Baculovirüs Ekspresyon Vektör Sistemi Kullanılarak Rekombinant PRMT Proteinlerinin Üretimi

NOT: BEVS protokol adımlarına genel bakış Şekil 1’de özetlenmiştir. 1. Rekombinant bacmid DNA’sının üretimi DH10Bac dönüşümü için LB agar seçici plakalarının hazırlanması DH10Bac transformantları için seçmek üzere 50 μg/mL kanamycin, 7 μg/mL gentamisin, 10 μg/mL tetrasiklin, 200 μg/mL Bluo-gal ve 40 μg/mL IPTG içeren LB agar plakaları hazırlayın. 25 g önceden karıştırılmış LB suyu ve 13 g Bacto Agar ağırlığında ve 2 L şişeye koyun. Hacmi damıtılmış su ile 1 L’ye getirin ve 121 °C’de 15-30 dakika otoklavlayın. 50 °C’de bir su banyosu ayarlayın ve otoklavlı agar çözeltisini su banyosunda 50-55 °C’ye kadar soğutun. Soğutulmuş çözeltiye, 7 μg/ mL’lik son konsantrasyona gentamisin, 50 μg / mL’lik son konsantrasyona kanamycin, 10 μg / mL’lik son konsantrasyona tetrasiklin, 200 μg / mL’lik son konsantrasyona Bluo-gal ve 40 μg / mL’lik son konsantrasyona IPTG ekleyin. Agar çözeltisini ve 7-10 mL’lik ortayı 50 mL pipet kullanarak her 60 mm plakaya karıştırın. Tabakların sertleşmesi için oda sıcaklığında (2 saat) oturmasına izin verin. 4 °C’de ters çevirin, sarın ve saklayın. Antibiyotik içeren plakalar 4 haftaya kadar stabildir. Plazmid’in DH10Bac E. coli yetkin hücrelere dönüşümü Gerekli yetkin hücre hacmini hesaplayın. Buz üzerinde yetkin hücreleri çözün, hafifçe aşağı dönün ve hafifçe dokunarak geriye doğru yeniden biriktirin. 96 kuyulu PCR plakasının her kuyusuna 4 μL hücre dağıtmak için 12 kanallı bir pipet kullanın. Yetkin hücrelere ~ 0.3-0.5 μg rekombinant plazmid DNA ekleyin ve dokunarak hafifçe karıştırın. Karışımı 10-15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın. Karışımı 45 s için 42 °C’de bir PCR makinesinde ısı şoku. 2 dakika buzda soğutun. 96 kuyulu blokların her kuyusuna (96 derin kuyu 2,4 mL) 0,5 mL SOC ortamı dağıtın. Dönüştürülmüş bakteri süspansiyonu bloğun ilgili kuyusuna aktarmak ve bir airpore levha ile örtmek için 12 kanallı bir pipet kullanın. Bloğu 4-5 saat orta ajitasyon (205 rpm) ile 37 °C’de sallanan bir inkübatöre yerleştirin. Kültürün 30-50 μL’lik kısmını steril cam boncuklar kullanarak LB agar plakasının yüzeyine eşit şekilde yayın. Kültürün geri kalanını 4 °C’de saklayın. Mavi/beyaz kolonilerin rengi fark edene kadar plakaları 37 °C’de kuluçkaya yatırın (40-48 saat). Plaka üzerinde yeterli beyaz, büyük koloniler elde edildiğinde kültürü atın. Beyaz kolonilerin sadece rekombinant bacmid DNA içermesini sağlamak için, fenotipi doğrulamak için izole edilmiş bir beyaz koloniyi antibiyotik, bluo-gal ve IPTG içeren taze LB agar plakalarına yeniden çizin. 37 °C’de 48 saat kuluçkaya yaslanın. Rekombinant bacmid DNA’sının çıkarılması için yeniden çizgili bir plakadan doğrulanmış bir beyaz koloni seçin. İzolasyon rekombinant bacmid DNA Tek, izole edilmiş bir beyaz koloniyi 50 μg/mL kanamycin, 7 μg/mL gentamicin ve 10 μg/mL tetrasiklin ile desteklenmiş 3 mL LB ortamına 24 kuyulu bloklar halinde (24 kuyu blokları yuvarlak alt) aşılayın ve bir airpore levha ile örtün. 250 rpm’de sallanarak bir gecede 37 °C’de büyüyün. 24 kuyulu blokları 2.100 x g’da 10 dakika santrifüj edin. Süpernatantı dekant, bloğu ters çevirin ve emici bir kağıt mendile hafifçe dokunun. Her kuyuya 250 μL çözelti 1 (hücre resüspenzyon çözeltisi) ekleyin. Blokları bant pedleri veya diğer sızdırmazlık filmleriyle kapatın ve 5-10 dakika boyunca 75 rpm’de bir sallama platformuna yerleştirin. Uygun hücre lizizini sağlamak için her kuyuya bakın ve gerekirse 1 mL’lik bir uç kullanarak yeniden dirildi. Her kuyuya 250 μL çözelti 2 (hücre liziz çözeltisi) ekleyin, blokları kapatın ve 30 s için 75 rpm’de bir sallama platformuna yerleştirin (numunelerin çapraz kirlenmesini önlemek için, 24 kuyu bloklarını ters çevirmeyin) oda sıcaklığında 4 dakika kuluçkalayın. 250 μL çözelti 3 (nötralizasyon çözeltisi) ekleyin, blokları kapatın ve 30 s için 75 rpm’de sallama platformuna yerleştirin. Kalın beyaz bir protein çökeltici ve E. coli genomik DNA oluşacaktır. Numuneyi 10-15 dakika boyunca buza yerleştirin. Beyaz çökeltme malzemesini sıkıca peletmek için 4 °C’de 2.100 x g’da 60 dakika santrifüj. Santrifüjleme sırasında, yeni bir mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin ve 0,8 mL mutlak izopropanol ekleyin. Süpernatantı, herhangi bir beyaz çökelti malzemesinden kaçınarak izopropanol içeren tüpe hafifçe aktarın. Tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirerek karıştırın ve ardından 5 ila 10 dakika boyunca buza yerleştirin. Bu aşamada, numune gece boyunca -20 °C’de saklanabilir. Numuneyi 4 °C’de 14.000 x g’da 15 dakika santrifüj edin. Süpernatant çıkarın ve her tüpe% 70 etanol 0.5 mL ekleyin. Peletin yıkanması için tüpü birkaç kez ters çevirin. Oda sıcaklığında 14.000 x g’da 5 dakika santrifüj. (İsteğe bağlı: tekrar yıkama) Plazmid preparatının sterilitesini sağlamak ve süpernatantın mümkün olduğunca çoğunu çıkarmak için laminer akış davlumbazının içine numuneler getirin.NOT: Pelet tüpün altından yerinden çıkabilir, bu nedenle üst kısmı atarken peletin dikkatlice izlenmesini izleyin. Peleti laminar akış davlumbazının içinde 15 – 20 dakika boyunca havayla kurutun ve DNA’yı 50 μL filtrelenmiş elüsyon tamponunda, 10 mM Tris-Cl’de, pH 8.5’te çözün (peletlerin aşırı kurulmadığından emin olun). Rekombinant bacmid DNA’sı 135 kb’den büyük olduğundan, DNA’nın yamulmasını önlemek için, hafifçe dokunarak peletin çözün. Bacmid DNA’sında ilgi geninin varlığını doğrulamak için PCR reaksiyon karışımını 96 kuyulu bir PCR plakasına ayarlayın. PCR karışımını aşağıdaki gibi hazırlayın: 1 μL tampon, 0,2 μL (her biri 10 mM), 0,1 μL Taq DNA polimeraz, 0,1 μL (25 μM) ileri ve ters astarlar (BACV2FWD: tattccggattattcataccg; BACV2REV: ctctacaaatgtggtatggc), 1 μL bacmid DNA ve 8 μL su. Hedef genlerin amplifikasyonunu 95 °C’de 2 dakika boyunca ilk denatürasyon ile gerçekleştirin, ardından 30 s için 94 °C 25 döngü, 30 s için 55 °C ve 1 dk/kb için 72 °C. 72 °C’de 7 dakika boyunca son uzatmadan sonra reaksiyona son ver. Elektroforezi ile nükleik asit boyama çözeltisi içeren %1 (w/v) agarose jel üzerinde amplifikasyon ürününün 10 μL analiz edin. Doğrulanmış bacmid DNA’ları 4 °C’de saklayın. 2. Rekombinant baculovirüs stoklarının üretimi NOT: Baculovirüs üretimi için hücre transfeksiyonu, baculovirüs hacim amplifikasyonu, protein ekspresyon taraması ve protein üretimi de dahil olmak üzere baculovirüs ekspresyon protokolünün herhangi bir adımı için% 95 veya daha fazla canlılığa sahip katlanarak büyüyen Sf9 hücrelerini kullanın. Sf9 hücrelerinin Bacmid DNA’sı ve JetPrime veya X-tremeGENE 9 gibi transfeksiyon reaktifleri (T.R.) ile transfeksiyonu.NOT: Uygun hücre sayısını ve % hücre canlılığını belirlemek için Trypan Mavi boyama ve hemositometre kullanılabilir. Canlı olmayan hücreler lekeyi alır ve mikroskop altında mavi görünürken, canlı hücreler etkilenmeden kalır. % hücre canlılığını hesaplamak için toplam hücre sayısı elde edilir (lekesiz ve lekeli) ve uygulanabilir hücre sayısı toplam hücre sayısına bölünür ve 100 ile çarpılır. Katlanarak büyüyen Sf9 hücrelerini serumsuz böcek ortamlarında 4 x 105 hücre / mL nihai hücre yoğunluğuna seyreltin ve steril reaktif rezervuarına dökün. Seyreltilmiş Sf9 hücrelerinin 0,5 mL’lik kısmını 24 kuyulu bir plakanın her kuyusuna tohumlamak için programlanabilir bir çok kanallı pipet kullanın. Plakanın bir kuyusunu kontrol (transtransfected) olarak etiketle ve potansiyel enfeksiyon belirtilerini değerlendirmek için transfected ve transfected olmayan hücreleri karşılaştırmak için bir kontrol olarak kullanın. Hücreleri plakalara tohum ettikten sonra, hücrelerin eşit bir monolayerini sağlamak için plakaları birkaç kez hafifçe ileri geri sallayın. Plakaları döndürmeyin, çünkü hücreler kuyunun ortasına kümelenir. Kültür plakalarına hücre bağlanmasına izin vermek için plakaları en az 1 saat boyunca 27 °C’de kuluçkaya yatırın. Transfeksiyon reaktif şişesini iyice karıştırın. Her transfeksiyon için transfeksiyon tamponunun 100 μL’sine 2 μL transfeksiyon reaktifi ekleyin. Başka herhangi bir desteksiz böcek ortamı da kullanılabilir. Seyreltilmiş transfeksiyon reaktifini steril bir reaktif rezervuarında biriktirin ve 10 s boyunca hafifçe karıştırın. 12 kanallı pipet kullanarak, seyreltilmiş transfeksiyon reaktifinin 102 μL’lik kısmını steril bir 96 mikrowell plakaya aktarın. 0,2 μg/μL’lik bir rekombinant bacmid DNA çözeltisinin 10 μL’lik kısmını 96 kuyulu bir mikrowell plakasının ilgili kuyusuna aktarın ve plakayı yanlardan hafifçe sallayarak (dokunarak) karıştırın. Karmaşık oluşumu sağlamak için transfeksiyon karışımını 15-20 dakika kuluçkaya yatırın. 96 ve 24 kuyu plakaları arasında aktarım için tasarlanmış ayarlanabilir 6 kanallı pipet kullanarak, transfeksiyon karışımını hücrelere damla yönünde transeksiyon plakalarının ilgili kuyularına ekleyin ve 27 °C’de 4-5 saat kuluçkaya yatırın. Transfeksiyon karışımının hücre monolayer üzerinde eşit dağılımını sağlamak için inkübasyon süresi boyunca plakaları birkaç kez hafifçe ileri geri sallayın. Transfeksiyondan sonra 4-5 saat, ısı inaktive fetal sığır serumu ve antibiyotik-antimycotic’in % 1 (v/v) son hacmine (100 birim/mL penisilin) % 10 (v/v) ile desteklenmiş 1,5 mL böcek serumsuz ortam ekleyin, 100 μg/mL streptomisiin ve 0,25 μg/mL amfoterisikin B). Hücreleri 27 °C inkübatörde 72-96 saat kuluçkaya yatırın. Mümkün olduğunda transfeksiyon plakalarını günde bir kez hafifçe sallayın. Transfeksiyon sonrası 72-96 saatte transktaklı hücrelerde belirgin olan enfeksiyon belirtilerini (SOI) arayın (Şekil 2). Transfected hücrelerin virüsü üretmeye başlayacağını ve kültürü daha da enfekte edeceğini unutmayın; bu nedenle, enfeksiyon belirtilerini arayın.NOT: Enfeksiyon belirtileri, hücre çapında% 25-50 artış, genişlemiş hücre çekirdeği, düzgün yuvarlatılmış şekil, çoğalma kaybı ve kültür çanağı yüzeyine yapışma gibi böcek hücrelerindeki yapısal değişiklikler ve hücre canlılığında azalmadır (Şekil 2. Baculovirus Enfekte ve enfekte olmayan Sf9 hücreleri). 3. Küçük ölçekli protein ekspresyon taraması ve virüs amplifikasyonu P1 baculovirüs stokları ile Sf9 hücrelerinin enfeksiyonu.NOT: Transfeksiyondan 4-5 gün sonra, ters mikroskop altında kontrol (transtransktuz) hücrelere kıyasla transkromfected hücrelerde enfeksiyon belirtileri belirgin olmalıdır. Hücre kültürü ortamına salgılanan ilk rekombinant baculovirüsler toplanmaya hazır olmalıdır. Tohum 2 x 105 serumsuz böcek medyasında katlanarak büyüyen Sf9 hücreleri, virüs hacmini yükseltmek için P1 virüsleri ile enfeksiyon için toplam 2 mL hacimde 24 kuyu plakalarının her kuyusuna (P2 virüslerinin üretilmesiyle sonuçlanır). Hücreleri plakalara pipetledikten sonra, eşit bir monolayer sağlamak için ileri geri hareket ederek plakaları hafifçe sallayın. Plakaları döndürmeyin, çünkü hücreler kuyunun ortasına kümelenir. Plakaya hücresel yapışmaya izin vermek için plakaları 27 °C’de en az 1 saat kuluçkaya bırakın. Protein ekspresyon taraması için P1 virüslerini enfekte etmek için 24 kuyu bloğunun her kuyusuna böcek serumsuz ortamda3,5-4 x 10 6 yoğunlukta 4 mL Sf9 hücresi dağıtın.NOT: 24 kuyulu plakaların ve 24 kuyulu blokların bir kuyusunun bir kuyuyu kontrol olarak etiketlenin ve SOI ararken enfekte ve enfekte olmayan hücrelerin karşılaştırılması için enfekte olmayan bir kontrol olarak kullanın. P1 virüslerinin aynı anda toplanmasına (adım 2.1.13), taze tohumlanmış Sf9 hücrelerinin enfeksiyonuna (adım 3.1.1) ve 24 kuyulu bloklardaki süspansiyon hücrelerinin enfeksiyonuna (adım 3.1.4) 150 μL P1 virüsü ile izin vermek için programlanabilir bir elektronik çok kanallı kullanın. Toplanan P1 viral stoklarının geri kalanını 17.970 x g’da15 dakika boyunca aşağı çevirin, mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve 4 °C’de karanlıkta saklayın. Eklenen P1 virüslerinin hücre monolayer üzerinde eşit bir dağılımını sağlamak için 24 kuyu plakalarını (adım 3.1.1) karşılıklı bir çalkalayıcı üzerinde hafifçe sallayın; kuluçka süresi boyunca bunu birkaç kez tekrarlayın. 24 kuyulu blokları enfekte Sf9 hücrelerinin süspansiyon kültürüyle (adım 3.1.4) bir airpore levha ile örtün. 24 kuyulu blokları 27 °C’de kuluçkaya yaslanın, 72-96 saat boyunca 245 rpm’de sallanın. P2 virüslü 24 kuyulu plakalarda (adım 3.1.1) ve ifade taraması için enfekte hücrelere sahip 24 kuyulu bloklarda (adım 3.1.4) enfeksiyon süresinden sonra 72-96 saat içinde SOI arayın.NOT: Sf9 hücrelerinin P1 virüsleri ile enfeksiyonundan 4-5 gün sonra, soi ters mikroskop altında enfekte olmayan kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında enfekte hücrelerde belirgin olmalıdır. P2 virüslerini 24 kuyu plakalarından toplayın, 17.970 x g’da15 dakika santrifüj, mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve 4 °C’de karanlıkta saklayın. Enfeksiyon sonrası 72-96 saat, % 70 etanol ile 24 kuyu blokları üzerine püskürtün, laminer akış başlığına getirin ve Trypan Blue boyama ile birkaç kuyudaki hücre yoğunluğunu ve canlılığını kontrol edin. Hücrelerde enfeksiyon belirtileri varsa ve canlılık Trypan Blue boyama ile değerlendirildiği gibi% 70-75’e yakınsa protein saflaştırmaya devam edin. 24 kuyulu blokları 15 dakika boyunca 4 °C’de 525 x g’da santrifüj ederek hücreleri peletin. Süpernatantı atın ve peletleri 25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, % 0.6 NP-40’dan oluşan 1 mL lizis tamponunda iyice yeniden askıya alın, 2 mM imidazol, %5 gliserol (v/v) ve 1x proteaz inhibitörü kokteyli (100x proteaz inhibitörü kokteyli aprotinin 0.25 mg/mL, leupeptin 0.25 mg/mL, pepstatin A 0.25 mg/mL;. E-64 0.25 mg/mL). Sonraki test saflaştırması için hücre süspansiyonu -80 °C’de saklayın (bkz. 3.2.2). 24 kuyu test-ekspresyon bloklarında donmuş hücre süspansiyonundan protein saflaştırma. Bağlama bloğunun montajı (Şekil 3). 96 derin kuyu bloğunun üstüne 3 çakışan parafilm katmanı yerleştirin (96 derin kuyu 2,4 mL). 96 derinliğindeki kuyu bloğunun üstüne 96 kuyu plakası (filtre mikro plakası, 96 kuyu, 25 μm ultra yüksek moleküler ağırlıklı polietilen membranlı polipropilen) yerleştirin. 96 kuyu derinliğindeki bloktan filtre plakasını kapatmak için uçları parafilme sabitlemek için filtre plakasını aşağı itin. Filtre plakasının her kuyusuna 50 μL önceden dengelenmiş Ni-NTA reçine bulamacı aktarın. Test ifade yordamı 24 kuyu bloğunda bulunan donmuş hücre süspansiyonu (adım 3.1.15) 5-10 dakika boyunca RT’deki bir su banyosuna yerleştirin, ardından 20 dakika boyunca 450 rpm’de sallayın. 24 kuyulu blokları 3.275 x g’da 15 dakika santrifüj edin. Çok kanallı pipet kullanarak, temizlenmiş lysates’i önceden dengelenmiş % 50 Ni-NTA reçine bulamacı (adım 3.2.1.4) içeren bir filtre plakasına aktarın ve filtre plakasını 96 kuyulu bir kapak paspası (96 kuyulu kapak paspası, kare kuyu ile kullanım için, 2 mL) ile kapatın.NOT: Kuluçka ve santrifüjleme adımları sırasında bağlama bloğunu bir arada tutmak için birkaç lastik bant kullanın. Ni-NTA reçinesi ile temizlenmiş lisatları kuluçkaya yatırmak için güvenli bağlama bloğunu 45-60 dakika boyunca soğuk bir odada bir rotatora yerleştirin. Kuluçkadan sonra, filtre plakasını dikkatlice kaldırın ve parafilm tabakasını 96 derinliğindeki kuyu bloğunun yüzeyinden çıkarın (adım 3.2.1.1). Filtre plakasını 96 derinliğindeki kuyu bloğunun üzerine geri yerleştirin ve güvenli bağlama bloğunu 235 x g’da 2 dakika döndürün. 25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, %5 gliserol ve 15 mM imidazolden oluşan 2 mL yıkama tamponu ile Ni-NTA reçine 2x yıkama bağı. Kalan sıvının tamamen çıkarılmasını sağlamak için 235 x g’da 5 dakika boyunca her seferinde yıkama tamponu ile bloğu aşağı çevirin. Filtre plakasını 10 μL 4x yükleme boyası içeren 96 kuyulu PCR plakasının üstüne aktarın. Filtre plakasının her kuyusuna 40 μL elüsyon tamponu (25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, %5 gliserol, 500 mM imidazol) ekleyin ve 5 dakika kuluçkaya yatırın. Proteinleri 10 dakika boyunca 235 x g’da 96 kuyulu PCR plakasına elute etmek için bloğu aşağı çevirin. 96 kuyulu PCR plakasını yüksek sıcaklığa dayanıklı musluk pedi ile kapatın ve 98 °C’de 3 dakika ısıtın. Protein merdiveninin yanındaki %4-20 SDS-PAGE jel üzerine standart Laemmli tamponunda 15 μL eluted protein numunesi yükleyin ve jeli SDS içeren standart çalışan tamponla çalıştırın. Jeli Coomassie mavisi ile lekelenin ve su ile lekeyi çözün. Büyük ölçekli üretim için en iyi ifade yapılarını tanımlamak için test ifadesinin sonuçlarını analiz edin. 4. Baculovirüs ile enfekte böcek hücrelerinin (SCBIIC) protein üretimi için preparatları Planlanan üretim süresinden 4 gün önce, katlanarak büyüyen Sf9 hücrelerini 2 x 106 hücre/mL’lik son hücre yoğunluğuna 125 mL / 250 mL / 500 mL’ye bölün %1 (v/v) son antibiyotik-antimycotic içeren 50 mL / 100 mL / 200 mL Böcek Serumsuz ortamda şaşkınlık ile Erlenmeyer cam sallama şişeleri. Uygun P2 virüslerinin 0.150 mL / 0.300 mL / 0.6 mL’lik kısmını ekleyin, enfekte olmuş hücreleri bir inç strokla yörüngesel bir çalkalayıcıda 165 rpm’de ve hücre bölünmesini yavaşlatmak için 25 °C daha düşük bir sıcaklıkta kuluçkaya yatırın. Enfeksiyon sonrası 4 gün içinde, soi için mikroskop altında hücreleri kontrol edin ve Trypan Blue lekesi ile doğrulanan hücre canlılığı% 70-75’e yakınsa üretime geçin. 5. Büyük ölçekli protein üretimi için Sf9 hücre preparatları Planlanan üretim süresinden 4 gün önce, büyük ölçekli protein üretimi için gerekli Sf9 hücrelerinin hacmini hesaplayın. Böcek Serumsuz Ortamda katlanarak büyüyen Sf9 hücrelerinin 2 L’si, 2,8 L Fernbach sallama şişelerinde 1 x 106 hücre /mL hücre yoğunluğuna. 27 °C’de şişeleri 150 rpm’de sallanarak kuluçkaya yasla.NOT: Sf9 hücre kültüründe bakteriyel kontaminasyonu önlemek için gentamisin kullanarak sırasıyla 10 μg/mL veya penisilin/streptomisin ile 50 U/mL ve 50 μg/mL’lik son konsantrasyonda kullanın. 6. Büyük ölçekli protein üretimi için Sf9 hücrelerinin SCBIIS ile enfeksiyonu Böcek Serumu Içermeyen Ortamda katlanarak büyüyen Sf9 hücrelerinin 2,5 L Tunair sallama şişelerinde veya 5 L reaktif şişelerde 4 x10 6 hücre/mL’lik son hücre yoğunluğuna bölün. Baculovirüs ile enfekte böcek hücresi (SCBIIC) süspansiyon kültürünün 10-12 mL / L’sini ekleyin. Sf9 hücrelerinin enfekte kültürünü 72-96 saat boyunca 25 °C’nin daha düşük sıcaklığında (hücre bölünmesini yavaşlatmak için) 145 rpm’lik bir çalkalayıcı üzerinde kuluçkaya yatırın. Enfeksiyon sonrası 72 saatte, mikroskop altında soi için hücreleri kontrol edin ve hücre canlılığını değerlendirin. Genellikle, enfeksiyon sonrası yaklaşık 72 saat sonra, Sf9 hücrelerinin canlılığı% 70-75’e düşer (Trypan Blue lekesi kullanılarak ölçülür). Hasat, 1 L polipropilen şişedeki Sf9 hücrelerini 4 °C’de 15 dakika boyunca 900 x g’da santrifüjleme ile hasat edin. Üretim hücresi kültürünün 1 L’sinden toplanan hücre peletini 20-25 mL 1x PBS ile hafifçe döndürerek yeniden biriktirin ve 50 mL konik tüplere aktarın. Hücre süspansiyonu 900 x g’da 15 dakika boyunca aşağı çevirin ve PBS çözeltisini atın. Yıkanmış hücre peletini süspansiyon tamponunun 20-25 mL’si (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, % 5 gliserol, 1x proteaz inhibitörü kokteyli) ve sıvı nitrojende flaş dondurma ile yeniden biriktirin; saflaştırmaya kadar −80 °C’de saklayın.NOT: PRMT’ler için saflaştırma prosedürleri SGC yayınlanan6makalesinde ayrıntılı olarak açıklanmıştır.