Proteomisch profiel van EPS-urine door FASP-vergisting en data-onafhankelijke analyse

De studie werd goedgekeurd door het Institutioneel Ethisch Comité van de Magna Graecia Universiteit van Catanzaro, RP 41/2018. Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten die aan het onderzoek deelnamen. 1. Monstervoorbereiding Centrifugeer EPS-urinemonsters binnen 2 uur na verzameling bij 2.100 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT). Bewaar het supernatant bij -80 °C tot gebruik. 2. Monster ontdooien Breng het monster de dag voor de spijsvertering over van -80 °C naar -20 °C. Breng het monster vóór de monsterverwerking gedurende 15-20 minuten bij 4 °C en vervolgens bij RT over. 3. Reagensvoorbereiding voor FASP Bereid op dezelfde dag de volgende oplossingen voor: ureumbuffer, 50 mM iodoacetamide (IAZ) in ureumbuffer, 50 mM triethylammoniumbicarbonaat en 500 mM dithiothreitol (DTT). Bereid ureumbuffer (ureum 8 M, 100 mM Tris-HCl pH 8): weeg gedurende 10 ml 4.800 mg ureum en los het op in de juiste hoeveelheid HPLC-water na toevoeging van 1 ml 1 M Tris pH 8. Voor elk monster is een volume van 800 μL ureum nodig. Bereid 500 mM dithiothreitol (DTT) voor: los 38,5 mg DTT op in 500 μL HPLC-water. Voor elk monster is 66,7 μL DTT nodig. Bereid 50 mM IAZ voor in Ureumbuffer: los 9,25 mg IAZ op in 1 ml ureumbuffer. Voor elk monster is 50 μL IAZ nodig. Bereid 50 mM triethylammoniumbicarbonaat (TEAB). Voeg 150 μL 1 M TEAB toe aan 2,85 ml HPLC-water. Voor elk monster is 460 μL TEAB nodig. Bereid een oplossing van trypsine (100 ng/μL) in HPLC-water. Deze oplossing kan bij -80 °C worden bewaard en vlak voor gebruik worden ontdooid. Voor elk monster is 2 μL (200 ng) nodig. 4. Eiwitvertering door FASP Verdun 500 μL van elk EPS-urinemonster met 66,7 μL van 10% (m/v) natriumdodecylsulfaat (SDS), 66,7 μL van 500 mM DTT en 33,3 μL van 1 M Tris pH 8 om eiwitten te solubiliseren en disulfidebindingen te verminderen. Incubeer 10 minuten bij 95 °C met zachtjes schudden. Voeg 300 μL verdund EPS-urinemonster toe aan de filtereenheid (10 kDa) en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 14.000 x g. Voeg 200 μL ureumbuffer toe aan het filter en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 14.000 x g. Herhaal deze stap en gooi vervolgens de doorstroming weg. Voeg 50 μL IAZ-oplossing toe en centrifugeer gedurende 25 minuten bij 6.000 x g. Voeg 200 μL ureumbuffer toe en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 14.000 x g. Herhaal deze stap en gooi vervolgens de doorstroming weg. Voeg 200 μL triethylammoniumbicarbonaatbuffer (TEAB) van 50 mM toe en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 14.000 x g. Herhaal deze stap. Breng de filterunit over in een nieuwe opvangbuis. Voeg 60 μL TEAB-buffer van 50 mM en 200 ng trypsine toe en incubeer het monster ‘s nachts in een thermomixer bij 37 °C.OPMERKING: Om verdamping van monsters tijdens de nachtelijke incubatie te voorkomen, wikkelt u elke filtereenheid in met een laag aluminiumfolie en vervolgens een laag parafilm. Voeg na trypsine incubatie 140 μL water toe en centrifugeer de flacon gedurende 25 minuten op 14.000 x g om het volume van de digest (180-200 μL) te verzamelen. 5. Reagenspreparaat voor SCX-zuivering Bereid 1 ml was 1 (0,5% mierenzuur (FA) en 20% acetonitril (ACN)) als volgt: voeg 50 μL van 10% FA en 200 μL van 100% ACN toe aan 750 μL HLPC-water. Voor elk monster is 100 μL was 1 nodig. Bereid 1,5 ml was 2 (0,5% FA en 80% ACN) als volgt voor: voeg 75 μL van 10 % FA en 1,2 ml 100% ACN toe aan 225 μL HPLC-water. Voor elk monster is 190 μL was 2 nodig. Bereid 100 μL elutingsoplossing (500 mM ammoniumacetaat (AA) en 20% ACN): voeg 25 μL 2 M AA en 20 μL 100% ACN toe aan 55 μL HPLC-water. Bereid StageTips als volgt voor. Verpak een pipetpunt van 200 μL met een laag SCX-hars met behulp van een stompe spuitnaald (maat 16). Steek de StageTip in een microcentrifugedeksel dat eerder is doorboord om de microcolumn te huisvesten. Monteer het deksel op een microcentrifuge van 2 ml waaruit het originele deksel is verwijderd. Het zojuist geassembleerde micro-SPE centrifugaalapparaat moet in een benchtopcentrifuge passen. Omdat geperforeerde deksels vervelend zijn om te bereiden, kunnen ze meerdere keren worden gebruikt. 6. SCX zuivering Verdun 30 μL van elk monster tot 120 μL met was 2. Conditioneer de StageTip door 50 μL was 1 bovenop de extractiehars toe te voegen en centrifugeer gedurende 2 minuten op 400 x g. Aangezien de stromingsweerstand afhangt van hoe sterk de extractiehars in de pipetpunt is verpakt, moet de centrifugesnelheid mogelijk worden aangepast om een debiet van 20-30 μL/min te verkrijgen. Probeer de tip niet droog te laten tijdens het laden en wassen van het monster. Equilibreert de StageTip met 50 μL was 2 en centrifugeer gedurende 2 minuten op 400 x g. Laad het verdunde monster (120 μL) met een lagere centrifugesnelheid. Was de StageTip met 50 μL was 2 en centrifugeer gedurende 2 minuten op 400 x g. Herhaal dit met 50 μL was 1.OPMERKING: Na deze wasbeurt moet de hars volledig droog zijn. Elute peptidemengsel met 7 μL eluaatoplossing (500 mM ammoniumacetaat (AA) en 20% van ACN) langzaam met een lagere spinsnelheid. Voeg 27 μL 0,1% FA toe om AA te verdunnen en om een monster voor lc-MS/MS voorlopige injectie te verkrijgen. De uiteindelijke verdunning tot 34 μL zal resulteren in een volumetrische verhouding van 1:1 tussen urine en peptideoplossing (1 μL gezuiverde digest komt overeen met 1 μL origineel urinemonster). 7. Eiwitkwantificering door externe standaard met behulp van DDA-analyse (Figuur 2) Bepaal de eiwithoeveelheid in monsters door 2 μL van de resulterende peptidevertering in LC-MS/MS te injecteren en het resulterende totale peptidegebied te interpoleren met een kalibratiecurve die als volgt is opgebouwd: Bereid vijf verschillende HeLa-digestoplossingen (1 ng/μL, 2,5 ng/μL, 7,5 ng/μL, 25 ng/μL, 75 ng/μL) met behulp van een HeLa-digestvoorraad (100 μg/μL). Injecteer elke Hela-oplossing in tweevoud (2 μL). Stel de LC-MS/MS-methode in. Injecteer 2 μL van de vijf HeLa peptidemengsels en scheid peptiden door een lineaire gradiënt van 75 minuten met een debiet van 230 nL/minuut op een kolom van 15 cm, 75 μm i.d. verpakt met 3 μm C18 silicadeeltjes. Gebruik een binair verloop dat bestaat uit mobiele fase A (0,1% FA, 2% ACN) en mobiele fase B (0,1% FA en 80% van ACN). Voer gradiënt-elutie uit door het mobiele fase B-gehalte in 60 minuten te verhogen van 6% naar 42% en in 8 minuten van 42% naar 100%. Houd 5 minuten 100% B aan en ga dan in twee minuten terug naar 0% B. Werk in DDA-modus met behulp van een top-12-methode en stel het volledige scanbereik van MS in op 350-1800 m/z,resolutie 70.000, ACG-doel 1e6 en maximale injectietijd 50 ms. Stel het massavenster voor precursor ionenisolatie in op 1,6 m/z,resolutie 35.000, ACG-doel 1e5, maximale injectietijd 120 ms, HCD-fragmentatie bij 25 NVU (genormaliseerde botsingsenergie) en dynamische uitsluiting 15 seconden. Analyseer onbewerkte bestanden met Sequest als zoekmachine en de HUMAN Uniprot Complete eiwitsequentie als database. In de hier gepresenteerde experimenten werd de database in maart 2016 gedownload en bevatte 42.013 sequenties. Gebruik de volgende instellingen: MS tolerantie 15 ppm, MS/MS tolerantie 0,02 Da, trypsine als enzym door twee gemiste decolletéplaatsen in te stellen. Stel de carbamidomethylatie van lysine, serine, threonine, tyrosine (+57.021) en de oxidatie van methionines in als dynamische modificaties en de carbamidomethylatie van cysteïnes (+57.021) als statische modificaties. Gebruik de cut-off van false discovery rate (FDR) voor peptiden en eiwitten identificatie tot 0,01 en filter uit door percolator. Bereken het piekgebied voor alle MS1 peptide signalen. Bereken het totale oppervlak van de peptiden. Injecteer 2 μL peptidemengsels verkregen uit EPS-urinemonsters met behulp van dezelfde LC-MS/MS-methode die wordt gebruikt voor de HeLa-monsters en analyseer het ruwe bestand met behulp van dezelfde parameters die worden gebruikt voor hela-gegevensverwerking. Bereken de totale intensiteit van peptidesignalen door oppervlaktewaarden van alle geïdentificeerde peptiden op te sommen en de externe standaardcurve te interpoleren. Dit zal een aanvaardbare schatting geven van de hoeveelheid peptiden die aanwezig is in de EPS-urine eiwitvertering. 8. Reagensvoorbereiding voor C18 StageTip protocol Bereid 500 μL oplossing A (0,1% trifluorazijnzuur (TFA), 50% ACN): voeg 250 μL 100% ACN en 10 μL 5% TFA toe aan 240 μL HPLC-water. Bereid 2 ml oplossing B (0,1 % TFA): voeg 40 μL 5% TFA toe aan 1960 μL HPLC-water. Bereid 100 μL elutingsoplossing (0,1% FA, 50% ACN): voeg 1 μL 10% FA en 50 μL 100% ACN toe aan 49 μL HPLC-water. Bereid StageTips voor zoals eerder beschreven. In dit geval worden C18-extractieschijven gebruikt. 9. SCX/C18 StageTip-protocol OPMERKING: Zuiver EPS-urineverteringen volgens het C18 StageTip-protocol om zouten te verwijderen. Begin met 2 μg peptiden (zoals gekwantificeerd door de voorlopige injectie). Verdun de digestoplossing 4-voudig in was 2 SCX en ga te werk zoals hierboven beschreven (in sectie “SCX-zuivering”). Elute het peptidemengsel met 7 μL eluaatoplossing (500 mM ammoniumacetaat (AA) en 20% van ACN) langzaam met een lagere centrifugesnelheid (5 μL/min debiet). Verzuring van het SCX-eluaat met 150 μL 0,1% trifluorazijnzuur (TFA) om een pH lager dan 3 en een concentratie organisch oplosmiddel van minder dan 5% te bereiken. Conditioneer de C18 StageTip met 50 μL oplossing A en centrifugeer gedurende 2 minuten op 400 x g. Equilibreert C18 StageTip met 50 μL oplossing B en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 400 x g. Laad het monster langzaam op de stage-tip met een lagere draaisnelheid. Was C18 StageTip met 50 μL oplossing B en centrifugeer. Eluteer langzaam het peptidemengsel met 10 μL elutieoplossing met een lagere centrifugesnelheid. Droog het eluaat (10 μL) bij 30 °C gedurende 3 minuten in een vacuümcentrifuge. Voeg 47 μL van 0,1% FA toe. De verwachte peptideconcentratie zal 40 ng/μL zijn. Analyseren door LC-MS/MS in DIA-modus. 10. DIA-analyse (figuur 3) nanoLC-scheiding: Scheid het peptidemengsel met behulp van een lineaire gradiënt van 140 minuten bij een debiet van 230 nL/min op een 15 cm, 75 μm ID-kolom verpakt met 3 μm C18 silicadeeltjes. Voer gradiënt-elutie uit bij een debiet van 230 nL/minuut en verhoog het mobiele fase B-gehalte van 3% naar 25% in 90 minuten, vervolgens van 25% naar 40% in 30 minuten en uiteindelijk van 40% naar 100% in 8 minuten. Na 10 minuten bij 100% B de kolom gedurende 15 minuten gelijktrekken met mobiele fase A. Massaspectrometrische parameters: voer DIA-analyse uit met behulp van een methode die de volgende scancyclus gebruikt: (i) een ms-gebeurtenis met volledige scan met een resolutie van 17.500 (AGC-doel 1e6, maximale injectietijd 50 ms), gevolgd door (ii) 20 vensters bij 20 m/z isolatiebreedte, beginnend bij m/z 350, (ii) 5 vensters bij 50 m/z isolatiebreedte en (iv) 1 venster bij 20 m/z isolatiebreedte, beginnend bij m/z 350, (ii) 5 vensters bij 50 m/z isolatiebreedte en (iv) 1 venster bij 20 m/z isolatiebreedte. Voer DIA-scans uit bij resolutie 35.000 (AGC-doel 5e5, maximale injectietijd 120 ms en 25 NVU). 11. Hoge pH omgekeerde fase C18 fractionering voor bibliotheekgeneratie OPMERKING: Pool EPS-urine representatieve monsters in een hoeveelheid van meer dan 10 μg om een gegevensafhankelijke bibliotheek voor DIA-analyse op te bouwen volgens de volgende procedure: Verzuring van het peptidemengsel (11 μg) met 0,2% van de TFA en laad de resulterende oplossing op een C18 StageTip verpakt met twee lagen extractieschijven om een hogere capaciteit mogelijk te maken. We schatten de laadcapaciteit van een enkele microschijf (van een spuitnaald van 16 gauge) op 5-10 μg. Toestand en equilibrate stationaire fase zoals reeds beschreven voor C18 zuivering. Voer stapsgewijze elutie (n=10) uit met behulp van elutieoplossingen die 0,2% ammoniumhydroxide, 10 mM TEAB bevatten en de v/v-concentraties van ACN verhogen (4%, 8%, 12%, 16%, 20%, 24%, 28%, 32%, 40%, 8%). Analyseer de 10 breuken met dezelfde chromatografische parameters van de DIA-methode. Gebruik de massaspectrometer in de DDA-modus met behulp van de instellingen die eerder zijn gebruikt voor de voorlopige analyse (zie “Eiwitkwantificering door externe standaard met behulp van DDA-analyse”). 12. Gegevensanalyse Genereer de spectrale bibliotheek door de eiwitidentificatieresultaten te importeren die zijn verkregen uit de DDA LC-MS/MS-experimenten van hoog-omgekeerde fase C18-fractionering in een software gewijd aan DIA-analyse. Stel het minimum- en maximumaantal fragmentionen dat wordt gebruikt voor identificatie en kwantificering in op respectievelijk 3 en 6. Filter de verkregen resultaten op een Q-waarde van 0,01. Importeer DIA raw-bestanden en koppel aan elk raw-bestand hetzelfde FASTA-bestand dat wordt gebruikt voor het maken van de spectrale bibliotheek. Stel het minimum- en maximumaantal unieke peptiden dat wordt gebruikt voor eiwitkwantificering in op respectievelijk 1 en 10. Bereken de intensiteit voor elk eiwit door fragmentionenpiekgebied op te sommen. Genereer een matrix met de intensiteit van de gekwantificeerde eiwitten in elk monster.