Производство рекомбинантных белков PRMT с использованием векторной системы экспрессии бакуловируса

ПРИМЕЧАНИЕ: Обзор этапов протокола BEVS приведен на рисунке 1. 1. Генерация рекомбинантной бакмидной ДНК Подготовка селективных пластин агара LB для трансформации DH10Bac Подготовьте агаровые пластины LB, содержащие: 50 мкг/мл канамицина, 7 мкг/мл гентамицина, 10 мкг/мл тетрациклина, 200 мкг/мл Bluo-gal и 40 мкг/мл IPTG для выбора трансформантов DH10Bac. Взвесьте 25 г предварительно смешанный бульон LB и 13 г бакто-агара и поместите в колбу 2 л. Доведите объем до 1 л с дистиллированной водой и автоклавом в течение 15-30 мин при 121 °C. Установите водяную баню при 50 °C и охладите раствор автоклавного агара на водяной бане в течение 40-60 минут до его охлаждения до 50-55 °C. К охлаждаемой основе добавляют гентамицин до конечной концентрации 7 мкг/мл, канамицин до конечной концентрации 50 мкг/мл, тетрациклин до конечной концентрации 10 мкг/мл, Блюо-гал до конечной концентрации 200 мкг/мл и ИПТГ до конечной концентрации 40 мкг/мл. Смешайте раствор агара и аликвоту по 7-10 мл среды с каждой пластиной 60 мм с помощью пипетки 50 мл. Дайте плитам постоять при комнатной температуре (2 ч) для затвердевать. Инвертировать, заворачивать и хранить при 4 °C. Пластины, содержащие антибиотики, стабильны до 4 недель. Превращение плазмиды в dh10Bac E. coli компетентные клетки Рассчитайте необходимый объем грамотных ячеек. Разморозить грамотные клетки на льду, осторожно раскрутить и повторно суспендируйте обратно нежным постукиванием. Используйте 12-канальный пипетку для дозирования 4 мкл клеток в каждую скважину 96-скважинной ПЦР-пластины. Добавьте ~ 0,3-0,5 мкг рекомбинантной плазмидной ДНК к компетентным клеткам и аккуратно перемешайте постукиванием. Инкубировать смесь на льду в течение 10-15 мин. Тепловой удар смеси в ПЦР-машине при 42 °C в течение 45 с. Охладить на льду в течение 2 мин. Дозировать по 0,5 мл soc-среды в каждую скважину из 96 блоков скважин (скважина глубиной 96 2,4 мл). Используйте 12-канальную пипетку для переноса преобразованной бактериальной суспензии в соответствующий колодец блока и накройте его листом воздушной поры. Поместите блок в встряхивательный инкубатор при 37 °C со средним перемешиванием (205 об/мин) в течение 4-5 ч. Равномерно распределите 30-50 мкл культуры по поверхности агаровой пластины LB с помощью стерильных стеклянных шариков. Храните остальную часть культуры при 4 °C. Инкубируют пластины при 37 °C до тех пор, пока не будет различим цвет сине-белых колоний (40-48 ч). Откажитесь от культуры, когда на тарелке получится достаточно белых, крупных колоний. Чтобы гарантировать, что белые колонии содержат только рекомбинантную ДНК bacmid, повторно проложите одну изолированную белую колонию на свежие пластины агара LB, содержащие антибиотики, bluo-gal и IPTG для проверки фенотипа. Инкубировать в течение 48 ч при 37 °C. Выберите одну проверенную белую колонию из повторно расчищеной пластины для извлечения рекомбинантной днк bacmid. Выделение рекомбинантной бакмидной ДНК Инокулируют одну изолированную белую колонию в 3 мл среды LB, дополненной 50 мкг/мл канамицина, 7 мкг/мл гентамицина и 10 мкг/мл тетрациклина в 24-скважинных блоках (24-скважинные блоки с круглым дном) и покрывают листом воздушной поры. Растите при 37 °C в течение ночи с встряхиванием при 250 об/мин. Центрифугировать 24-скважинные блоки при 2 100 х г в течение 10 мин. Декантируйте супернатант, переверните блок и осторожно постучите по абсорбирующей папиросной бумаге. Добавьте 250 мкл раствора 1 (раствор для повторного суспензии клеток) в каждую скважину. Запечатайте блоки ленточными прокладками или любыми другими уплотнительными пленками и поместите их на встряхивающую платформу при 75 об/мин в течение 5-10 мин. Проверьте каждую скважину, чтобы обеспечить надлежащий лизис клеток, и при необходимости повторно суспендируйте, используя наконечник 1 мл. Добавляют 250 мкл раствора 2 (раствор клеточного лизиса) в каждую скважину, герметизируют блоки и помещают на встряхивающую платформу при 75 об/мин в течение 30 с (во избежание перекрестного загрязнения образцов не инвертировать 24-скважинные блоки), инкубируя при комнатной температуре в течение 4 мин. Добавьте 250 мкл раствора 3 (нейтрализующего раствора), запечатайте блоки и поместите на встряхивательную платформу со скоростью 75 об/мин в течение 30 с. Образуется густой белый осадок белка и геномной ДНК E. coli. Поместите образец на лед на 10-15 мин. Центрифуга в течение 60 мин при 2,100 х г при 4 °C плотно гранулирует белый осадочный материал. Во время центрифугирования маркируют новую микроцентрифужную трубку и добавляют 0,8 мл абсолютного изопропанола. Осторожно перенесите супернатант в пробирку, содержащую изопропанол, избегая любого белого осажденного материала. Перемешайте, осторожно перевернутый тюбик несколько раз, а затем поместите на лед на 5-10 минут. На этом этапе образец может храниться при -20 °C в течение ночи. Центрифугировать образец в течение 15 мин при 14 000 х г при 4 °C. Удалите супернатант и добавьте 0,5 мл 70% этанола в каждую пробирку. Переверяйте трубку несколько раз, чтобы промыть гранулу. Центрифуга в течение 5 мин при 14 000 х г при комнатной температуре. (Опционально: повторная стирка) Занесите образцы внутрь ламинарного проточного капота, чтобы обеспечить стерильность препарата плазмиды и удалить как можно больше супернатанта.ПРИМЕЧАНИЕ: Гранула может сместиться со дна трубки, поэтому внимательно следите за гранулой при выбросе супернатанта. Высушите гранулу на воздухе внутри ламинарной проточной вытяжки в течение 15 – 20 мин и растворите ДНК в 50 мкл фильтрованного буфера элюирования, 10 мМ Tris-Cl, рН 8,5 (убедитесь, что гранулы не пересушены). Поскольку рекомбинантная днк бакмида имеет размер более 135 кб, чтобы избежать сдвига ДНК, растворите гранулу мягким постукиванием. Чтобы проверить наличие гена, представляющий интерес, в ДНК бакмида, настройте реакционную смесь ПЦР в 96-скважинную ПЦР-пластину. Готовят смесь ПЦР следующим образом: 1 мкл буфера, 0,2 мкл (по 10 мМ) дНТП, 0,1 мкл ДНК-полимеразы Taq, 0,1 мкл (25 мкМ) прямого и обратного праймеров (BACV2FWD: tattccggattattcataccg; BACV2REV: ctctacaaatgtggtatggggc), 1 мкл ДНК бакмида и 8 мкл воды. Выполняют амплификацию генов-мишеней с начальной денатурацией в течение 2 мин при 95 °C, затем 25 циклов 94 °C в течение 30 с, 55 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 1 мин/кб. Прекращают реакцию после окончательного продления в течение 7 мин при 72 °C. Электрофорезом анализируют 10 мкл продукта амплификации на 1% (мас./об.) агарозном геле, содержащем раствор для окрашивания нуклеиновой кислотой. Храните проверенные ДНК bacmid при 4 °C. 2. Генерация рекомбинантных бакуловирусных запасов ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте экспоненциально растущие клетки Sf9 с жизнеспособностью 95% или более для любого этапа протокола экспрессии бакуловируса, включая трансфекцию клеток для генерации бакуловируса, амплификацию объема бакуловируса, скрининг экспрессии белка и производство белка. Трансфекция клеток Sf9 с ДНК Bacmid и трансфекционными реагентами (T.R.), такими как JetPrime или X-tremeGENE 9.ПРИМЕЧАНИЕ: Окрашивание Trypan Blue и гемоцитометр могут быть использованы для определения количества жизнеспособных клеток и % жизнеспособности клеток. Нежизные клетки занимают пятно и кажутся синими под микроскопом, в то время как жизнеспособные клетки остаются незапятнанными. Чтобы рассчитать % жизнеспособности клеток, получается общее количество клеток (неокрашивых и окрашенных), а количество жизнеспособных клеток делится на общее количество клеток и умножается на 100. Разбавьте экспоненциально растущие клетки Sf9 до конечной плотности клеток 4 х 105 клеток/мл в сывороточных свободных от насекомых средах и вылейте в резервуар стерильных реагентов. Используйте программируемую многоканальную пипетку для засева 0,5 мл разбавленных ячеек Sf9 в каждую скважину 24-скважинной пластины. Пометьте один колодец пластины как контрольный (нетрансфессированный) и используйте его в качестве контроля для сравнения трансфекционных и нетрансфекционных клеток для оценки потенциальных признаков инфекций. После засева клеток в пластины осторожно раскачивайте пластины вперед и назад несколько раз, чтобы обеспечить равномерный монослой клеток. Не закручивайте пластины, потому что клетки будут группироваться в центре колодца. Инкубируют пластины при 27 °C в течение, по меньшей мере, 1 ч, чтобы обеспечить прикрепление клеток к пластинам культуры. Хорошо перемешать флакон трансфекционного реагента. Для каждой трансфекции добавляют 2 мкл трансфекционного реагента к 100 мкл трансфекционного буфера. Также можно использовать любую другую необечаемую среду для насекомых. Нанесите разбавленный трансфекционный реагент в резервуар стерильного реагента и осторожно перемешайте в течение 10 с. Используя 12-канальный пипетку, переведите 102 мкл разбавленного трансфекционного реагента в стерильную 96-микролуночную пластину. Перенесите 10 мкл раствора рекомбинантной бакмидной ДНК 0,2 мкг/мкл в соответствующий колодец 96-скважинной микролуночной пластины и перемешайте, осторожно встряхнув (постукивая) пластину с боков. Инкубировать трансфекционную смесь в течение 15-20 мин, чтобы обеспечить образование комплекса. Используя регулируемую 6-канальный пипетку, предназначенную для переноса между 96- и 24-скважинными пластинами, добавляют трансфекционную смесь на ячейки по каплям в соответствующие колодцы трансфекционных пластин и инкубируют в течение 4-5 ч при 27 °C. Осторожно раскачивайте пластины вперед и назад несколько раз в течение времени инкубации, чтобы обеспечить равномерное распределение трансфекционной смеси по монослою ячейки. Через 4-5 ч после трансфекции добавляют 1,5 мл безымянного от насекомых среды, дополненного 10% (v/v) финалом инактивированной фетальной фетальной бычий сыворотки и антибиотико-антимикотической до 1% (v/v) конечного объема (100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,25 мкг/мл амфотерицина B). Инкубируют клетки в инкубаторе при 27 °C в течение 72-96 ч. Осторожно раскачивая трансфекционные пластины один раз в день, когда это возможно. Ищите признаки инфекции (SOI), проявивающиеся в трансфектированных клетках через 72-96 ч после трансфекции(рисунок 2). Имейте в виду, что трансфектированные клетки начнут продуцировать вирус и в дальнейшем заразят культуру; таким образом, ищите признаки инфекции.ПРИМЕЧАНИЕ: Признаками инфекции являются структурные изменения в клетках насекомых, такие как увеличение диаметра клеток на 25-50%, увеличение ядер клеток, равномерно округлая форма, потеря пролиферации и прилипания к поверхности чашки культуры, а также снижение жизнеспособности клеток(рисунок 2. Бакуловирус Инфицированные и неинфицированные клетки Sf9). 3. Маломасштабный скрининг экспрессии белка и амплификация вируса Инфицирование клеток Sf9 бакуловирусными запасами P1.ПРИМЕЧАНИЕ: через 4-5 дней после трансфекции признаки инфекции должны быть очевидны в трансфектированных клетках по сравнению с контрольными (нетрансфектными) клетками под инвертированной микроскопией. Исходные рекомбинантные бакуловирусы, секретируемые в культурную среду клеток, должны быть готовы к сбору. Семена 2 х 105 экспоненциально растущих клеток Sf9 в сывороточных средах насекомых в каждую скважину из 24-скважинных пластин в общем объеме 2 мл для заражения вирусами P1 для усиления объема вируса (в результате чего генерируются вирусы P2). После пипетки ячеек в пластины аккуратно раскачивайте пластины, используя движение вперед и назад, чтобы обеспечить ровный монослой. Не закручивайте пластины, потому что клетки будут группироваться в центре колодца. Инкубируют пластины при 27 °C в течение не менее 1 ч, чтобы обеспечить клеточное прилипастание к пластине. Дозировать 4 мл клеток Sf9 при плотности 3,5-4 х 106 в среде, свободной от насекомых, в каждую скважину из 24-скважинных блоков для заражения вирусами P1 для скрининга экспрессии белка.ПРИМЕЧАНИЕ: Пометьте одну скважину из 24-скважинных пластин и 24-скважинных блоков в качестве контрольной и используйте в качестве неинфицированного контроля для сравнения инфицированных и неинфицированных клеток при поиске SOI. Используйте программируемую электронную многоканальность, позволяющую одновременный сбор вирусов P1 (этап 2.1.13), заражение свежезасеянных клеток Sf9 (этап 3.1.1) и заражение клеток суспензии в 24-скважинных блоках (этап 3.1.4) 150 мкл вирусов P1. Открутите остальные собранные вирусные запасы P1 в течение 15 мин при 17 970 х г,переложите их в микроцентрифужные трубки и храните в темноте при 4 °C. Аккуратно раскачивают 24-скважинные пластины (этап 3.1.1) на поршневой шейкер для обеспечения равномерного распределения добавленных вирусов P1 по клеточным монослою; повторите это несколько раз во время инкубации. Накрыть 24-скважинные блоки суспензией культуры инфицированных клеток Sf9 (этап 3.1.4) листом воздушной полотнища. Инкубировать 24-скважинные блоки при 27 °C, встряхивая при 245 об/мин в течение 72-96 ч. Ищите SOI в течение 72-96 ч после заражения в 24-скважинных пластинах с вирусами P2 (шаг 3.1.1) и в 24-скважинных блоках (этап 3.1.4) с инфицированными клетками для скрининга экспрессии.ПРИМЕЧАНИЕ: через 4-5 дней после заражения клеток Sf9 вирусами P1 SOI должен проявляться в инфицированных клетках по сравнению с неинфицируемыми контрольными клетками под инвертируемым микроскопом. Соберите вирусы P2 из 24-скважинных пластин, центрифугируют в течение 15 мин при 17 970 х г,переложат их в микроцентрифужные трубки и хранят в темноте при 4 °C. Через 72-96 ч после заражения распылите на 24-скважинные блоки 70% этанола, внесите в ламинарную вытяжку и проверьте плотность и жизнеспособность клеток в нескольких скважинах с помощью окрашивания Trypan Blue. Приступают к очистке белка, если клетки имеют признаки инфекции и жизнеспособность близка к 70-75%, как оценивается окрашиванием Trypan Blue. Гранулировать ячейки центрифугированием 24-скважинных блоков при 525 х г при 4 °C в течение 15 мин. Откажитесь от супернатанта и тщательно повторно суспендируем гранулы в 1 мл лизисного буфера, включающего 25 мМ Tris pH 8,0, 300 мМ NaCl, 0,6 % NP-40, 2 мМ имидазола, 5% глицерина (v/v) и 1x коктейль ингибитора протеазы (коктейль ингибитора протеазы 100x содержит апротинин 0,25 мг/мл, леупептид 0,25 мг/мл, пепстатин А 0,25 мг/мл; Е-64 0,25 мг/мл). Хранить клеточную суспензию при -80°С для последующей тестовой очистки (см. раздел 3.2.2). Очистка белка из замороженной клеточной суспензии в 24-скважинных тест-экспрессионных блоках. Сборка связующего блока(рисунок 3). Поместите 3 перекрывающихся слоя парапленки на верхнюю часть блока скважины глубиной 96 (скважина глубиной 96 2,4 мл). Поместите фильтрующая пластину с 96 скважинами (фильтрующая микропластилина, 96-скважинный, полипропилен с 25-мкм сверхвысокомолекулярной полиэтиленовой мембраной) поверх блока скважины глубиной 96. Опуститесь вниз фильтрующей пластиной, чтобы закрепить наконечники в парапленке, чтобы изолировать фильтрующей пластину от блока глубиной 96 скважин. Переложите 50 мкл предварительно уравновешенной 50% смолы Ni-NTA в каждую скважину фильтрующей пластины. Процедура тестового выражения Поместите замороженную клеточную суспензию (этап 3.1.15), присутствуют в 24-скважинных блоках, на водяную баню при RT в течение 5-10 мин, затем встряхните при 450 об/мин в течение 20 мин. Центрифугировать 24-скважинные блоки при 3 275 х г в течение 15 мин. Используя многоканальную пипетку, перенесите очищенные лизаты в фильтровальную пластину, содержащую 50 мкл предварительно уравновешенной 50% смолы Ni-NTA (этап 3.2.1.4) и запечатайте фильтрующей пластиной с помощью 96-скважинного колпачкового мата (96-скважинный колпачок, для использования с квадратной скважиной, 2 мл).ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте несколько резинок, чтобы удерживать блок связывания вместе во время этапов инкубации и центрифугирования. Поместите защищенный связующий блок на 45-60 мин в ротатор в холодном помещении для инкубации очищенных лизатов с смолой Ni-NTA. После инкубации осторожно поднимите фильтрующий лист и удалите слой парапленки с поверхности блока скважины глубиной 96 (этап 3.2.1.1). Поместите фильтрующую пластину обратно на блок скважин глубиной 96 и раскрутите защищенный блок связывания в течение 2 мин при 235 х г. Промывная связь Ni-NTA смолы 2x с 2 мл промывочного буфера, содержащего 25 мМ Tris pH 8,0, 300 мМ NaCl, 5% глицерин и имидазол 15 мМ. Отращивание блока с буфером промывки каждый раз в течение 5 мин при 235 х г, чтобы обеспечить полное удаление остаточной жидкости. Переложите фильтрующей пластины на верхнюю часть 96-скважинной ПЦР-пластины, содержащей 10 мкл 4-кратного загрузочного красителя. Добавьте 40 мкл элюдионного буфера (25 мМ Tris pH 8,0, 300 мМ NaCl, 5% глицерина, 500 мМ имидазола) в каждую скважину фильтрующей пластины и инкубируют в течение 5 мин. Вращайте блок, чтобы элюировать белки в 96-скважинную ПЦР-пластину при 235 х г в течение 10 мин. Запечатайте 96-скважинную ПЦР-пластину с помощью термостойкой чечетки и нагревайте при 98 °C в течение 3 мин. Загрузите 15 мкл элюированных белковых образцов в стандартный буфер Laemmli на 4-20% гель SDS-PAGE рядом с белковой лестницей и запустите гель со стандартным буфером, содержащим SDS. Окрась гель синим цветом Coomassie и обезболить водой. Анализируйте результаты тестового выражения, чтобы определить наилучшие выразимые конструкции для крупномасштабного производства. 4. Препараты бакуловирус-инфицированных клеток насекомых (SCBIIC) для производства белка За 4 дня до запланированного времени производства разделить экспоненциально растущие клетки Sf9 до конечной плотности клеток 2х 10 6 клеток/мл на 125 мл / 250 мл / 500 мл стеклянные колбы Эрленмейера с перегородками в 50 мл / 100 мл / 200 мл среды без насекомых, содержащей 1% (v/v) конечный антибиотик-антимикотический. Добавьте 0,150 мл / 0,300 мл / 0,6 мл соответствующих вирусов P2, инкубирует инфицированные клетки со скоростью 165 об/мин на орбитальном шейкере с однодюймовым ходом и при более низкой температуре 25 °C для замедления деления клеток. Через 4 дня после заражения проверьте клетки под микроскопом на SOI и приступайте к производству, если жизнеспособность клеток, подтвержденная пятном Trypan Blue, близка к 70-75%. 5. Клеточные препараты Sf9 для крупномасштабного производства белка За 4 дня до запланированного времени производства рассчитайте необходимый объем клеток Sf9 для крупномасштабной продуцировании белка. Посейте 2 л экспоненциально растущих клеток Sf9 в среде без сыворотки насекомых до плотности клеток 1 х 106 клеток / мл в 2,8 л колбы Фернбаха. Инкубировать колбы при 27 °C с встряхиванием при 150 об/мин.ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения бактериального загрязнения в культуре клеток Sf9 используют гентамицин до конечной концентрации 10 мкг/мл или пенициллин/стрептомицин до 50 Ед/мл и 50 мкг/мл соответственно. 6. Инфицирование клеток Sf9 SCBIIS для крупномасштабного производства белка Разделите 2 л или 4 л экспоненциально растущих клеток Sf9 в среде без сыворотки насекомых до конечной плотности клеток 4 x 106 клеток/мл в колбах Tunair объемом 2,5 л или бутылках с реагентами объемом 5 л. Добавьте 10-12 мл/л культуры суспензии клеток насекомых, инфицированных бакуловирусом (SCBIIC). Инкубируют инфицированную культуру клеток Sf9 на шейкере со скоростью 145 об/мин при более низкой температуре 25 °C (для замедления деления клеток) в течение 72-96 ч. Через 72 ч после заражения проверьте клетки под микроскопом на SOI и оцените жизнеспособность клеток. Обычно, примерно через 72 ч после заражения, жизнеспособность клеток Sf9 падает до 70%-75% (измеряется с помощью пятна Trypan Blue). Собирайте зараженные клетки Sf9 в полипропиленовой бутылке объемом 1 л путем центрифугирования при 900 х г в течение 15 мин при 4 °C. Повторно суспендируют клеточную гранулу, собранную из 1 л культуры продуцированной клетки с 20-25 мл 1x PBS, путем осторожного закручивание и переноса в конические трубки объемом 50 мл. Открутите клеточную суспензию при 900 х г в течение 15 мин и выбросьте раствор PBS. Повторно суспендировать промытую ячейку гранулы 20-25 мл суспензионного буфера (20 мМ Tris-HCl pH 8,0, 500 мМ NaCl, 5% глицерин, 1x ингибитор протеазы коктейль) и мгновенно заморозить в жидком азоте; хранить при −80 °C до очистки.ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры очистки PRMT были подробно описаны в опубликованном SGC документе6.