x g במשך 2 דקות. שיווי משקל C18 StageTip עם 50 μL של פתרון B וצנטריפוגה ב 400 x g במשך 2 דקות. טען את הדגימה על קצה הבמה באיטיות באמצעות מהירות סיבוב נמוכה יותר. לשטוף C18 שלבTip עם 50 μL של פתרון B וצנטריפוגה. לאט לאט להפוך את תערובת פפטיד עם 10 μL של פתרון elution באמצעות מהירות סיבוב נמוכה יותר. יבש את eluate (10 μL) ב 30 מעלות צלזיוס בצנטריפוגה ואקום במשך 3 דקות. הוסף 47 μL של 0.1% FA. ריכוז פפטיד צפוי יהיה 40 ng / μL. לנתח על ידי LC-MS / MS במצב DIA. 10. ניתוח DIA (איור 3) הפרדה nanoLC: להפריד את תערובת פפטיד באמצעות שיפוע ליניארי של 140 דקות בקצב זרימה של 230 nL / min על 15 ס”מ, 75 μm מזהה עמודה ארוז עם 3 מיקרומטר C18 חלקיקי סיליקה. בצע האצה הדרגתית בקצב זרימה של 230 nL/minute והגדל את תוכן שלב B הנייד מ- 3% ל- 25% ב- 90 דקות, לאחר מכן מ- 25% ל- 40% ב- 30 דקות ולבסוף מ- 40% ל- 100% ב- 8 דקות. לאחר 10 דקות ב- 100% B, השווה את העמודה עם שלב A נייד למשך 15 דקות. פרמטרים ספקטרומטריים של מסה: בצע ניתוח DIA בשיטה המשתמשת במחזור הסריקה הבא: (i) אירוע סריקה MS מלא ברזולוציה של 17,500 (יעד AGC 1e6, זמן הזרקה מרבי 50 אלפיות השנייה) ואחריו (ii) 20 חלונות ברוחב בידוד של 20 מ”מ/שנייה, החל מ- m/z 350, (ii) 5 חלונות ברוחב בידוד של 50 מ’/ת וחלון אחד ברוחב בידוד של 200 מ’/5, המסיים את טווח הסריקה של DIA ב- 1200 m/z. בצע סריקות DIA ברזולוציה 35,000 (יעד AGC 5e5, זמן הזרקה מרבי 120 אלפיות השנייה ו- 25 NCE). 11. pH גבוה הפוך שלב C18 שבר עבור יצירת ספרייה הערה: מאגר EPS-שתן נציג דגימות בכמות גבוהה מ 10 מיקרוגרם על מנת לבנות ספריה תלוית נתונים לניתוח DIA על ידי ההליך הבא: חומצי את תערובת פפטיד (11 מיקרוגרם) על ידי 0.2% של TFA ולטעון את הפתרון וכתוצאה מכך על C18 StageTip ארוז עם שתי שכבות של דיסקים החילוץ כדי לאפשר קיבולת גבוהה יותר. הערכנו את קיבולת הטעינה של דיסק מיקרו יחיד (ממחט מזרק 16 מד) להיות בטווח 5-10 מיקרוגרם. מצב ושלב נייח שיווי משקל כפי שכבר תואר עבור טיהור C18. לבצע שבר פפטיד על ידי elution stepwise (n = 10) מ pH גבוה הפוך שלב C18 באמצעות פתרונות elution המכילים 0.2% של אמוניום הידרוקסיד, 10 מ”מ TEAB, והגדלת v / v ריכוזים של ACN (4%, 8%, 12%, 16%, 20%, 24%, 28%, 32%, 40%, 80%). נתח את 10 השברים באמצעות אותם פרמטרים כרומטוגרפיים של שיטת DIA. הפעל את ספקטרומטר המסה במצב DDA באמצעות ההגדרות שאומצו בעבר לניתוח הראשוני (ראה “כימות חלבונים לפי תקן חיצוני באמצעות ניתוח DDA”). 12. ניתוח נתונים צור את הספרייה הספקטרלית על-ידי ייבוא תוצאות זיהוי החלבון המתקבלות מניסויי DDA LC-MS/MS של שבר שלב C18 הפוך גבוה בתוכנה המוקדשת לניתוח DIA. הגדר את המספר המינימלי והמקסימלי של יוני שבר המשמשים לזיהוי וכימות ל- 3 ו- 6, בהתאמה. סנן את התוצאות שהתקבלו לפי ערך Q של 0.01. יבא קבצי DIA גולמיים ושייך לכל קובץ גולמי את אותו קובץ FASTA המשמש ליצירת הספריה הספקטרלית. הגדר את המספר המינימלי והמקסימלי של פפטידים ייחודיים המשמשים לכימות חלבונים ל- 1 ו- 10, בהתאמה. חשב את העוצמה עבור כל חלבון על-ידי סיכום אזור שיא יון שבר. צור מטריצה בעוצמה של החלבונים מכמתים בכל מדגם.