Hedeflenen Nanopartiküllerin Çalışması için Meme Kanserinin Singeneik Murine Modelinden Primer Kanserle İlişkili Fibroblastların İzolasyonu

1. Meme kanserinin singeneik 4T1 modelinin oluşturulması NOT: Mevcut protokol, birincil CAL’lerin fare 4T1 meme tümöründen izolasyonu açıklanmaktadır. Burada açıklanan hayvan çalışması İtalya Sağlık Bakanlığı (aut. sayı 110/2018-PR) tarafından onaylanmıştır. Tümör hücre kültürü ve implantasyonu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mL’lik 1640 mL’lik bir T75 şişesinde fetal sığır serumu (FBS), %1 penisilin/streptomisin (P/S) ve %1 L-glutamin ile desteklenmiş 1 × 106 4T1-luc hücrelerini çözün. Kültür ortamına Mycoplasma kaldırma aracısı (1:100) ekleyin.NOT: 4T1-luc hücreleri luciferaz eksprese ve D-luciferin ile uygun stimülasyon üzerine biyolüminesans (BLI) ile görselleştirilebilir. Bu, farelerde implantasyon üzerine tümör hücrelerinin canlılığının ve çoğalmasının in vivo izlenmesini sağlar(Şekil 1). Ortamı her 2 günde bir değiştirerek hücreleri 37 °C ve%5 CO 2’de nemli bir atmosferde ~ izdihama kadar koruyun.NOT: Enjekte edilen hücrelerin mikoplazmadan arındırılmasını sağlamak için farelere enjeksiyondan önce 1 hafta boyunca (~2/3 pasajlar) Mycoplasma kaldırma maddesi ile tedaviye devam edin. İşlem gününde, hücreleri 37 °C’de 5 dakika boyunca 1 mL tripsin-etylenediaminetetraasetik asit (EDTA) çözeltisi (tripin 1:250) kullanarak ayırın. Kültür ortamı ekleyerek tripsin etkinliğini durdurun, trippan mavisi olan hücreleri sayın (1:1) ve hücre/mL sayısını hesaplayın. Pipet hacmi 1 × 106 hücreye ve santrifüj 5 dakika boyunca 400 × g. Süpernatantı dökün ve peletin 1 mL RPMI 1640 baz ortasına yeniden harcayın. Enjeksiyona hazır olana kadar hücreleri buzda tutun.NOT: Her fare için 1 × 105 hücre gereklidir; bununla birlikte, şırınna yüklemesini kolaylaştırmak için her zaman 2 farenin (2 ×10 5 hücreye karşılık gelen) fazlalığını hesaplayın. Ameliyattan bir gün önce, sağ taraftaki karın meme bezlerinin alanını ortaya çıkarmak için 8 BALB / c faresinin (dişi, yedi haftalık) kürklerini tıraş edin. Elektrikli bir tıraş makinesi kullanın ve 4 dakika boyunca ince bir depilasyon kremi tabakası uygulayın; ardından kremayı su ve bir parça kağıtla yıkayın. ~5 dakika boyunca % 2 izofluran gazının sürekli solunmasıyla anesteziye neden olun ve 27 G tüberkülin şırıng ile abdominal meme bezlerinin bölgesinde deri altı enjeksiyonu gerçekleştirin. Deri içine deri altından girmek için iğneyi yukarı doğru çevirin; ardından, cildi yukarı doğru tutun ve yavaşça 100 μL hücre süspansiyonu (1 × 105 hücre) enjekte edin. Şırıngayı yavaşça geri çekmeden önce iğneyi hafifçe çevirin.NOT: Hücre süspansiyonu enjeksiyondan 15 dakika önce oda sıcaklığına getirmeyi unutmayın. Tümör büyümesi ve diseksiyonu Hücre enjeksiyonundan 5 gün sonra, görüntülemeden 5 dakika önce intraperitoneally (100 μL) 150 mg/kg D-luciferin enjekte edin. 10 s pozlama, orta binning ve 4’te f/stop ayarını kullanarak BLI görüntülerini yakalayın. Tümörün parlaklık alanını ilgi alanı (ROI) olarak tanımlayın ve görüntüleme yazılımını kullanarak yatırım getirislerindeki toplam sinyali (foton/sn/m2)ölçün. BLI’deki artış açısından tümör büyümesini izlemek için enjeksiyondan itibaren her 5 günde bir görüntüleme prosedürünü (1.2.1) tekrarlayın. Tümör hacmini oluşturmak için fareyi tutun ve karnını açığa çıkarın. Tümör uzunluğunu (L) ve genişliğini (W) haftada bir kez ölçmek için kaliper kullanın. Denklem 1 kullanarak tümör hacmini (V) hesaplayın.[V = (L x W2)/2]     (1) Hücre enjeksiyonundan 20 gün sonra, hayvanları servikal çıkık ile kurban edin, tümörleri deriden makasla çözün ve bir doku depolama çözeltisinde toplayın (Bkz. Malzeme Tablosu).NOT: Tümör örnekleri tek hücreye (bölüm 2) ayrışmak için hemen kullanılabilir veya 48 saate kadar 4 °C’de saklanabilir. 2. Tümörlerin tek hücrelere ayrışması NOT: Aşağıdaki adımlar için laminer akış davlumbazında steril reaktifler ve tek kullanımlıklar kullanın. Aynı anda 4 tümörle çalışın. Tümör örneğini bir Petri kabına yerleştirin ve cımbız ve neşter yardımıyla cilt, yağ ve nekrotik alanların herhangi bir parçasını dikkatlice çıkarın. Daha sonra, tümörü yaklaşık 1-2 mm’lik küçük parçalara bölün ve bir tüpe aktarın (Şekil 2A).NOT: 4T1 tümörleri büyürken ülserasyon eğilimi ile yüksek oranda nekrotik hale gelir. Sonraki adımlarla enkazın herhangi bir müdahalesini önlemek için nekrotik alanları dikkatlice çıkarmak önemlidir. Tümör ayrışması için bir sindirim karışımı hazırlayın: 2.35 mL RPMI 1640 orta, 100 μL enzim D, 50 μL enzim R ve 12.5 μL enzim A karıştırın.NOT: Belirtilen sindirim karışımı hacimleri 1 g’a kadar olan tümörler için geçerlidir ve ağırlıklarına göre daha büyük tümörler için ayarlanabilir. Normalde 20 gün boyunca yetişen 4T1 tümörler 0.5–0.8 g aralığındadır. Tüpü ters çevirin, tüm tümör parçalarının tüpün altında kapağa doğru durduğunu kontrol edin. Tüpü uygun gövdedeki mekanik bir ayrışmaya takın ve sert tümörler için tasarlanmış belirli bir ayrışma programı çalıştırın (üreticinin talimatlarına bakın).NOT: Dissosiyatöre sığacak özel tüpler gerekebilir. C tüpleri, dokunun mekanik ayrışmasını teşvik etmek için kapağın içinde bir rotor taşır. Tüpü ayırın, baş aşağı saklayın ve numuneyi 37 °C’de hafifçe sallayarak 40 dakika kuluçkaya yatırın. Ardından, tüpü uygun gövdedeki ayrıştırıcıya takın ve sert tümörler için tasarlanmış aşağıdaki spesifik ayrışma programını iki kez çalıştırın. İşlemin sonunda büyük doku parçaları olmadığından emin olun(Şekil 2B).NOT: Tümörü ayrıştırmak için hücre dışı matrisi bozmak için başka enzim kokteylleri kullanılabilir. Bununla birlikte, bu protokolde, optimize edilmiş bir enzim karışımı (D, R, A enzimleri) içeren ticari olarak mevcut bir Tümör Ayrıştırma kiti ve dokuyu mekanik olarak ayrıştıran yarı otomatik bir ayrıştırıcı kullanılmıştır. Bu kombinasyon, hücre bütünlüğü ve hücre yüzeyi epitoplarının bakımı ile birlikte hücre dışı matrisin uygun bir şekilde bozulmasını sağladı. Numuneyi 50 mL’lik bir tüpte 40 μm hücre süzgeçten geçirin, filtreyi 10 mL RPMI 1640 orta ile yıkayın ve tüpü 300 × g’da 7 dakika santrifüjleyin. Hücre peletı kırmızı görünürse, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1 mL Amonyum-Klorür-Potasyum (ACK) liz tamponu ekleyerek eritrositleri, 10 mL RPMI 1640 ile yıkayın, hücre süspansiyonunu 15 mL’lik bir tüpe aktarın ve tekrar santrifüjün. Peleti fosfat tamponlu salin (PBS), %0,5 sığır serum albümin (BSA) ve 2 mM EDTA’dan oluşan 1 mL PBE tamponunda yeniden biriktirin ve trippan mavisi olan hücreleri sayın (1:1). Hücre kümeleri durumunda, hücre süspansiyonunu daha önce PBS ile ıslatılmış 70 μm hücre süzgecinden filtreleyin.NOT: Özellikle tümörler büyük olduğunda, hücre sayısını kontrol etmek ve sonunda2.7. 20x bağlayıcı tampon stok çözeltisini (Bkz. Malzeme Tablosu)steril çift damıtılmış su ile seyrelterek ölü hücre kaldırma bağlama tamponunu hazırlayın. Hücreleri 5 mL 1× bağlayıcı tamponlayıkayın ( Şekil 2C).NOT: Tamponu 4 °C’de tutun. 300 × g’da 7 dakika santrifüj ve hücre peletini 0,1 mL ölü hücre temizleme mikropları ile yeniden ıslatın (Bkz. Malzeme Tablosu). İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırarak. Boncuklarla inkübasyon sırasında, kaputun altına manyetik bir stand hazırlayın ve üzerine uçları aşağıyı işaret ederek ferromanyetik ayırma sütunlarını(10 7 hücreye kadar bir sütun) asın. Sütunları 0,5 mL soğuk 1× bağlama arabelleği ile aşındırın. Çözelti yerçekimi altında akana kadar bekleyin.NOT: Kolon yatağının pıhtılaşması ve geri kazanım veriminin azaltılması riskini önlemek için sütun başına hücre sayısını aşmamak önemlidir. 107’den fazla hücreyle çalışırken, toplam hücre sayısına göre daha fazla sütun kullanın veya daha büyük sütunlar kullanın. Bu gibi durumlarda, aşağıdaki adımlarda açıklanan reaktif hacimlerini üretici tarafından belirtilenlere ayarlayın. Kuluçkanın sonunda, boncuk / hücre süspansiyonuna 400 μL soğuk 1× bağlayıcı tampon ekleyin, tüm hacmi sütuna yükleyin ve atık suyu (etiketlenmemiş hücrelere karşılık gelen) 15 mL’lik bir tüpte toplayın. Sütunu 0,5 mL soğuk 1× bağlama tamponu ile dört kez yıkayın ve toplam atık suyu (canlı hücre fraksiyonuna karşılık gelen) aynı tüpte toplayın. Trypan mavisi olan hücreleri sayın (1:1). Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) için 1 ×10 5 hücreyi iki tüpe yerleştirin ve proses doğrulamasına kadar 4 °C’de tutun (bkz. adım 4.1): analiz parametrelerini ve pozitiflik bölgelerini (kontrol tüpü) ayarlamak için ilk tüpü ve diğeri biyobelirteç analizi (numune tüpü) için kullanın. CAL ayıklama için kalan hücreleri kullanın (bkz. bölüm 3).NOT: Bölüm 3’teki mikrobeadlarla spesifik olmayan reaksiyonları azaltmak için ölü hücrelerin çıkarılması önemlidir. Bununla birlikte, verimi artırmak için, ölü hücrelerin oranı% <20 ise ölü hücrelerin çıkarılmasından kaçının. 3. Birincil CAL’lerin meme tümöründen çıkarılması NOT: Bölüm 3 için, hücrelerin manyetik etiketlemesi için uygun Tümörle İlişkili Olmayan Fibroblast Tükenme Kokteyli ve Tümörle İlişkili Fibroblast Mikrobeadları içeren Tümörle İlişkili Fibroblast İzolasyon kitini kullanın (Bkz. Malzeme Tablosu). Kanserle ilişkili olmayan fibroblastların tükenmesi PBS ile 70 μm hücre süzgecini nemlendirin ve kümeleri çıkarmak için hücre süspansiyonunu filtreleyin. Daha sonra, hücreleri 300 g’da 10 dakika × ve süpernatantı aspire edin.NOT: Tek bir tümör adım 2.7 için iki örneğe ayrılmışsa, 3.1.2 adımına geçmeden önce hücre süspansiyonu ikiye iki havuz. Peleti 80 μL soğuk PBE tamponunda yeniden depoleyin ve 20 μL Tümörle İlişkili Olmayan Fibroblast Tükenme Kokteyli ekleyin. İyice karıştırın ve karanlıkta 15 dakika boyunca 4 °C’de kuluçkaya yatırın. Boncuklarla inkübasyon sırasında, manyetik bir stand üzerinde ferromanyetik tükenme sütunları (örnek başına 1) hazırlayın ve sütunları 2 mL soğuk PBE tamponu ile dengeler. Çözüm akana kadar bekleyin. Kuluçkanın sonunda, boncuk / hücre süspansiyonuna 400 μL soğuk PBE tamponu ekleyin, tüm hacmi sütuna yükleyin ve atık suyu (etiketlenmemiş hücrelere karşılık gelen) 15 mL’lik bir tüpte toplayın. Sütunu 2 mL soğuk PBE tamponu ile iki kez yıkayın ve toplam atık suyu aynı tüpte toplayın. 300 × g’da 10 dakika santrifüj ve 0,1 mL soğuk PBE tamponunda yeniden depola.NOT: Kanserle ilişkili olmayan fibroblastların tükenmesi, kurtarılan toplam hücre miktarını büyük ölçüde azaltır. Genellikle gereklidir ve görünür bir pelet ve adım 3.2 için yeterli hücre elde etmek için dört farklı örnekten hücre süspansiyonlarının havuza alınması önerilir. Bu, optimum verim sağlayacaktır. Hücre süspansiyonunun 20 μL’sini bir FACS tüpüne yerleştirin ve işlem doğrulaması için 4 °C’de tutun (bkz. bölüm 4). CAF seçimi için kalan hücreleri kullanın (bkz. adım 3.2). Kanserle ilişkili fibroblastların pozitif seçimi 80 μL hücre süspansiyonu için 20 μL Tümörle İlişkili Fibroblast Mikrobürüs ekleyin. İyice karıştırın ve karanlıkta 15 dakika boyunca 4 °C’de kuluçkaya yatırın. Boncuklarla inkübasyon sırasında, manyetik bir stand üzerinde ferromanyetik ayırma sütunları (örnek başına 1) hazırlayın ve sütunları 0,5 mL soğuk PBE tamponu ile dengeler. Çözüm akana kadar bekleyin. Kuluçkanın sonunda, boncuk / hücre süspansiyonuna 400 μL soğuk PBE tamponu ekleyin, tüm hacmi sütuna yükleyin ve etiketlenmemiş hücrelerin 15 mL’lik bir tüpe akmasını bekleyin. Sütunu 0,5 mL soğuk PBE tamponu ile üç kez yıkayın ve toplam atık suyu aynı tüpte toplayın.NOT: Akış, kanserle ilişkili olmayan fibroblastlar olarak atılabilen etiketsiz CD90.2 negatif hücreler içerir. Kolonu mıknatıstan çıkarın ve 1,5 mL’lik bir tüpe yerleştirin. Sütuna 1 mL soğuk PBE ekleyin ve hücreleri boşaltmak için pistonu hemen sütuna itin. 400 × g’da 10 dakika santrifüj ve 0,1 mL soğuk PBE tamponunda yeniden depola. 20 μL hücre süspansiyonu bir FACS tüpüne yerleştirin ve proses doğrulaması için 4 °C’de tutun (bkz. bölüm 4).NOT: Santrifüjlemeden sonra, özellikle orijinal tümörler küçük olduğunda pelet neredeyse hiç görünmeyebilir. Konik alt santrifüj tüpleri kullanın ve süpernatantı adederek herhangi bir hücre kaybetmemeye dikkat edin. Kalan hücreleri% 15 FBS, 2 mM L-glutamin, % 1 P / S ve% 1 esansiyel olmayan amino asitlerle desteklenmiş Uygun bir Hacimde Dulbecco’nun Modifiye Kartal Ortası (DMEM)/Ham’ın F-12’sinde seyreltin ve hücreleri bir doku kültürü plakasına tohumladı. Mikroskop altında hücre yoğunluğunu kontrol edin ve hücrelerin yapışmasını ve büyümesini sağlamak için plakayı 37 °C ve% 5 CO2’de bir inkübatöre yerleştirin.NOT: Hücreler çok yoğunsa, plakayı inkübatöre yerleştirmeden önce hücre süspansiyonu derhal doku kültürü plakasının iki kuyusuna bölün. 4. Süreç doğrulaması Akış sitometrisiNOT: Bölüm 4.1 steril koşullar gerektirmez ve laminar davlumbazın dışında yapılabilir. Bölüm 4.1’i 2.11 (ayrışmış tümör), adım 3.1.6 (kanserle ilişkili olmayan fibroblastların tükenmesi sonrasında) ve 3.2.6 adımında (kanserle ilişkili fibroblastların zenginleştirilmesinden sonra) toplanan örneklere paralel olarak gerçekleştirin. 2.11, 3.1.6 ve 3.2.6 adımlarında hazırlanan FACS tüplerini 300 × g’da 10 dakika boyunca santrifüj edin. Üstnatant atın.NOT: Analiz parametrelerini ayarlamak için bir kontrol görevi gören, lekesiz hücreler içeren en az bir ek tüp hazırlayın. Numune tüplerinde, 88 μL PBE’de hücreleri yeniden kullanın, ve floresan izotiyosiyanat ile konjuge 2 μL anti-CD45 antikoru (FITC, üreticinin talimatlarına göre 1:50 seyreltme) ve fitoerythrin ile konjuge 10 μL anti-CD90.2 antikor ekleyin (PE, 1:10 seyreltme, üreticinin talimatlarına göre). İyice karıştırın ve karanlıkta 4 °C’de 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kontrol tüpünde (kullanılmamış), 100 μL PBE’de hücreleri yeniden biriktirin. Antikor lekeli hücreler için izlenen prosedürü çoğaltmak için karanlıkta 4 °C’de 10 dakika kuluçkaya yatırın.NOT: Bu tür değişkenlerdeki bir değişiklik zayıf veya spesifik olmayan lekelenmeye neden olabileceğinden, sıcaklık ve kuluçka süresi dikkatlice kontrol edilmelidir, böylece sonuçlar değiştirilebilir. Kuluçka adımını tamamladıktan sonra, 1 mL PBE ekleyerek bir yıkama gerçekleştirin. 300 x g’da 10 dakika santrifüj. Üstnatant atın. Hücreleri (tüm tüpleri) 500 μL PBS’de yeniden biriktirin. İyice karıştırın ve akış sitometrisi analizine devam edin. Antikorların floresanını (fitc ve PE) ölçmek için kanalları ayarlayın. Kontrol tüpünden, İleri ve Yan dağılım (FSC vs SSC) çiziminde bir ilk kapı (P1) çizerek tüm uygulanabilir hücreleri seçin. P1 içinde, yalnızca tek hücreli ikinci bir kapı (P2) ayarlayın. Antikorların spesifik floresan kanallarını (fitc ve PE) kullanarak, pozitif lekeli hücreleri ayırt etmek için uygun kapıları ayarlayın. Analizi başlatın ve P2’de en az 10.000 olay kaydedin. Her iki kanaldan gelen sinyalleri aynı anda okuyun.NOT: Genel hücre sayısı beklenenden azsa, tüpün tamamını okumak tercih edilebilir. (İsteğE BAĞLI) Ek antikorlar/floroforlarla daha fazla boyama programlanırsa, analizi başlatmadan önce uygun bir kompanzasyon matrisi ayarlayın. Hücre morfolojisinin ve özelliklerinin izlenmesiNOT: Tohumlandıktan sonra, hücreler steril koşullar altında ele alınmalıdır. Tohumlamadan sonraki gün, hücre yapışıklık ve morfolojisini kontrol etmek için hücreleri optik mikroskop altında görselleştirin. Süpernatantı aspire edin ve taze ortamla değiştirin.NOT: CAL’ler, 4T1 tümör hücrelerinin epitel benzeri yapısından kolayca ayırt edilebilen büyük iğ şeklindeki hücrelerdir. Hücreleri nemli bir atmosferde 37 °C ve%5 CO2’de tutarak ortamı her 2 günde bir değiştirebilirsiniz. Hücreler ~ izdihama ulaştığında (tohumlamadan yaklaşık 4-6 gün sonra), hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca TrypLE Select çözeltisini (Malzeme Tablosunabakın) kullanarak ayırın. Taze orta (4:1) ekleyin, hücre süspansiyonu 400 × g’da 5 dakika santrifüjleyin ve peletin taze ortamda yeniden ıslatın. Hücreleri 1:2 bölün ve deneme için gereken hücre sayısı elde edilene kadar kültürü genişletin. Her pasajda, hücre morfolojisi ve büyümesini optik mikroskop altında kontrol edin. Hücre morfolojisi homojen değilse (örneğin, kültürde görünen küçük yuvarlak şekilli hücrelerin klonları), bölüm 4.1’de açıklandığı gibi akış sitometrisine göre bir hücre örneğini analiz edin. Homojense, adım 4.2.7’ye geçin.NOT: Hücre morfolojislerindeki değişiklikler, kültür saflığını sağlamak için çıkarılması gereken kanserle ilişkili olmayan fibroblastların kontaminasyona işaret edebilir. Akış sitometrisi sonuçlarını analiz edin ve aşağıdaki senaryolardan birine göre devam edin: (i) CD90.2-/CD45- hücrelerinin kirlenmesi meydana gelirse, tüm hücreleri toplayın ve 3.2 adımını izleyerek pozitif seçimi tekrarlayın; (ii) CD45+ hücrelerinin kirlenmesi de meydana gelirse, tüm hücreleri toplayın ve 3.1. (iii) herhangi bir kirlenme meydana gelmezse (sadece CD90.2+/CD45- hücreler mevcutsa), hücreleri kültürde tutun ve doğrudan 4.2.7’ye ilerleyin.NOT: Tükenme işleminin mikrobeadlarla tekrarlanması hücre iyileşmesini azaltacağından, yalnızca hücrelerin hemen kullanılması gerekmediğinde önerilir. Trippan mavisi (1:1) ile hücreleri sayın, iki FACS tüpüne 5 ×10 5 hücre yerleştirin ve 300 × g’da 10 dakika santrifüj. Üstnatantı atın ve peleti oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 0,5 mL blokaj tamponunda (%2 BSA, %2 keçi serumu ile desteklenmiş PBS) yeniden depolayın.NOT: Bir tüp sadece yersiz hücrelerden oluşan bir kontrol görevi görürken, ikinci tüpteki hücreler akış sitometri analizi için lekelenir. 300 × g’da 10 dakika santrifüj, süpernatantı atın ve 99 μL bloklama tamponunda yeniden dirildi. Numune tüpüne 1 μg anti-FAP antikoru ve kontrol tüpüne 1 mL blokaj tamponu ekleyin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırarak.NOT: FAP reaktif tümör stromasının bir yüzey belirtecidir ve CAL’leri tanımlamak ve karakterize etmek için kullanılabilir. Pbs, santrifüj ile üç kez yıkayın ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bloke tamponunda floresan boya (1 μg) ile konjuge edilen uygun ikincil antikorla kuluçkaya yatırın. PBS ile üç kez yıkayın ve akış sitometrisine göre analiz edin (kullanılan floroforu tespit etmek için uygun kanalı ayarlayarak 4.1.5 ila 4.1.7 adımlarını izleyin). Ardından, deneyler için hücreleri kullanın (adım 5.2). (İsteğE BAĞLI) Bir hücre örneğini 1 mL FBS ve dimetil sülfit (DMSO) içinde dondurun; daha fazla kullanım için -80 °C’de saklayın. 5. Mühendislik Ferritin nanopartikülleri tarafından hedeflenen CAL’ler NOT: İnsan ferritin ağır zincirinin (HFn) rekombinant bir varyantı çıplak nanopartikül olarak kullanıldı veya hedefleme moieties ile eşleştirilmiştir. Burada, bir anti-FAP antikorunun değişken kısmıyla işlevsel hale getirilen HFn nanopartikülleri (Fab@FAP), Milano-Bicocca Üniversitesi’ndeki NanoBioLab tarafından daha önce açıklanan bir protokole göre 1:1 ve 1:5 olmak üzere iki HFn:Fab@FAP molar oranındahazırlandı. HFn nanopartiküllerinin floresan etiketlemesiNOT: Hem çıplak hem de işlevselleştirilmiş HFn nanokaçamları floresan olarak FITC ile etiketlenmiştir. FITC tozunun % 99 etanol içinde çözülerek 2 mg/mL konsantrasyon elde edin.NOT: Bu çözüm taze olarak hazırlanmalıdır. Her 1 mg protein için hazırlanan çözeltinin 50 μL’sini (200 μg FITC) kuluçkaya yatırın (yani, 10 mg/mL’de 100 μL HFn). 50 μL 1 M sodyum bikarbonat (NaHCO3)ekleyin ve 0,1 M NaHCO 3 ile hacmi 500 μL’yeayarlayın.NOT: Hacimleri deneysel ihtiyaçlara göre ölçeklendirin. Reaksiyon karışımını oda sıcaklığında, karanlıkta ve 1 saat boyunca sürekli karıştırarak kuluçkaya yatırın. Bir spin tuzdan arındırma sütunu (7 kDa MWCO) kullanarak jel filtrasyonu ile FITC’nin fazlalığını konjugeden çıkarın. Bir spektrofotometre kullanarak geri kazanılan etiketli proteinin konsantrasyonunu değerlendirin. Absorbansı sırasıyla 280 nm ve 488 nm olarak ölçerek protein ve boya miktarlarını tahmin edin. HFn nanopartiküllerinin CAL’lere bağlanmasıNOT: Kültürde en geç 4-5 numaralı pasajlardan CAL’ler kullanın. Her FACS tüpüne 5 ×10 5 hücre yerleştirin, 300 × g’da 10 dakika santrifüj, ve 0.5 mL PBS’de resuspend, 0.3% BSA nanopartiküllerin farklı preparatlarının 0.1 mg / mL ile desteklenmiştir (çıplak HFn, HFn-Fab@FAP 1:1, HFn-Fab@FAP 1:5) daha önce FITC ile etiketlenmiştir.NOT: Her koşulu üç taraflı olarak çalıştırın. Nanopartiküllerin eklenmediği bir kontrol etiketsiz numunesi olarak ek bir tüp hazırlayın. Karanlıkta 4 °C’de 2 saat kuluçkaya yaslanın, santrifüjlayın ve PBS’de üç kez yıkayın. Hücreleri 0,5 mL PBS ile yeniden biriktirin, iyice karıştırın ve akış sitometrisine göre analiz edin. FITC’nin floresanını ölçmek için kanalları ayarlayın. Canlı tek hücreye geçtikten sonra 20.000 etkinlik elde edin. FITC pozitiflik kapısını ayarlamak ve FITC+ olaylarının yüzdesini elde etmek için (nanopartikül bağlamaya karşılık gelen) kontrol etiketsiz tüpü kullanın. 6. İstatistiksel analiz ve deneysel çoğaltmalar Hayvan 1.1.5’te açıklandığı gibi, tek bir deney başına 8 hayvan kullanarak tümör büyümesi ve CAL izolasyonu için üç bağımsız deney gerçekleştirin. CAL’lerin yalıtım verimini en iyi duruma getirmek için, ekscislenmiş dokuları alt gruplara (n=4) bölün ve bölüm 2’de açıklanan adımları izleyerek bunları işleyin. Hücrelerle HFn etkileşimi fonksiyonelleştirilmiş ve işlevselleştirilmemiş HFn’nin hedef ve hedef olmayan hücrelerle (sırasıyla CAL’ler ve 4T1) etkileşimini floresan etiketli nanokageler tarafından pozitif lekeli hücrelerin yüzdesi açısından değerlendirin. Sonuçları üç bağımsız deneyin ortalama ± standart sapması olarak bildirin. İstatistiksel analiz HFn ve HFn-FAP ile hücre bağlama deneylerinde istatistiksel önemi hesaplamak için sıradan tek yönlü ANOVA testini kullanın.