Produzione di proteine PRMT ricombinanti utilizzando il baculovirus Expression Vector System

NOTA: la panoramica dei passaggi del protocollo BEVS è descritta nella figura 1. 1. Generazione di un DNA bacmid ricombinante Preparazione di piastre selettive agar LB per la trasformazione DH10Bac Preparare piastre di agar LB contenenti: 50 μg/mL di kanamicina, 7 μg/mL di gentamicina, 10 μg/mL tetraciclina, 200 μg/mL Bluo-gal e 40 μg/mL IPTG da selezionare per i trasformatori DH10Bac. Pesare 25 g di brodo LB premiscelato e 13 g di Bacto Agar e mettere in pallone da 2 L. Portare il volume a 1 L con acqua distillata e autoclave per 15-30 min a 121 °C. Impostare un bagno d’acqua a 50 °C e raffreddare la soluzione di agar autoclavato nel bagno d’acqua per 40-60 minuti fino a quando non viene raffreddato fino a 50-55 °C. Alla soluzione raffreddata aggiungere gentamicina ad una concentrazione finale di 7 μg/mL, kanamicina ad una concentrazione finale di 50 μg/mL, tetraciclina ad una concentrazione finale di 10 μg/mL, Bluo-gal ad una concentrazione finale di 200 μg/mL e IPTG ad una concentrazione finale di 40 μg/mL. Mescolare la soluzione di agar e aliquota 7-10 mL del mezzo a ciascuna piastra da 60 mm utilizzando una pipetta da 50 mL. Lasciare riposare le piastre a temperatura ambiente (2 ore) per indurirsi. Invertire, avvolgere e conservare a 4 °C. Le piastre contenenti antibiotici sono stabili fino a 4 settimane. Trasformazione del plasmide in cellule competenti DH10Bac E. coli Calcolare il volume richiesto di celle competenti. Scongelare le cellule competenti sul ghiaccio, spingi delicatamente verso il basso e rimospendi indietro toccando delicatamente. Utilizzare una pipetta a 12 canali per erogare 4 μL delle cellule in ogni pozzo della piastra PCR a 96 po’ . Aggiungere ~ 0,3-0,5 μg di DNA plasmide ricombinante alle cellule competenti e mescolare delicatamente toccando. Incubare la miscela sul ghiaccio per 10-15 minuti. Shock termico la miscela in una macchina PCR a 42 °C per 45 s. Raffreddare sul ghiaccio per 2 minuti. Distribuire 0,5 mL di SOC medio ad ogni pozzo dei blocchi da 96 po ‘(pozzo profondo 96 2,4 mL). Utilizzare una pipetta a 12 canali per trasferire la sospensione batterica trasformata nel pozzo corrispondente del blocco e coprirla con un foglio di airpore. Posizionare il blocco in un’incubatrice di scuotimento a 37 °C con agitazione media (205 giri/min) per 4-5 ore. Distribuire uniformemente 30-50 μL della coltura sulla superficie della piastra di agar LB utilizzando perline di vetro sterili. Conservare il resto della coltura a 4 °C. Incubare le piastre a 37 °C fino a quando il colore delle colonie blu /bianche è percepibile (40-48 h). Scartare la coltura quando si ottengono abbastanza colonie bianche e grandi sul piatto. Per garantire che le colonie bianche contengano solo DNA bacmido ricombinante, ristriare una colonia bianca isolata su piastre di agar LB fresche contenenti antibiotici, bluo-gal e IPTG per verificare il fenotipo. Incubare per 48 ore a 37 °C. Scegli una colonia bianca verificata da una piastra ristriata per l’estrazione del DNA bacmidi ricombinante. Isolare il DNA bacmidi ricombinante Inoculare una singola colonia bianca isolata in 3 mL di mezzo LB integrata con 50 μg/mL di kanamicina, 7 μg/mL di gentamicina e 10 μg/mL tetraciclina in blocchi da 24 po'(24-ben blocchi di fondo rotondo) e coprire con un foglio di airpore. Crescere a 37 °C durante la notte con tremori a 250 giri/min. Centrifuga i blocchi da 24 pozzi a 2.100 x g per 10 minuti. Decantare il supernatante, invertire il blocco e toccare delicatamente su una carta velina assorbente. Aggiungere 250 μL della soluzione 1 (soluzione di resopensione cellulare) ad ogni pozzo. Sigillare i blocchi con cuscinetti a nastro o qualsiasi altra pellicola di tenuta e posizionarli su una piattaforma di scuotimento a 75 giri/min per 5-10 minuti. Controllare ogni bene per garantire una corretta lisi cellulare e, se necessario, rimescolare, utilizzando una punta da 1 mL. Aggiungere 250 μL della soluzione 2 (soluzione di lisi cellulare) ad ogni pozzo, sigillare i blocchi e posizionare su una piattaforma di scuotimento a 75 giri/min per 30 s (per evitare la contaminazione incrociata dei campioni, non invertire blocchi da 24 pozzetti) incubando a temperatura ambiente per 4 minuti. Aggiungere 250 μL di soluzione 3 (soluzione di neutralizzazione), sigillare i blocchi e posizionare sulla piattaforma di scuotimento a 75 giri/min per 30 s. Si formerà uno spesso precipitato bianco di proteine e DNA genomico E. coli. Posizionare il campione sul ghiaccio per 10-15 minuti. Centrifugare per 60 min a 2.100 x g a 4 °C per pelletare saldamente il materiale precipitato bianco. Durante la centrifugazione, etichettare un nuovo tubo di microcentrifugo e aggiungere 0,8 ml di isopropanolo assoluto. Trasferire delicatamente il supernatante sul tubo contenente isopropanolo, evitando qualsiasi materiale precipitato bianco. Mescolare invertendo delicatamente il tubo alcune volte e quindi mettere sul ghiaccio per 5-10 minuti. In questa fase, il campione può essere conservato a -20 °C durante la notte. Centrifugare il campione per 15 min a 14.000 x g a 4 °C. Rimuovere il supernatante e aggiungere 0,5 ml di 70% di etanolo a ciascun tubo. Invertire il tubo più volte per lavare il pellet. Centrifuga per 5 min a 14.000 x g a temperatura ambiente. (Facoltativo: lavaggio ripetuto) Portare i campioni all’interno della cappa di flusso laminare per garantire la sterilità della preparazione del plasmide e rimuovere il più possibile il supernatante.NOTA: Il pellet può essere sganciato dal fondo del tubo, quindi guarda attentamente il pellet quando scarti il supernatante. Asciugare all’aria il pellet all’interno della cappa di flusso laminare per 15-20 minuti e sciogliere il DNA in 50 μL di tampone di eluizione filtrato, 10 mM Tris-Cl, pH 8,5 (assicurarsi che i pellet non siano asciugati in modo troppo secco). Poiché il DNA bacmidi ricombinante è di dimensioni superiori a 135 kb, per evitare la tranciatura del DNA, sciogliere il pellet con una maschiatura delicata. Per verificare la presenza del gene di interesse nel DNA bacmid, impostare il mix di reazione PCR in una piastra PCR da 96 po ‘. Preparare la miscela PCR come segue: 1 μL di tampone, 0,2 μL (10 mM ciascuno) di dNTP, 0,1 μL di Taq DNA polimerasi, 0,1 μL (25 μM) di primer avanti e indietro (BACV2FWD: tattccggattattcataccg; BACV2REV: ctctacaaatgtggtatggc), 1 μL di DNA bacmide e 8 μL di acqua. Eseguire l’amplificazione dei geni bersaglio con denaturazione iniziale per 2 min a 95 °C, seguita da 25 cicli di 94 °C per 30 s, 55 °C per 30 s e 72 °C per 1 min/kb. Terminare la reazione dopo un’estensione finale per 7 min a 72 °C. Analizzare 10 μL del prodotto di amplificazione su un gel di agarosio 1% (w/v) contenente soluzione di colorazione dell’acido nucleico per elettroforesi. Conservare i DNA bacmidi verificati a 4 °C. 2. Generazione di scorte di baculovirus ricombinante NOTA: Utilizzare cellule Sf9 in crescita esponenziale con una vitalità del 95% o superiore per qualsiasi fase del protocollo di espressione del baculovirus, inclusa la trasfezione cellulare per la generazione di baculovirus, l’amplificazione del volume del baculovirus, lo screening dell’espressione proteica e la produzione di proteine. Trasfezione di cellule Sf9 con DNA Bacmid e reagenti di trasfezione (T.R.) come JetPrime o X-tremeGENE 9.NOTA: La colorazione Trypan Blue e un emocitometro possono essere utilizzati per determinare il numero di cellule vitali e la vitalità delle cellule%. Le cellule non vitali prendono la macchia e appaiono blu al microscopio mentre le cellule vitali rimangono non macchiate. Per calcolare la vitalità delle cellule % , si ottiene un conteggio totale delle celle (non macchiato e macchiato) e il numero di celle vitali viene diviso per il numero totale di celle e moltiplicato per 100. Diluire le cellule Sf9 in crescita esponenziale a una densità cellulare finale di 4 x 105 cellule /mL in mezzi di insetti liberi dal siero e versare nel serbatoio del reagente sterile. Utilizzare una pipetta multicanale programmabile per seminare 0,5 mL delle celle Sf9 diluite in ogni pozzo di una piastra da 24 porri. Etichettare un pozzo della piastra come controllo (non trasfetto) e utilizzarlo come controllo per confrontare le cellule trasfette e non trasfette per valutare i potenziali segni di infezioni. Dopo aver seminato le cellule nelle piastre, scuotere delicatamente le piastre avanti e indietro più volte per garantire un monostrato uniforme di cellule. Non ruotare le piastre perché le cellule si raggruppano al centro del pozzo. Incubare le piastre a 27 °C per almeno 1 h per consentire l’attacco cellulare alle piastre di coltura. Mescolare bene il flaconcino reagente di trasfezione. Per ogni trasfezione, aggiungere 2 μL del reagente di trasfezione a 100 μL del buffer di trasfezione. Può essere utilizzato anche qualsiasi altro mezzo di insetto non soppresso. Depositare il reagente di trasfezione diluito in un serbatoio di reagente sterile e mescolare delicatamente per 10 s. Utilizzando una pipetta a 12 canali, trasferire 102 μL del reagente di trasfezione diluito in una piastra sterile a 96 microwell. Trasferire 10 μL di una soluzione da 0,2 μg/μL di DNA bacmidico ricombinante nel pozzo corrispondente di una piastra microwell da 96 pozzi e mescolare scuotendo delicatamente (toccando) la piastra dai lati. Incubare la miscela di trasfezione per 15-20 minuti per consentire una formazione complessa. Utilizzando una pipetta regolabile a 6 canali progettata per il trasferimento tra piastre da 96 a 24 poggia, aggiungere la miscela di trasfezione sulle celle dropwise nei pozzi corrispondenti delle piastre di trasfezione e incubare per 4-5 h a 27 °C. Scuotere delicatamente le piastre avanti e indietro più volte durante il tempo di incubazione per garantire la distribuzione uniforme della miscela di trasfezione sul monostrato cellulare. 4-5 ore dopo la trasfezione, aggiungere 1,5 mL di mezzo privo di siero di insetti integrato con il 10% (v/v) finale di siero bovino fetale inattivato dal calore e antibiotico-antimicotico all’1% (v/v) volume finale (100 unità/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina e 0,25 μg/mL di ampotericina B). Incubare le cellule in un incubatore di 27 °C per 72-96 ore. Scuotere delicatamente le piastre di trasfezione una volta al giorno quando possibile. Cercare i segni di infezione (SOI), evidenti nelle cellule trasfette a 72-96 ore dopo la trasfezione (Figura 2). Tieni presente che le cellule trasfette inizieranno a produrre il virus e infetteranno ulteriormente la coltura; quindi, cerca i segni dell’infezione.NOTA: I segni di infezione sono cambiamenti strutturali nelle cellule degli insetti, come un aumento del 25-50% del diametro della cellula, nuclei cellulari ingranditi, forma uniformemente arrotondata, perdita di proliferazione e aderenza alla superficie del piatto di coltura, nonché una diminuzione della vitalità cellulare (Figura 2. Baculovirus Cellule Sf9 infette e non infette). 3. Screening dell’espressione proteica su piccola scala e amplificazione del virus Infezione delle cellule Sf9 con stock di baculovirus P1.NOTA: 4-5 giorni dopo la trasfezione, i segni di infezione dovrebbero essere evidenti nelle cellule trasfette rispetto alle cellule di controllo (non trasfette) al microscopio invertito. I baculovirus ricombinanti iniziali secreti nel mezzo di coltura cellulare dovrebbero essere pronti per essere raccolti. Seme 2 x 105 cellule Sf9 in crescita esponenziale in mezzi di insetti senza siero in ogni pozzo delle piastre a 24 po ‘in un volume totale di 2 mL per l’infezione da virus P1 per amplificare il volume del virus (con conseguente generazione dei virus P2). Dopo aver pipettato le cellule nelle piastre, scuotere delicatamente le piastre, usando il movimento avanti e indietro per garantire un monostrato uniforme. Non ruotare le piastre perché le cellule si raggruppano al centro del pozzo. Incubare le piastre a 27 °C per almeno 1 h per consentire l’aderenza cellulare alla piastra. Erogare 4 mL di cellule Sf9 ad una densità di 3,5-4 x 106 in mezzo privo di siero di insetti in ogni pozzo di blocchi da 24 porci da infettare con virus P1 per lo screening dell’espressione proteica.NOTA: Etichettare un pozzo delle piastre a 24 po ‘e blocchi da 24 po ‘come controllo e utilizzo come controllo non infetto per il confronto di cellule infette e non infette quando si cerca soi. Utilizzare un multicanale elettronico programmabile per consentire la raccolta simultanea di virus P1 (fase 2.1.13), l’infezione delle cellule Sf9 appena sementi (fase 3.1.1) e l’infezione delle cellule di sospensione nei blocchi a 24 pozzi (fase 3.1.4) con 150 μL di virus P1. Spin down il resto delle scorte virali P1 raccolte per 15 min a 17.970 x g,trasferirle in tubi di microcentrifugo e conservarle al buio a 4 °C. Dondolare delicatamente le piastre a 24 pozzi (fase 3.1.1) su uno shaker alternativo per garantire una distribuzione uniforme dei virus P1 aggiunti sul monostrato cellulare; ripetere questo alcune volte durante il tempo di incubazione. Coprire i blocchi da 24 pozzi con la coltura di sospensione delle cellule Sf9 infette (fase 3.1.4) con un foglio di airpore. Incubare i blocchi di 24 pozzi a 27 °C, tremando a 245 giri/min per 72-96 ore. Cercare SOI entro 72-96 ore dopo il tempo di infezione nelle piastre a 24 po ‘con virus P2 (passaggio 3.1.1) e nei blocchi da 24 po ‘(passaggio 3.1.4) con cellule infette per lo screening dell’espressione.NOTA: 4-5 giorni dopo l’infezione delle cellule Sf9 con virus P1, soi dovrebbe essere evidente nelle cellule infette rispetto alle cellule di controllo non infette sotto un microscopio invertito. Raccogliere virus P2 da piastre a 24 pozzi, centrifugare per 15 min a 17.970 x g,trasferirli in tubi di microcentrifugo e conservare al buio a 4 °C. A 72-96 ore dopo l’infezione, spruzzare sui blocchi da 24 po ‘con etanolo al 70%, portare nella cappa di flusso laminare e controllare la densità e la vitalità delle cellule in alcuni pozzi mediante colorazione Trypan Blue. Procedere alla purificazione delle proteine se le cellule hanno segni di infezione e la vitalità è vicina al 70-75% come valutato dalla colorazione Trypan Blue. Pellettizzare le cellule centrifugando i blocchi di 24 pozzi a 525 x g a 4 °C per 15 minuti. Scartare il supernatante e sospendere completamente i pellet in 1 mL di tampone di lisi composto da 25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 0,6 % NP-40, 2 mM imidazolo, 5% glicerolo (v/v) e 1x cocktail inibitore della proteasi (cocktail inibitore della proteasi 100x comprende aprotinina 0,25 mg/mL, leupeptina 0,25 mg/mL, pepstatina A 0,25 mg/mL; E-64 0,25 mg/mL). Conservare la sospensione cellulare a -80 °C per la successiva purificazione delle prove (vedere 3.2.2). Purificazione proteica dalla sospensione cellulare congelata in blocchi di espressione di prova a 24 pozzi. Assemblaggio del blocco di associazione (Figura 3). Posizionare 3 strati sovrapposti di parafilm sulla parte superiore del blocco del pozzo profondo 96 (pozzo profondo 96 2,4 mL). Posizionare una piastra filtrante da 96 polietilene (micropiastra filtrante, 96 polietilene con membrana in polietilene ad altissimo peso molecolare da 25 μm) sulla parte superiore del blocco del pozzo profondo 96. Spingere verso il basso la piastra filtrante per fissare le punte nel parafilm per sigillare la piastra filtrante dal blocco profondo 96 punti. Trasferire 50 μL di liquame di resina Ni-NTA pre-equilibrato al 50% in ogni pozzo della piastra filtrante. Procedura di espressione di test Posizionare la sospensione cellulare congelata (fase 3.1.15) presente in blocchi di 24 pozzetti in un bagno d’acqua a RT per 5-10 minuti, quindi agitare a 450 giri/min per 20 minuti. Centrifuga i blocchi da 24 pozzi a 3.275 x g per 15 minuti. Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire i lisati sgombrati in una piastra filtrante contenente 50 μL di liquame in resina Ni-NTA pre-equilibrato (passo 3.2.1.4) e sigillare la piastra filtrante con un tappetino a cappuccio da 96 po ‘(tappetino a cappuccio da 96 pozzoli, da utilizzare con pozzo quadrato, 2 mL).NOTA: Utilizzare alcuni elastici per tenere insieme il blocco di legatura durante le fasi di incubazione e centrifugazione. Posizionare il blocco di legame fissato per 45-60 minuti in un rotatore in una stanza fredda per incubare lisati sgombrato con resina Ni-NTA. Dopo l’incubazione, sollevare con cura la piastra filtrante e rimuovere lo strato di parafilm dalla superficie del blocco del pozzo profondo 96 (passaggio 3.2.1.1). Riposizionare la piastra filtrante sopra il blocco del pozzo profondo 96 e ruotare verso il basso il blocco di attacco fissato per 2 minuti a 235 x g. Legame di lavaggio Resina Ni-NTA 2x con 2 mL di tampone di lavaggio composto da 25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% glicerolo e 15 mM imidazolo. Spin giù il blocco con tampone di lavaggio ogni volta per 5 minuti a 235 x g per garantire la completa rimozione del liquido residuo. Trasferire la piastra filtrante sulla parte superiore della piastra PCR da 96 pozzi contenente 10 μL di colorante di carico 4x. Aggiungere 40 μL di tampone di eluizione (25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% glicerolo, 500 mM imidazolo) ad ogni pozzetti della piastra filtrante e incubare per 5 min. Spin giù il blocco per elutare le proteine nella piastra PCR da 96 punti a 235 x g per 10 minuti. Sigillare la piastra PCR da 96 pozzi con tap pad resistente alle alte temperature e riscaldare a 98 °C per 3 minuti. Caricare 15 μL di campioni di proteine eluitati nel tampone Laemmli standard sul gel SDS-PAGE al 4-20% accanto alla scala proteica ed eseguire il gel con tampone di corsa standard contenente SDS. Macchiare il gel con blu Coomassie e de-macchiare con acqua. Analizzare i risultati dell’espressione di test per identificare i migliori costrutti di espressione per la produzione su larga scala. 4. Preparazioni delle cellule di insetti infettate da baculovirus (SCBIIC) per la produzione di proteine 4 giorni prima del tempo di produzione programmato, dividere le cellule Sf9 in crescita esponenziale ad una densità cellulare finale di 2 x 106 cellule/mL in 125 mL / 250 mL / 500 mL Erlenmeyer vetro agitare le fiasche con deflettori in 50 mL / 100 mL / 200 mL di mezzo senza siero di insetti contenente 1% (v / v) antibiotico-antimicotico finale. Aggiungere 0,150 mL / 0,300 mL / 0,6 mL di virus P2 appropriati, incubare le cellule infette a 165 giri/min su uno shaker orbitale con un colpo di un pollice e ad una temperatura inferiore di 25 °C per rallentare la divisione cellulare. A 4 giorni dopo l’infezione, controllare le cellule al microscopio per soi e procedere alla produzione se la vitalità cellulare come verificato con la macchia Trypan Blue è vicina al 70-75%. 5. Preparazioni cellulari Sf9 per la produzione di proteine su larga scala 4 giorni prima del tempo di produzione programmato, calcolare il volume richiesto di cellule Sf9 per la produzione di proteine su larga scala. Seme 2 L di cellule Sf9 in crescita esponenziale in Mezzo senza siero di insetti ad una densità cellulare di 1 x 106 cellule / mL in 2,8 L Fernbach agitare i fiasche. Incubare i contenitori a 27 °C con set di scuotimento a 150 giri/min.NOTA: Per prevenire la contaminazione batterica nella coltura cellulare sf9, utilizzare la gentamicina ad una concentrazione finale di 10 μg/mL o penicillina/streptomicina rispettivamente a 50 U/mL e 50 μg/mL. 6. Infezione delle cellule Sf9 con SCBIIS per la produzione di proteine su larga scala Dividi 2 L o 4 L di cellule Sf9 in crescita esponenziale in Insect Serum-Free Medium fino a una densità cellulare finale di 4 x 106 celle / ml in flaconi di frullato Di tonno da 2,5 L o bottiglie di reagente da 5 L. Aggiungere 10-12 mL/L della coltura di sospensione delle cellule di insetti infettate da baculovirus (SCBIIC). Incubare la coltura infetta delle cellule Sf9 su uno shaker con 145 giri/min alla temperatura inferiore di 25 °C (per rallentare la divisione cellulare) per 72-96 ore. A 72 ore dopo l’infezione, controllare le cellule al microscopio per la SOI e valutare la vitalità cellulare. Di solito, dopo circa 72 ore dopo l’infezione, la vitalità delle cellule Sf9 scende al 70%-75% (misurata usando la macchia Trypan Blue). Raccogliere le cellule Sf9 infette in una bottiglia di polipropilene da 1 L centrifugando a 900 x g per 15 min a 4 °C. Rimossare il pellet di cellule raccolto da 1 L della coltura cellulare di produzione con 20-25 ml di 1x PBS ruotando delicatamente e traslocando in tubi conici da 50 ml. Ruotare la sospensione cellulare a 900 x g per 15 minuti e scartare la soluzione PBS. Rimescolare il pellet di cellule lavate con 20-25 mL del tampone di sospensione (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 5% glicerolo, 1x cocktail inibitore della proteasi) e congelamento flash in azoto liquido; conservare a -80 °C fino alla purificazione.NOTA: Le procedure di purificazione per i PRMT sono state descritte in dettaglio nel documento pubblicato dall’SGC6.