ייצור חלבוני PRMT רקומביננטיים באמצעות מערכת וקטור הביטוי של Baculovirus

הערה: הסקירה הכללית של שלבי פרוטוקול BEVS מתוארת באיור 1. 1. דור של DNA bacmid רקומביננטי הכנת צלחות סלקטיביות אגר LB עבור טרנספורמציה DH10Bac הכן לוחות אגר LB המכילים: 50 מיקרוגרם / מ”ל kanamycin, 7 מיקרוגרם / מ”ל גנטמיצין, 10 מיקרוגרם / מ”ל טטרציקלין, 200 מיקרוגרם / מ”ל Bluo-gal, ו 40 מיקרוגרם / מ”ל IPTG לבחור עבור DH10Bac transformants. שוקלים 25 גרם של מרק LB premixed ו 13 גרם של Bacto אגר ולשים לתוך בקבוק 2 L. להביא את הנפח ל 1 L עם מים מזוקקים אוטוקלאב במשך 15-30 דקות ב 121 מעלות צלזיוס. הגדר אמבט מים ב 50 מעלות צלזיוס ומצנן את פתרון אגר autoclaved באמבט המים במשך 40- 60 דקות עד שהוא מקורר עד 50 -55 מעלות צלזיוס. לתמיסה מקוררת, להוסיף gentamicin לריכוז הסופי של 7 מיקרוגרם / מ”ל, kanamycin לריכוז הסופי של 50 מיקרוגרם / מ”ל, טטרציקלין לריכוז הסופי של 10 מיקרוגרם / מ”ל, Bluo-gal לריכוז הסופי של 200 מיקרוגרם / מ”ל, ו IPTG לריכוז הסופי של 40 מיקרוגרם / מ”ל. מערבבים את הפתרון אגר aliquot 7-10 מ”ל של המדיום לכל צלחת 60 מ”מ באמצעות פיפטה 50 מ”ל. תן את הצלחות לשבת בטמפרטורת החדר (2 שעות) כדי להקשיח. הפוך, לעטוף ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. צלחות המכילות אנטיביוטיקה יציבות עד 4 שבועות. הפיכת הפלסמיד לתאים מוסמכים DH10Bac E. coli חשב את הנפח הנדרש של תאים מוסמכים. להפשיר תאים מוכשרים על קרח, בעדינות להסתובב ו resuspend בחזרה על ידי הקשה עדינה. השתמש פיפטה 12 ערוצים לוותר 4 μL של התאים לתוך כל באר של צלחת PCR 96-גם. הוסף ~ 0.3-0.5 מיקרוגרם של DNA פלסמיד רקומביננטי לתאים המוסמכים ומערבבים בעדינות על ידי הקשה. דגירה את התערובת על קרח במשך 10-15 דקות. מחממים את התערובת במכונת PCR ב 42 °C (60 °F) עבור 45 s. מצננים על הקרח במשך 2 דקות. לוותר על 0.5 מ”ל של SOC בינוני לכל באר של בלוקים 96-באר (96-עמוק גם 2.4 מ”ל). השתמש פיפטה 12 ערוצים כדי להעביר את ההשעיה חיידקי הפך לתוך הבאר המתאימה של הבלוק לכסות אותו עם גיליון airpore. מניחים את הבלוק באינקובטור רועד ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה בינונית (205 סל”ד) עבור 4-5 שעות. באופן שווה להפיץ 30-50 μL של התרבות על פני השטח של צלחת אגר LB באמצעות חרוזי זכוכית סטריליים. אחסן את שאר התרבות ב 4 מעלות צלזיוס. דגירה הצלחות ב 37 °C (60 °F) עד צבע המושבות כחול / לבן ניתן להבחין (40-48 שעות). השלך את התרבות כאשר מספיק מושבות לבנות וגדולות מתקבלות על הצלחת. כדי להבטיח שמושבות לבנות יכילו רק דנ”א בכחמיד רקומביננטי, פס מחדש מושבה לבנה מבודדת אחת על לוחות אגר LB טריים המכילים אנטיביוטיקה, bluo-gal, ו IPTG כדי לאמת את הפנוטיפ. דגירה עבור 48 שעות ב 37 °C (69 °F). בחר מושבה לבנה מאומתת אחת מלוחית מפוספסת מחדש להפקת דנ”א בכחמיד רקומביננטי. בידוד דנ”א בכחמיד רקומביננטי לחסן מושבה לבנה אחת, מבודדת לתוך 3 מ”ל של מדיום LB בתוספת 50 מיקרוגרם / מ”ל kanamycin, 7 מיקרוגרם / מ”ל gentamicin, ו 10 מיקרוגרם / מ”ל טטרציקלין בלוקים 24-באר (24-באר בלוקים עגולים למטה) ולכסות עם גיליון airpore. לגדול ב 37 מעלות צלזיוס לילה עם רועד ב 250 סל”ד. צנטריפוגה בלוקים 24-באר ב 2,100 x גרם במשך 10 דקות. מדקדקים את העל-טבעי, להפוך את הבלוק, ולהקיש בעדינות על נייר טישו סופג. הוסף 250 μL של פתרון 1 (פתרון לשימוש חוזר בתא) לכל באר. לאטום את הבלוקים עם רפידות קלטת או כל סרטי איטום אחרים ומניחים אותם על פלטפורמה רועדת ב 75 סל”ד במשך 5-10 דקות. בדוק היטב כל אחד כדי להבטיח תמוגה נכונה לתאים, ולהשתמש מחדש במידת הצורך, באמצעות קצה 1 מ”ל. הוסף 250 μL של פתרון 2 (פתרון תמוגה תא) לכל באר, לאטום את הבלוקים, ומניחים על פלטפורמה רועדת ב 75 סל”ד עבור 30 s (כדי למנוע זיהום צולב של הדגימות, לא להפוך בלוקים 24-באר) דגירה בטמפרטורת החדר במשך 4 דקות. הוסף 250 μL של פתרון 3 (פתרון נטרול), לאטום את הבלוקים, ומניחים על פלטפורמת רועד ב 75 סל”ד עבור 30 s. ייווצר משקע לבן עבה של חלבון ודנ”א גנומי E. coli. מניחים את הדגימה על הקרח במשך 10 – 15 דקות. צנטריפוגה במשך 60 דקות ב 2,100 x גרם ב 4 מעלות צלזיוס כדי גלולה הדוקה חומר משקעים לבן. במהלך צנטריפוגה, תווית צינור microcentrifuge חדש ולהוסיף 0.8 מ”ל של isopropanol מוחלט. מעבירים בעדינות את ה-supernatant לצינור המכיל איסופרופנול, תוך הימנעות מחומר משקעים לבן. מערבבים בעדינות להפוך את הצינור כמה פעמים ולאחר מכן מניחים על קרח במשך 5 עד 10 דקות. בשלב זה, המדגם יכול להיות מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס לילה. צנטריפוגה המדגם במשך 15 דקות ב 14,000 x g ב 4 מעלות צלזיוס. הסר את supernatant ולהוסיף 0.5 מ”ל של 70% אתנול לכל צינור. הפוך את הצינור מספר פעמים כדי לשטוף את גלולה. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 14,000 x גרם בטמפרטורת החדר. (אופציונלי: כביסה חוזרת) הביאו דגימות למכסה המנוע של הזרימה למינארית כדי להבטיח את הסטריליות של הכנת הפלסמיד ולהסיר כמה שיותר מהעל-טבעי ככל האפשר.הערה: גלולה עלול להיות מנותק מתחתית הצינור, כל כך בזהירות לצפות גלולה בעת השלכת supernatant. אוויר לייבש את הכדור בתוך מכסה המנוע זרימה למינאר במשך 15 – 20 דקות ולהמיס את ה- DNA ב 50 μL של מאגר elution מסונן, 10 mM Tris-Cl, pH 8.5 (ודא כי כדורי אינם מיובשים יתר על הרה). מאז DNA bacmid רקומביננטי הוא גדול מ 135 kb בגודל, כדי למנוע גזירה של DNA, להמיס את גלולה על ידי הקשה עדינה. כדי לאמת את נוכחותו של הגן של עניין ב- DNA bacmid, להגדיר את תערובת תגובת PCR בצלחת PCR 96-גם. הכן את תערובת PCR כדלקמן: 1 μL של חוצץ, 0.2 μL (10 מ”מ כל אחד) של dNTPs, 0.1 μL של פולימראז DNA Taq, 0.1 μL (25 מיקרומטר) של פריימרים קדימה והפוך (BACV2FWD: tattccattattcataccg; BACV2REV: ctctacaaatgtggtggggc), 1 μL של DNA bacmid ו 8 μL של מים. בצע הגברה של הגנים היעד עם denaturation הראשונית במשך 2 דקות ב 95 °C (69 °F), ואחריו 25 מחזורים של 94 °C (60 °F) עבור 30 s, ו 72 °C (72 °F) עבור 1 דקות / kb. לסיים את התגובה לאחר הארכה סופית במשך 7 דקות ב 72 מעלות צלזיוס. נתח 10 μL של מוצר ההגברה על 1% (w / v) ג’ל agarose המכיל פתרון כתמי חומצת גרעין על ידי אלקטרופורזה. אחסן את DNAs bacmid מאומת ב 4 מעלות צלזיוס. 2. דור של מניות קולווירוס רקומביננטי הערה: השתמש בתאי Sf9 הגדלים באופן אקספוננציאלי עם יכולת הקיום של 95% או יותר עבור כל שלב של פרוטוקול הביטוי baculovirus, כולל transfection התא עבור הדור baculovirus, הגברה נפח baculovirus, הקרנת ביטוי חלבון, וייצור חלבון. החלקה של תאי Sf9 עם DNA Bacmid ו reagents transfection (T.R.) כגון JetPrime או X-tremeGENE 9.הערה: כתמים כחולים Trypan ו hemocytometer ניתן להשתמש כדי לקבוע ספירת תאים קיימא ו % הכדאיות של התא. תאים שאינם בני קיימא תופסים את הכתם ומופיעים כחולים מתחת למיקרוסקופ בעוד תאים בני קיימא נשארים לא מוכתמים. כדי לחשב את % הכדאיות של התאים, מתקבלת ספירת תאים כוללת (לא מוכתמת ומוכתמת) וספירת התאים בת קיימא מחולקת בספירת התאים הכוללת ומוכפלת ב- 100. לדלל את תאי Sf9 הגדלים באופן אקספוננציאלי לצפיפות תאים סופית של 4 x 105 תאים / מ”ל במדיית חרקים ללא סרום ולשפוך לתוך מאגר ריאגנט סטרילי. השתמש פיפטה רב ערוצי לתכנות כדי לזרוע 0.5 מ”ל של תאי Sf9 מדולל לתוך כל באר של צלחת 24-well. תווית באר אחת של הלוח כפקד (לא נגוע) ולהשתמש בו כפקד כדי להשוות את התאים transfected ולא נגועים כדי להעריך סימנים פוטנציאליים של זיהומים. לאחר זריעת התאים לתוך הצלחות, בעדינות לנענע את הצלחות קדימה ואחורה מספר פעמים כדי להבטיח חד שכבתית אפילו של תאים. אל תערבב את הצלחות כי התאים יתקבצו למרכז הבאר. דגירה הצלחות ב 27 °C (69 °F) לפחות 1 שעות כדי לאפשר חיבור התא ללוחות התרבות. מערבבים היטב את בקבוקון reagent transfection. עבור כל transfection, להוסיף 2 μL של מגיב transfection ל 100 μL של מאגר transfection. ניתן להשתמש גם בכל מדיום חרקים לא מפואר אחר. מפקידים את ריאגנט transfection מדולל במאגר מגיב סטרילי בעדינות לערבב במשך 10 s. באמצעות פיפטה 12 ערוצים, להעביר 102 μL של reagent transfection מדולל לתוך צלחת סטרילית 96-microwell. העבר 10 μL של פתרון 0.2 מיקרוגרם / μL של DNA bacmid רקומביננטי לתוך הבאר המתאימה של צלחת microwell 96-היטב ומערבבים על ידי טלטול בעדינות (הקשה) הצלחת מהצדדים. דגירה תערובת transfection במשך 15-20 דקות כדי לאפשר היווצרות מורכבת. באמצעות פיפטה מתכווננת בת 6 ערוצים המיועדת להעברה בין צלחות של 96 ו-24 בארות, מוסיפים את תערובת הטרנס-פפיקציה על התאים לבארות מקבילות של לוחות טרנס-פפיקציה ודגרה למשך 4-5 שעות ב-27 מעלות צלזיוס. בעדינות לטלטל את הצלחות קדימה ואחורה מספר פעמים במהלך זמן הדגירה כדי להבטיח הפצה שווה של תערובת transfection על monolayer התא. 4-5 שעות לאחר transfection, להוסיף 1.5 מ”ל של חרקים סרום ללא בינוני בתוספת 10% (v / v) הסופי של סרום שור עוברי מומת חום אנטי-מיקוטי אנטיביוטי ל 1% (v / v) נפח סופי (100 יחידות / מ”ל של פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ”ל של סטרפטומיצין, ו 0.25 מיקרוגרם / מ”ל של אמפיטריצין B). דגירה התאים באינקובטור 27 °C (77 °F) עבור 72-96 שעות. בעדינות לנענע את צלחות transfection פעם ביום כאשר הדבר אפשרי. חפשו סימני הידבקות (SOI), המתבטאים בתאים שהודבקו במהירות של 72-96 שעות לאחר ההדבקה (איור 2). זכור כי התאים החודרים יתחילו לייצר את הנגיף ולהדביק עוד יותר את התרבות; לכן, לחפש את הסימנים של זיהום.הערה: סימני זיהום הם שינויים מבניים בתאי החרקים, כגון עלייה של 25-50% בקוטר התא, גרעיני תאים מוגדלים, צורה מעוגלה באופן אחיד, אובדן התפשטות והקפדה על משטח צלחת התרבות, כמו גם ירידה בכדאיות התא (איור 2. Baculovirus נגועים ותאי Sf9 נגועים). 3. קטן – הקרנת ביטוי חלבון בקנה מידה והגברת וירוסים זיהום של תאי Sf9 עם מניות P1 baculovirus.הערה: 4-5 ימים לאחר transfection, סימנים של זיהום צריך להיות ניכר בתאים transfected בהשוואה לתאי הבקרה (לא נגוע) תחת מיקרוסקופ הפוך. baculoviruses רקומביננטי הראשוני מופרש לתוך המדיום תרבות התא צריך להיות מוכן לאסוף. זרע 2 x 105 תאי Sf9 הגדלים באופן אקספוננציאלי במדיית חרקים ללא סרום לתוך כל באר של 24 בארות צלחות בנפח כולל של 2 מ”ל עבור זיהום עם וירוסי P1 כדי להגביר את נפח הנגיף (וכתוצאה מכך הדור של וירוסי P2). לאחר צינור התאים לתוך הצלחות, בעדינות לטלטל את הצלחות, באמצעות תנועה הלוך ושוב כדי להבטיח מונולייר אפילו. אל תערבב את הצלחות כי התאים יתקבצו למרכז הבאר. דגירה הצלחות ב 27 °C (69 °F) לפחות 1 שעות כדי לאפשר הדבקה הסלולר לצלחת. לוותר על 4 מ”ל של תאי Sf9 בצפיפות של 3.5-4 x 106 במדיום ללא סרום חרקים לתוך כל באר של בלוקים 24-באר להדביק עם וירוסים P1 עבור הקרנת ביטוי החלבון.הערה: תווית באר אחת של לוחות 24-באר בלוקים 24-well כמו שליטה ולהשתמש כפקד נגוע להשוואה של תאים נגועים שאינם נגועים כאשר מחפשים SOI. השתמש multichannel אלקטרוני לתכנות כדי לאפשר איסוף בו זמנית של וירוסים P1 (שלב 2.1.13), זיהום של תאים Sf9 זרע טרי (שלב 3.1.1) וזיהום של תאים מתלים בלוקים 24-באר (שלב 3.1.4) עם 150 μL של וירוסים P1. סובבו את שאר המניות הנגיפיות שנאספו ב-P1 במשך 15 דקות ב-17,970 x גרם, העבירו אותן לצינורות מיקרוצנטריפוגה ואחסנו בחושך ב-4 מעלות צלזיוס. בעדינות לנענע את צלחות 24-well (שלב 3.1.1) על שייקר הדדית כדי להבטיח הפצה שווה של וירוסי P1 הוסיף על monolayer התא; לחזור על זה כמה פעמים במהלך זמן הדגירה. לכסות את בלוקים 24-באר עם תרבות ההשעיה של תאי Sf9 נגועים (שלב 3.1.4) עם גיליון airpore. דגירה בלוקים 24-באר ב 27 מעלות צלזיוס, רועד ב 245 סל”ד עבור 72-96 שעות. חפש SOI בתוך 72-96 שעות לאחר זמן ההדבקה בלוחות 24 באר עם וירוסי P2 (שלב 3.1.1) ובגושים 24-well (שלב 3.1.4) עם תאים נגועים עבור הקרנת הביטוי.הערה: 4-5 ימים לאחר ההדבקה של תאי Sf9 עם וירוסי P1, SOI צריך להיות ניכר בתאים הנגועים בהשוואה לתאי הבקרה שאינם נגועים תחת מיקרוסקופ הפוך. לאסוף וירוסים P2 מ 24-באר צלחות, צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 17,970 x גרם, להעביר אותם לצינורות microcentrifuge ולאחסן בחושך ב 4 °C (69 °F). ב 72-96 שעות לאחר ההדבקה, לרסס על בלוקים 24-באר עם 70% אתנול, להביא לתוך מכסה המנוע זרימה למינאר, ולבדוק את צפיפות התא ואת הכדאיות בכמה בארות על ידי טריפאן כחול כתמים. המשך טיהור חלבון אם תאים יש סימנים של זיהום וכדאיות קרוב 70-75% כפי שהוערך על ידי טריפאן כחול כתמים. גלולה התאים על ידי צנטריפוגה בלוקים 24-באר ב 525 x g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. להשליך את supernatant ביסודיות להשעות את כדורי 1 מ”ל של מאגר תמוגה הכולל 25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.6 % NP-40, 2 mM imidazole, 5% גליצרול (v / v) ו 1x קוקטייל מעכב פרוטאז (100x מעכבי פרוטאז קוקטייל כולל אפרוטינין 0.25 מ”ג / מ”ל, leupeptin 0.25 מ”ג / מ”ל, פפטטין A 0.25 מ”ג / מ”ל; E-64 0.25 מ”ג/ מ”ל). אחסן את המתלה התא ב -80 מעלות צלזיוס לטיהור הבדיקה הבאים (ראה 3.2.2). טיהור חלבונים מהשעיית תאים קפואים בבלוקים של 24 באר של ביטויי בדיקה. הרכבה של בלוק הכריכה (איור 3). הנח 3 שכבות חופפות של parafilm בחלק העליון של בלוק באר 96 עמוק (96 עמוק גם 2.4 מ”ל). מניחים צלחת מסנן 96-well (מיקרופלטה מסנן, 96-טוב, פוליפרופילן עם 25 מיקרומטר גבוה במיוחד משקל מולקולרי פוליאתילן קרום) על החלק העליון של בלוק באר 96-עמוק. לדחוף כלפי מטה את צלחת המסנן כדי לאבטח את הטיפים לתוך parafilm כדי לאטום את צלחת המסנן מן הבלוק עמוק 96-גם. העבר 50 μL של תרחיף שרף 50% Ni-NTA שקול מראש לתוך כל באר של צלחת המסנן. פרוצדורת ביטוי בדיקה מניחים את המתלה תא קפוא (שלב 3.1.15) נוכח בלוקים 24-באר באמבט מים ב RT במשך 5-10 דקות, ולאחר מכן לנער ב 450 סל”ד במשך 20 דקות. צנטריפוגה בלוקים 24-באר ב 3,275 x גרם במשך 15 דקות. באמצעות פיפטה רב ערוצית, להעביר את lysates פינה לתוך צלחת מסנן המכיל 50 μL של מראש שווה 50% Ni-NTA שרף תרחיף (שלב 3.2.1.4) ולאטום את צלחת המסנן עם מחצלת כובע 96-well (מחצלת כובע 96-well, לשימוש עם באר מרובעת, 2 מ”ל).הערה: השתמש בכמה גומיות כדי לשמור על בלוק הכריכה יחד במהלך שלבי הדגירה והצנטריפוגה. מניחים את בלוק הכריכה המאובטח במשך 45 – 60 דקות לתוך מסובב בחדר קר כדי להדגיר lysates פינה עם שף Ni-NTA. לאחר הדגירה, הרם בזהירות את צלחת המסנן והסר את שכבת הפרפילם מפני השטח של בלוק הבאר בעומק 96 (שלב 3.2.1.1). מניחים בחזרה את צלחת המסנן על גבי בלוק באר 96-עמוק לסובב למטה את בלוק כריכה מאובטח במשך 2 דקות ב 235 x g. לשטוף את הקשר Ni-NTA שרפן 2x עם 2 מ”ל של חוצץ כביסה הכולל 25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% גליצרול, ו 15 mM imidazole. סובבו את הבלוק עם חיץ כביסה בכל פעם במשך 5 דקות ב 235 x גרם כדי להבטיח הסרה מלאה של שאריות נוזל. להעביר את צלחת המסנן בחלק העליון של צלחת PCR 96-היטב המכיל 10 μL של צבע טעינה 4x. הוסף 40 μL של מאגר elution (25 mM Tris pH 8.0, 300 mM NaCl, 5% גליצרול, 500 mM imidazole) לכל באר של צלחת המסנן דגירה במשך 5 דקות. סובבו את הבלוק כדי להפוך חלבונים לצלחת PCR של 96 באר ב-235 x גרם למשך 10 דקות. לאטום את צלחת PCR 96-גם עם כרית ברז עמיד בטמפרטורה גבוהה חום ב 98 °C (69 °F) במשך 3 דקות. טען 15 μL של דגימות חלבון eluted במאגר Laemmli סטנדרטי על 4-20% SDS-PAGE ג’ל ליד סולם החלבון ולהפעיל את הג’ל עם חיץ ריצה סטנדרטי המכיל SDS. הכתימו את הג’ל בכחול קומאסי ודה-כתם במים. נתח את התוצאות של ביטוי הבדיקה כדי לזהות את מבני ההבעה הטובים ביותר לייצור בקנה מידה גדול. 4. הכנות של תאי חרקים נגועים baculovirus (SCBIIC) לייצור חלבון 4 ימים לפני זמן הייצור המתוזמן, פצל תאי Sf9 הגדלים באופן אקספוננציאלי לצפיפות תאים סופית של 2 x 106 תאים / מ”ל לתוך 125 מ”ל / 250 מ”ל / 500 מ”ל Erlenmeyer זכוכית לנער בקבוקים עם מבלבל ב 50 מ”ל / 100 מ”ל / 200 מ”ל של חרקים סרום חינם בינוני המכיל 1% (v / v) סופי אנטיביוטי. הוסף 0.150 מ”ל / 0.300 מ”ל / 0.6 מ”ל של וירוסי P2 מתאימים, דגירה תאים נגועים ב 165 סל”ד על שייקר מסלולית עם שבץ של אינץ ‘אחד בטמפרטורה נמוכה יותר של 25 °C (70 °F) כדי להאט את חלוקת התא. ב 4 ימים לאחר ההדבקה, לבדוק תאים תחת מיקרוסקופ עבור SOI ולהמשיך לייצור אם הכדאיות התא כפי שאומת עם כתם כחול Trypan קרוב 70-75%. 5. הכנות תאי Sf9 לייצור חלבונים בקנה מידה גדול 4 ימים לפני זמן הייצור המתוזמן, לחשב את הנפח הנדרש של תאי Sf9 לייצור חלבון בקנה מידה גדול. זרע 2 L של תאי Sf9 הגדלים באופן אקספוננציאלי במדיום ללא סרום חרקים לצפיפות תאים של 1 x 106 תאים / מ”ל בבקבוקי טלטול 2.8 L פרנבך. דגירה צלויים ב 27 מעלות צלזיוס עם טלטול להגדיר ב 150 סל”ד.הערה: כדי למנוע זיהום חיידקי בתרבית התא Sf9, להשתמש gentamicin לריכוז הסופי של 10 מיקרוגרם / מ”ל או פניצילין / סטרפטומיצין ל 50 U / mL ו 50 מיקרוגרם / מ”ל, בהתאמה. 6. זיהום של תאי Sf9 עם SCBIIS לייצור חלבון בקנה מידה גדול פצל 2 L או 4 L של תאי Sf9 הגדלים באופן אקספוננציאלי במדיום ללא סרום חרקים לצפיפות תאים סופית של 4 x 106 תאים / מ”ל בבקבוקי טלטול 2.5 L Tunair או בקבוקי ריאגנט 5 L. הוסף 10-12 מ”ל / L של תא חרק נגוע baculovirus (SCBIIC) תרבות ההשעיה. דגירה את התרבות הנגועה של תאי Sf9 על שייקר עם 145 סל”ד בטמפרטורה נמוכה יותר של 25 °C (כדי להאט את חלוקת התא) עבור 72-96 שעות. ב 72 שעות לאחר ההדבקה, לבדוק תאים תחת מיקרוסקופ עבור SOI ולהעריך את הכדאיות של התא. בדרך כלל, לאחר כ 72 שעות לאחר ההדבקה, הכדאיות של תאי Sf9 יורדת ל 70%-75% (נמדד באמצעות כתם כחול Trypan). קציר נגוע Sf9 תאים בבקבוק פוליפרופילן 1 L על ידי צנטריפוגה ב 900 x g במשך 15 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. Resuspend גלולת התא שנאסף מ 1 L של תרבות תא הייצור עם 20-25 מ”ל של 1x PBS על ידי מערבולת בעדינות ולהעביר לתוך צינורות חרוט 50 מ”ל. סובב את השעיית התא ב- 900 x g למשך 15 דקות והשליך את פתרון PBS. Resuspend גלולת התא שטף עם 20-25 מ”ל של מאגר ההשעיה (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 5% גליצרול, 1x פרוטאז מעכב קוקטייל) והקפאה פלאש חנקן נוזלי; לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד טיהור.הערה: הליכי טיהור עבור PRMTs תוארו בפירוט במאמר שפורסם SGC6.