إنتاج بروتينات PRMT المؤتلفة باستخدام نظام ناقلات التعبير عن فيروس باكولو
Summary
نظام ناقلات التعبير عن الفيروسات الكولوئية (BEVS) هو منصة قوية لفحص التعبير وإنتاج البروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراس (PRMTs) لاستخدامها في الدراسات الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية والهيكلية. يمكن إنتاج كميات ملليغرام من المواد لغالبية PRMTs والبروتينات الأخرى ذات الأهمية التي تتطلب منصة التعبير eukaryotic.
Abstract
البروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراسيس (PRMTs) بقايا الميثيلات أرجينين على مجموعة واسعة من البروتينات التي تلعب أدوارا في العديد من العمليات الخلوية. PRMTs يمكن إما أحادية أو ثنائي ميثيلات مجموعات أرجينين جوانيدينو بشكل متناظر أو غير متماثل. الأنزيمولوجيا من هذه البروتينات هي منطقة معقدة والتحقيق المكثف الذي يتطلب كميات ملليغرام من البروتين المؤتلف عالية الجودة. تم استخدام نظام متجهات التعبير عن الفيروسات الكولوبية (BEVS) الذي يستخدم Autographa californica متعددة nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) وSpodoptera frugiperda 9 (Sf9) خلايا الحشرات لفحص التعبير وإنتاج العديد من PRMTs ، بما في ذلك PRMT 1 و 2 و 4 إلى 9. في وقت واحد للشاشة للتعبير عن بنيات متعددة من هذه البروتينات، بما في ذلك المجالات وشظايا مبتورة، فضلا عن البروتينات كاملة الطول، قمنا بتطبيق أساليب قابلة للتطوير باستخدام ماصة متعددة القنوات قابلة للتعديل وبرمجة، جنبا إلى جنب مع لوحات 24-و 96-well وكتل. وعموما، مكنت هذه التعديلات طريقة توليد واسعة النطاق من الحمض النووي bacmid، والفيروسات المؤتلفة، وفحص التعبير البروتين. ساعد استخدام الأوعية الثقافية ذات الحجم العالي من تعليق خلايا Sf9 على التغلب على قيود المساحة في خط أنابيب الإنتاج لإنتاج البروتين على نطاق واسع دفعة واحدة. هنا، نقوم بوصف البروتوكولات التفصيلية للتعبير الفعال والفعال من حيث التكلفة عن PRMTs الوظيفية للدراسات البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية والهيكلية.
Introduction
البروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراسيس (PRMTs) ميثيلات أرجينين المخلفات بطريقة أحادية ميثيل أو متماثل / ثنائي ميثيل غير متماثل. وتفضل كثيرا تسلسل RG/RGG/GRG المتكررة من قبل معظم PRMTs وتوجد في مجموعة واسعة من البروتينات1،2. البروتينات الميثيلية أرجينين مثل الهستونات أو عوامل النسخ وعوامل الربط تنظيم النسخ, الربط, وهيكل الكروماتين3,4. زيادة المعرفة بتنظيم متنوع من الركيزة واستخدام عامل مساعد، دوران، وحركية PRMTs، فضلا عن توليد مثبطات انتقائية، وقد ألقى الضوء الميكانيكي على هذه الإنزيمات ومجمعاتها5،6. ومع ذلك، لا تتم دراسة جميع أفراد أسرة PRMT بنفس القدر؛ على سبيل المثال، تم اكتشاف PRMT9 مؤخرا فقط ليكون عضوا في عائلة PRMT1. تتطلب دراسات وظيفة الهيكل والانزيم لهذه البروتينات كميات كافية ، غالبا ما تكون ملليغرام ، من البروتين المؤتلف لتكون متاحة.
الإشريكية القولونية (E. coli) نظام التعبير prokaryotic عادة ما يكون الخيار الأول لفحص التعبير باستخدام بنيات متعددة لبروتين معين7,8,9. ومع ذلك ، فإن التعبير القائم على الإشريكية القولونيةلا يؤدي دائما إلى كميات كافية من بروتينات PRMT في أشكالها النشطة ، كما لاحظنا بشكل خاص بالنسبة ل PRMT5 و PRMT7 (انظر أدناه). وهكذا، فإن تكنولوجيات PRMTs التي لم تعبر عن الإشريكية القولونية أو التي تحتاج إلى إنتاجها بواسطة آلية التعبير eukaryotic كانت معلبة في ناقلات مناسبة لفحص التعبير في نظام متجه التعبير البديل لفيروس الباكولو (BEVS). في حين أعرب E. coli عينات من PRMT1، PRMT3 وPRMT8 وقد استخدمت على نطاق واسع في المقايسات المختبرية والبلورات، PRMTs أخرى مثل PRMT5، الذي يتطلب MEP50 شريك ملزم من مجالها ميثيل ترانسفيراز المزدوج، وPRMTs مثل PRMT7 و 9، تتطلب التعبير عن خلايا الحشرات للحصول على كميات كافية من البروتين النشط. بشكل عام ، استخدمت المقايسات الموحدة متوسطة الإنتاجية ميثيل ترانسفيراز ل PRMT4 و 5 و 6 و 7 و 9 BEVS في خلايا الحشرات6. نظام متجهات التعبير عن الفيروسات الكولولية (BEVS) هو منصة متعددة الاستخدامات لإنتاج البروتينات المؤتلفة التي تتطلب آلات التعبير eukaryotic التي تمكن من التعديلات ما بعد الترجمة الضرورية للدراسات الكيميائية الحيوية والفيزيائية الحيوية والهيكلية10،11،12. أصبحت العديد من BEVSs متاحة تجاريا منذ أول استخدام للفيروسات الكولوفيروس في عام 1983 للتعبير عن البروتين13. تستخدم معظم هذه البروتوكولات استراتيجيات مختلفة لنقل البلازميد التعبيري إلى خلايا الحشرات. وتشمل هذه باك إلى باك، flashBAC، BaculoGOLD مشرق، BacVector-3000، BacMagic، BacPAK، الخ. ويستند بروتوكولنا على النظام الأكثر استخداما في BEVS، ونظام البكالوريا إلى البكالوريا14،الذي يهدف إلى نقل الجين / cDNA ترميز البروتين من الفائدة (POI، هنا PRMTs) في الجينوم فيروس baculo الحفاظ عليها في سلالة متخصصة من القولونية E. عن طريق نقل موقع محدد15.
لفترة وجيزة، تم تحويل ناقل نقل البلازميد الذي يحتوي على جين الفائدة إلى خلايا DH10Bac E. coli المختصة لتوليد الحمض النووي الفيروسي bacmid المؤتلف. ثم تم نقل خلايا Sf9 الملتصقة بالحمض النووي الباكميد. بعد أربعة إلى خمسة أيام من العدوى، تم استرداد الفيروسات الباكولوية المؤتلفة الأولية التي تفرز في وسط زراعة الخلايا ووصفت بأنها فيروس P1. ثم استخدمت مخزونات فيروس الباكولو P1 لتضخيم الفيروسات (أي توليد مخزونات فيروسات الباكولو P2) وفحص التعبير عن البروتين. استنادا إلى نتائج فحص التعبير ، تم تحديد فيروسات P2 للحصول على أفضل تعبير عن البروتين واستخدامها لتوليد ثقافات تعليق خلايا الحشرات المصابة بفيروس الكولو (SCBIIS) لإنتاج البروتين على نطاق واسع. هنا، نقوم بوصف بروتوكولاتنا التفصيلية ووصف الأساس المنطقي وراء اختياراتنا للكواشف والثقافة لدعم استراتيجيتنا لتطوير منهجية أكثر كفاءة من حيث الوقت، وفعالة من حيث التكلفة، وقابلة للتوسع للحصول على كميات كافية من البروتينات المؤتلفة المطلوبة.
Protocol
Representative Results
Discussion
تركز إحدى مزايا BEVS في خلايا الحشرات على قدرة آلية التعديل بعد الترجمة على تمكين تعديلات أكثر تعقيدا مثل الفوسفور وال myristoylation والجيليكوزيليشن. جنبا إلى جنب مع للطي كفاءة عالية من البروتينات الثدييات، وهذه التعديلات تسهيل كميات عالية من البروتين المعدلة والمطوية مناسبة للتجارب المصب ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية16.
هنا ، وصفنا بروتوكولات مفصلة من BEVS التأكيد على العناصر الحاسمة لفحص التعبير الناجح لبنى متعددة من بروتينات PRMT وإنتاج البروتين PRMT على نطاق واسع في منصة التعبير Baculovirus: 1) استخدام العادية ، قابل للتعديل ، وبرمجة ماصة متعددة القنوات لنقل المواد البيولوجية بين 24- و 96 – لوحات زراعة الخلايا جيدا وكتل في مراحل الحمض النووي bacmid وتوليد الفيروسات؛ مجموعة من الفيروسات المؤتلفة ، تضخيم الأحجام الفيروسية للفيروسات المؤتلفة وإعداد كتل فحص التعبير البروتيني. 2) الأداء العالي والكواشف transfection فعالة من حيث التكلفة لتوليد الفيروسات المؤتلفة. 3) تعليق ثقافة خلايا الحشرات المصابة بفيروس الكولو (SCBIIC) لإنتاج البروتين على نطاق واسع. 4) استخدام حجم التعبئة العالية 2.8 L فرنباخ يهز قوارير للحفاظ على ثقافة تعليق SF9 و2.5 L Tunair يهز قوارير و 5 زجاجات كاشف L لإنتاج البروتين على نطاق واسع.
اعتبارات خاصة ومبررات لخطوات التحول والإصابة.
على الرغم من أن البروتوكول التجاري يوصي باستخدام 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة لتحويل واحد14، فإن كفاءة تحويل الخلايا المختصة DH10Bac E. coli التجارية عالية مثل 1 × 108 cfu / μg DNA ، لذلك نستخدم فقط 4 ميكرولتر. وهذا يكفي لكل محول للحصول على مستعمرات بيضاء منعزلة مؤتلفة لعزل الحمض النووي bacmid. تم بذر خلايا Sf9 الملتصقة في لوحة العدوى العابرة 24 جيدا بكثافة خلية 2 × 105 / مل في 0.5 مل من وسائط الحشرات الخالية من المصل. هذا الحجم يكفي لضمان تغطية حتى من سطح العمل من البئر. وفي الوقت نفسه، فإنه لا يضعف مزيج العدوى أكثر من اللازم، مما يعزز كفاءة العدوى. الكواشف Transfection غير سامة لخلايا SF9، وتبادل وسائل الإعلام ليست ضرورية. بدلا من تغيير الوسائط، يتم إضافة 1.5 مل إضافية من الوسائط التي تحتوي على 10٪ (v/v) FBS إلى لوحة العدوى في 4-5 ساعات بعد وقت العدوى لتسهيل نمو الخلايا. كفاءة العدوى من كل من الكواشف transfection عالية. ومع ذلك ، مع X – tremeGene 9 ، تظهر علامات العدوى في الخلايا المصابة (الشكل 2) 10-12 ساعة في وقت سابق مما كانت عليه مع كاشف JetPrime ، لذلك نختار بين هذه الكواشف اعتمادا على جدول العمل للخطوات التالية في البروتوكولات ، والتي توفر بعض المرونة في العملية الشاملة.
يمكن إعداد فحص التعبير عن اختبار البروتين مع فيروسات P2 إذا كانت كمية الفيروسات المؤتلفة الأولية ، التي تم جمعها من لوحة العدوى ووصفت بأنها P1 ، عاملا مقيدا لاستخدامه في فحص التعبير عن البروتين.
الاعتبارات عند الانتقال من أحجام الثقافة الصغيرة إلى الكبيرة.
تاريخيا، كان يعتقد أن نمو الخلايا الأمثل يتطلب مساحة جوية عالية في ثقافة التعليق من صيانة الخلايا SF9 وتوسيع نطاق الإنتاج. ومع ذلك ، في عام 2014 ، أفادت التقارير أن ارتفاع المساحة الجوية في السفن الثقافية أقل أهمية مما كان يعتقد سابقا17. سفينة الثقافة التي أنشئت باستخدام سرعة اهتزاز المعدلة بشكل مناسب لرمي المداري من منصة اهتزاز سيوفر نقل الأكسجين كافية حتى في ثقافة تعليق حجم التعبئة العالية من خلال خلق والحفاظ على فقاعات الهواء الصغيرة لفترة أطول. مع هذا النهج ، يمكن زراعة خلايا الحشرات المتاحة تجاريا بسرعة اهتزاز أعلى ضمن نطاق طبيعي من وقت مضاعفة الخلايا دون التضحية بقابلية الخلية العالية للحياة.
وهكذا، قبل 6 سنوات، بدأنا في زيادة حجم ثقافة التعليق في قارورة تهتز أثناء صيانة الخلية، وقدم نوع مختلف من وعاء الثقافة لإنتاج البروتين مع ضبط ورصد ظروف اهتزاز(الشكل 6). ولتهيئة الظروف المثلى في هذه الأوعية الثقافية، قمنا بمراقبة معلمات ثقافة الخلايا Sf9 مثل مضاعفة وقت مضاعفة الخلية إلى جانب صلاحية الخلية وحجمها وشكلها وحالة التجميع وقابلية الخلايا للعدوى.
على سبيل المثال، لصيانة الخلية Sf9، في 2.8 L فرنباخ يهز قوارير، ونحن ثقافة 2 L بدلا من 0.8 L من الخلايا تعليق SF9 تهتز في 150 دورة في الدقيقة في 27 درجة مئوية وقابلية بقاء الخلية معظم الوقت هو ما يقرب من 99٪، مع خلايا تقسيم صحية على شكل بالتساوي. لتوسيع نطاق الإنتاج، ونحن تصيب 4 لتر من الخلايا في زجاجات كاشف 5 لتر تهتز بسرعة عالية كما 145 دورة في الدقيقة في درجة حرارة خفضت من 25 درجة مئوية. يمكن أن تحمل الحاضنات الأكثر استخداما مع منصة اهتزاز مدمجة قوارير اهتزاز 6 × 2.8 لتر أو زجاجات كاشفة 6 × 5 لتر ، أو 10 × 2.5 لتر تونير يهز قوارير. وهكذا، فإن قدرة منصة اهتزاز واحدة، إذا كنا ملء قوارير فيرنباخ يهز وزجاجات كاشف إلى 1/3 مقابل لحجم التعبئة العالية من السفن هو 4.8 لتر مقابل 12 L باستخدام 2.8 L فرنباخ يهز قوارير و 10 L مقابل 24 L باستخدام زجاجات كاشف 5 لتر(الشكل 6). وقد ساعدتنا صيانة ثقافة الخلايا المعلقة وزيادة الإنتاج في سفن الثقافة ذات الحجم العالي على التغلب على قيود أحجام الإنتاج واعتماد منصة واسعة النطاق. وبالتالي، فإن هذا مفيد للغاية للمختبرات التي لا تتوفر لها إمكانية الوصول إلى المفاعلات الحيوية و/أو المساحة المحدودة في خطوط أنابيب الإنتاج.
يمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة لإنتاج وتنقية بنيات البروتين مع علامات تقارب مختلفة باستخدام الراتنجات المناسبة وتعديل مخازن تنقية كما هو موضح في ورقة SGC المنشورة6 للبروتينات كاملة الطول الموسومة بالعلم من PRMT4 و 7 و 9 ومجمع PRMT5-MEP50 الموسومة له وPRMT6. على الرغم من أننا نصف بروتوكول BEVS لعائلة PRMT من البروتينات ، يمكن تطبيق نفس النهج على أي عائلة بروتين أخرى.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا داليا بارسيت لوفجوي على أخذ الوقت لتقديم تعليقات قيمة وتعليقات انتقادية على المخطوطة وجميع زملائنا في SGC الذين عملوا مع عائلة بروتين PRMT المعبر عنها من نظام ناقلات التعبير عن فيروس باكولو.
وSGC هي مؤسسة خيرية مسجلة (رقم 1097737) التي تتلقى الأموال من AbbVie، باير AG، بوهرنجر إنغلهايم، جينينتيك، جينوم كندا من خلال معهد أونتاريو للجينوم [OGI-196]، الاتحاد الأوروبي وEFPIA من خلال مبادرة الأدوية المبتكرة 2 التعهد المشترك [منحة EUbOPEN 875510]، يانسن، ميرك KGaA (الملقب EMD في كندا والولايات المتحدة)، فايزر، تاكيدا وصندوق ويلكوم [106169/ZZ14/Z].
Materials
| 2.8L Nalgene Fernbach Culture Flask, Polycarbonate, | Nalgene | 29171-854 | For large scale maintenance of suspension culture of Sf9 cells |
| 24-Well Blocks RB | Qiagen | 19583 | For incubation of 4ml of suspension Sf9 cells for protein expression screening |
| 4-20 Criterion TGX Gel 26W 15 ul | Biorad | 5671095 | For SDS-PAGe analysis of the purified proteins |
| 50ml Reagent Reservoir | Celltreat Scientific Products | 229290 | Reservoir used for diluted transfection reagent and Sf9 cells suspension |
| 96-well cap mat, for use with square well, 2 mL | Greiner Bio-One | 381080 | Used to cover 96 well block |
| 96 well PCR plate | Eppendorf | 30129300 | |
| Bacto agar | BD | 214010 | For LB-agar selection paltes |
| Airpore Tape Sheets | Qiagen | 19571 | To cover 24 well blocks for protein expression screening |
| Allega X-15R Centrifuge | Beckman Coulter | 392932 | |
| Antibiotic Antimycotic (100x) | Gibco | 15240112 | |
| Bacmid DNA | in-house | non-catalog item | Bacmid DNA for baculovirus production |
| Bluo-Gal, 1g | Thermo Fisher | 15519028 | |
| Beckman JLA 8.1000 | |||
| Cell Culture Plates, 24-Well, with lid, flat bottom, sterile | Eppendorf | 30722116 | Tissue culture treated plate |
| Cell Resuspension Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCRS500 | For Bacmid DNA extraction |
| Cell Lysis Solution 0.5 L | Millipore Sigma | LSKCLS500 | For Bacmid DNA extraction |
| CELLSTAR Tissue Culture Plates, 96 well | Greiner Bio-One | 655180 | For transfection mix |
| ClipTip 1250, filter reload, sterile | ThermoFisher Scientific | 94420818 | Tips for programmable and adjustable multichannel pipette |
| dNTP Mix (25 mM each) | Thermo Fisher Scientific | R1121 | |
| E1-ClipTip Electronic Adjustable Tip Spacing Multichannel Equalizer Pipette, 15 to 1250 μL | ThermoFisher Scientific | 4672090BT | Programmable and adjustable multichannel pipette |
| E4 XLS adjustable spacer 6-channel pipette, 20-300 μL | Ranin | LTS EA6-300XLS | Ranin adjustable multichannel pipette |
| Filter microplate, 96-well, polypropylene, with 25 µm ultra high molecular weight polyethylene membrane | Agilent | 201005-100 | For protein purification in expression screening |
| Full-Baffle Flask Kit Tunair, 2.5L | IBI Scientific | SS-6003C | For large scale protein production in suspension culture of SF9 cells |
| Gentamicin 10x10ml | BioShop | 15750078 | |
| Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | Wisent Biocenter | 080-450 | |
| I-Max Insect Media W/ L-Glutamine, 1 L | Wisent Biocenter | 301-045-LL | Serum free insect cells growth medium |
| InstantBlue, Ultrafast Protein Stain | Expedeon Protein Solutions | ISB1L-1L | For protein gel (SDS-PAGE) staining |
| Iptg, Ultra Pure, Dioxane Free, Min 99.5% | BioShop | IPT001.100 | |
| JetPRIME Transfection Reagent Provided with jetPRIME buffer | POLYPLUS TRANSFECTION Inc | 114-01 | For Sf9 cells transfection to generate baculovirus |
| Kanamycin Monosulfate | BioShop | KAN201.100 | |
| Lb Broth (Lennox), Powder Microbial Gro& | Sigma | L3022-1KG | |
| Masterblock 96 deep well 2.4mL | Greiner Bio-One | 780285-FD | Used in the transformation and expression screening procedures |
| Max Efficiency DH10Bac Competent Cells , 0.5ml | Thermo Fisher | 10361012 | Competent cells for bacmid DNA generation |
| mLINE 12-Channel Pipette, adjustable 30 – 300 uL | Sartorius | Sartorius 725240 | 12 channel pipette |
| Neutralization Solution, 0.5 L | Millipore Sigma | LSKNS0500 | For bacmid DNA extraction |
| New Brunswick Innova 44R, 120V, orbit 2.5 cm (1 in) | Eppendorf | M1282-0004 | Shaker incubator for incubaion of suspension of Sf9 cells |
| Ni-NTA Agarose | Qiagen | 30250 | For protein purification |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | LS15140122 | |
| PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 500ml | Pyrex | 4444-500 | For suspension culture of Sf9 cells |
| PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 125ml | Pyrex | 4444-125 | For suspension culture of Sf9 cells |
| PYREX Delong Shaker Erlenmeyer Flask with Baffles, Corning 250ml | Pyrex | 4444-250 | For suspension culture of Sf9 cells |
| RedSafe Nucleic Acid Staining Solution | Froggabio | 21141 | |
| RNase A, 0.9 mL | Millipore Sigma | LSKPMRN30 | For suspension buffer for bacmid DNA extraction |
| Roll & Grow Spherical Glass Plating Beads | MP Biomedicals | 115000550 | For spread of bacterial cells across the surface of an agar plate. |
| RT-LTS-A-300μL-768/8 (tips) | Ranin | 30389253 | Tips for ranin multichannel pipette |
| S.O.C. Medium | Thermo Fisher Scientific | 15544034 | |
| Serum, Cell Culture, Fetal Bovine Serum (Fbs), Hyclone, Characterized Canadian | cytivalifesciences | SH3039602 | Addition to the serum free medim for the transfected cells |
| Sf9 cells | Thermo Fisher | 12659017 | Insect cells |
| Sfx-Insect Cell Culture Media | Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences) | SH3027802 | Serum free insect cells growth medium |
| Tape Pad | Qiagen | 19570 | Tape Pad |
| Taq DNA Polymerase with ThermoPol Buffer – 2,000 units | New England Biolabs | M0267L | |
| Tetracycline Hcl | BioShop | TET701.10 | |
| Trypan Blue 0.4% Solution | Gibco | 15250061 | For assessment of cell viability |
| VITLAB Reagent Bottles, PP with Screw Caps, PP, BrandTech, 5L | VITLAB | V100889 | For large scale protein production in suspension culture of Sf9 cells |
| VWR Digital Mini Incubator | VWR | 10055-006 | Incubator for adherent Sf9 cells |
| VWR Incubating Microplate Shaker | VWR | 97043-606 | Incubator for suspension culture of Sf9 cells in 24 well blocks |
| VWR Petri Dishes | VWR | CA73370-037 | |
| X-tremeGene 9 DNA Transfection Reagent 1.0 M | Roche | 6365787001 | For Sf9 cells transfection to generate recombinant baculovirus |
References
- Guccione, E., Richard, S. The regulation, functions and relevance of arginine methylation. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 20 (10), 642-657 (2019).
- Thandapani, P., O’Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. Defining the RGG/RG motif. Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).
- Lorton, B. M., Shechter, D. Cellular consequences of arginine methylation. Cell and Molecular Life Sciences. 76 (15), 2933-2956 (2019).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: Who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2008).
- Frankel, A., Brown, J. I. Evaluation of kinetic data: What the numbers tell us about PRMTs. Biochimica Biophysica Acta Proteins Proteomics. 1867 (3), 306-316 (2018).
- Li, A. S. M., Li, F., Eram, M. S., Bolotokova, A., Dela Seña, C. C., Vedadi, M. Chemical probes for protein arginine methyltransferases. Methods. 175, 30-43 (2020).
- Savitsky, P., et al. High-throughput production of human proteins for crystallization: The SGC experience. Journal of Structural Biology. 172, 3-13 (2010).
- Gileadi, O., et al. Expressing the human proteome for affinity proteomics: Optimizing expression of soluble protein domains and in vivo biotinylation. New Biotechnology. 29 (5), 515-525 (2012).
- Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5, 135 (2008).
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23, 567-575 (2005).
- Jarvis, D. L. Baculovirus-insect cell expression systems. Methods in Enzymology. 463, 191-222 (2009).
- Shrestha, B., et al. Baculovirus expression vector system: an emerging host for high-throughput eukaryotic protein expression. Methods in Molecular Biology. 439, 269-289 (2008).
- Smith, G. E., Summers, M. D., Fraser, M. J. Production of human beta interferon in insect cells infected with a baculovirus expression vector. Molecular Cell Biology. 3, 2156-2165 (1983).
- Invitrogen Life Technologies. . Invitrogen, Bac-to-Bac Baculovirus expression system. , (2010).
- Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. Journal of Virology. 67, 4566-4579 (1993).
- Irons, S. L., Chambers, A. C., Lissina, O., King, L. A., Possee, R. D. Protein Production Using the Baculovirus Expression System. Current Protocol in Protein Sciences. 91, 1-22 (2018).
- Rieffel, S., et al. Insect cell culture in reagent bottles. MethodsX. 1, 155-161 (2014).
