Aislamiento de fibroblastos asociados al cáncer primario a partir de un modelo murino singénico de cáncer de mama para el estudio de nanopartículas dirigidas

1. Establecimiento de un modelo singénico 4T1 de cáncer de mama NOTA: El presente protocolo describe el aislamiento de los CAF primarios de un tumor de mama 4T1 de ratón. El estudio en animales descrito aquí ha sido aprobado por el Ministerio de Salud italiano (número de registro 110/2018-PR). Cultivo e implantación de células tumorales Descongelar 1 ×10 6 células 4T1-luc en un matraz T75 con 10 ml de medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con suero bovino fetal (FBS) al 10%, penicilina/estreptomicina al 1% (P/S) y L-glutamina al 1%. Añadir el agente de eliminación de micoplasma (1:100) en el medio de cultivo.NOTA: Las células 4T1-luc expresan de manera estable la luciferasa y pueden visualizarse por bioluminiscencia (BLI) tras la estimulación adecuada con D-luciferina. Esto permite monitorizar in vivo la viabilidad y proliferación de células tumorales tras la implantación en ratones(Figura 1). Mantenga las células a 37 °C y 5% de CO2 en una atmósfera humidificada hasta ~80% de confluencia, cambiando el medio cada 2 días.NOTA: Continúe el tratamiento con el agente de eliminación de micoplasma durante 1 semana (~ 2/3 pasajes) antes de la inyección en ratones para asegurarse de que las células inyectadas estén libres de micoplasma. El día del procedimiento, separe las células utilizando 1 ml de solución de ácido tripsina-etilendiaminatetraacético (EDTA) (tripsina 1:250) durante 5 min a 37 °C. Detenga la actividad de la tripsina agregando medio de cultivo, cuente las células con azul de tripano (1:1) y calcule el número de células/ml. Pipetear el volumen correspondiente a 1 × 106 celdas y centrifugar durante 5 min a 400 × g. Vierta el sobrenadante y vuelva a gastar el pellet en 1 ml de medio base RPMI 1640. Mantenga las células en hielo hasta que estén listas para la inyección.NOTA: Para cada ratón, se necesitan 1 × 105 celdas; sin embargo, siempre calcule para un exceso de 2 ratones (correspondiente a 2 × 105 células) para facilitar la carga de la jeringa. Un día antes de la operación, afeitar el pelaje de 8 ratones BALB / c (hembra, de siete semanas de edad) para exponer el área de las glándulas mamarias abdominales en el lado derecho. Use una afeitadora eléctrica y aplique una capa delgada de crema depilatoria durante 4 minutos; luego, lava la crema con agua y un pedazo de papel. Inducir anestesia por inhalación continua de gas isoflurano al 2% durante ~5 min, y realizar una inyección subcutánea en la región de las glándulas mamarias abdominales con una jeringa de tuberculina de 27 G. Gire la aguja hacia arriba para entrar en la piel por vía subcutánea; luego, sostenga la piel hacia arriba e inyecte lentamente 100 μL de suspensión celular (1 × 105 células). Gire ligeramente la aguja antes de retraer lentamente la jeringa.NOTA: Recuerde llevar la suspensión celular a temperatura ambiente 15 minutos antes de la inyección. Crecimiento tumoral y disección A los 5 días después de la inyección celular, inyecte 150 mg/kg de D-luciferina por vía intraperitoneal (100 μL) 5 min antes de la toma de imágenes. Capture imágenes BLI utilizando un sistema de imágenes in vivo que establece la exposición de 10 s, el binning medio y el f/stop a 4. Defina el área luminiscente del tumor como la región de interés (ROI) y cuantifique la señal total en el ROI (fotón/seg/m2)utilizando un software de imágenes. Repita el procedimiento de obtención de imágenes (1.2.1) cada 5 días a partir de la inyección para controlar el crecimiento del tumor en términos de un aumento de la BLI. Para establecer el volumen del tumor, sostenga al ratón y exponga su vientre. Use pinzas para medir la longitud (L) y el ancho (W) del tumor una vez a la semana. Calcular el volumen tumoral (V) usando la ecuación 1.[V = (L x W2)/2]     (1) A los 20 días después de la inyección celular, sacrifique a los animales por dislocación cervical, disociar los tumores de la piel con tijeras y recogerlos en una solución de almacenamiento de tejido (consulte la Tabla de materiales).NOTA: Las muestras tumorales pueden utilizarse inmediatamente para la disociación en células individuales (sección 2) o almacenarse a 4 °C durante un tiempo de hasta 48 h. 2. Disociación tumoral en células individuales NOTA: Para los siguientes pasos, use reactivos estériles y desechables en una campana de flujo laminar. Trabajar con 4 tumores a la vez. Coloque la muestra del tumor en una placa de Petri y extraiga cuidadosamente cualquier fragmento de piel, grasa y áreas necróticas con la ayuda de pinzas y bisturí. Luego, reduzca el tumor en pequeños trozos de aproximadamente 1-2 mm y transfiéralos a un tubo(Figura 2A).NOTA: Los tumores 4T1 se vuelven altamente necróticos mientras crecen, con tendencia a la ulceración. Es importante retirar cuidadosamente las áreas necróticas para evitar cualquier interferencia de escombros con los siguientes pasos. Prepare una mezcla de digestión para la disociación tumoral: mezcle 2,35 ml de medio RPMI 1640, 100 μL de enzima D, 50 μL de enzima R y 12,5 μL de enzima A. Remoje los fragmentos tumorales en la solución y cierre firmemente el tubo.NOTA: Los volúmenes indicados de mezcla de digestión son válidos para tumores de hasta 1 g y pueden ajustarse para tumores más grandes según su peso. Los tumores 4T1 cultivados durante 20 días normalmente están en un rango de 0.5 a 0.8 g. Gire el tubo boca abajo, comprobando que todos los trozos de tumor se encuentran en la parte inferior del tubo hacia la tapa. Conecte el tubo a un disociador mecánico en la carcasa adecuada y ejecute un programa de disociación específico diseñado para tumores difíciles (consulte las instrucciones del fabricante).NOTA: Es posible que se requieran tubos especiales para encajar en el disociador. Los tubos en C llevan un rotor dentro de la tapa para promover la disociación mecánica del tejido. Separe el tubo, manténgalo boca abajo e incube la muestra a 37 °C durante 40 min con un suave agitación. Luego, conecte el tubo al disociador en la carcasa adecuada y ejecute el siguiente programa de disociación específico diseñado para tumores difíciles dos veces. Asegúrese de que no haya grandes trozos de tejido al final del procedimiento(Figura 2B).NOTA: Para disociar el tumor, se podrían usar otros cócteles enzimáticos para degradar la matriz extracelular. Sin embargo, en este protocolo, se utilizó un kit de disociación tumoral disponible comercialmente que contiene una mezcla de enzimas optimizada (enzimas D, R, A) y un disociador semiautomatizado que disocia mecánicamente el tejido. Esta combinación aseguró una degradación adecuada de la matriz extracelular junto con el mantenimiento de la integridad celular y los epítopos de la superficie celular. Filtre la muestra a través de un colador de células de 40 μm en un tubo de 50 ml, lave el filtro con 10 ml de medio RPMI 1640 y centrífuga el tubo durante 7 minutos a 300 × g. Si el gránulo celular aparece rojo, lise los eritrocitos agregando 1 ml de tampón de lisado de cloruro de amonio-potasio (ACK) durante 5 minutos a temperatura ambiente, lave con 10 ml de RPMI 1640, transfiera la suspensión celular en un tubo de 15 ml y centrífuga nuevamente. Resuspend el pellet en 1 mL de tampón PBE compuesto de solución salina tamponada con fosfato (PBS), albúmina sérica bovina (BSA) al 0,5% y EDTA 2 mM, y contar las células con azul de tripano (1:1). En caso de grupos celulares, filtre la suspensión celular a través de un colador celular de 70 μm, previamente empapado con PBS.NOTA: Especialmente cuando los tumores son grandes, es importante verificar el recuento de células y, finalmente, dividir cada muestra de tumor en diferentes tubos con no más de 107 células en cada tubo antes de proceder al paso 2.7. Prepare el tampón de unión de eliminación de células muertas diluyendo la solución de almacenamiento intermedio de unión 20x (consulte la Tabla de materiales)con agua estéril de doble destilación. Lavar las celdas con 5 ml de tampón de unión de 1× (Figura 2C).NOTA: Mantenga el búfer a 4 °C. Centrifugar durante 7 min a 300 × g, y resuspend el pellet celular con 0,1 mL de microperlas de eliminación de células muertas (ver la Tabla de Materiales). Mezclar bien e incubar a temperatura ambiente durante 15 min. Durante la incubación con cuentas, prepare un soporte magnético debajo del capó y cuelgue columnas de separación ferromagnética (una columna para hasta 107 celdas) con las puntas apuntando hacia abajo. Equilibre las columnas con 0,5 ml de búfer de unión frío de 1×. Espere hasta que la solución haya fluido bajo gravedad.NOTA: Es importante no exceder el número de células por columna para evitar cualquier riesgo de coagulación del lecho de la columna y reducir el rendimiento de recuperación. Cuando trabaje con más de 107 celdas, use más columnas de acuerdo con el número total de celdas o use columnas más grandes. En tales casos, ajuste los volúmenes de reactivo descritos en los siguientes pasos a los indicados por el fabricante. Al final de la incubación, agregue 400 μL de tampón de unión frío 1× a la suspensión de perlas / células, cargue todo el volumen en la columna y recoja el efluente (correspondiente a células no etiquetadas) en un tubo de 15 ml. Lave la columna cuatro veces con 0,5 ml de tampón de unión frío de 1× y recoja el efluente total (correspondiente a la fracción de célula viva) en el mismo tubo. Cuente las celdas con azul tripano (1:1). Coloque 1 × 105 celdas en dos tubos para la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y manténgalas a 4 °C hasta la validación del proceso (consulte el paso 4.1): utilice el primer tubo para establecer los parámetros de análisis y las regiones de positividad (tubo de control) y el otro para el análisis de biomarcadores (tubo de muestra). Utilice las células restantes para la extracción de CAF (ver sección 3).NOTA: La eliminación de células muertas es importante para reducir las reacciones inespecíficos con las microperlas de la sección 3. Sin embargo, para mejorar el rendimiento, evite la eliminación de células muertas si la proporción de células muertas es <20%. 3. Extracción de CAF primarios del tumor de mama NOTA: Para la sección 3, utilice el kit de aislamiento de fibroblastos asociado a tumores de ratón que contiene cóctel de agotamiento de fibroblastos no asociado al tumor y microperlas de fibroblastos asociadas al tumor adecuadas para el etiquetado magnético de las células (consulte la Tabla de materiales). Agotamiento de fibroblastos no asociados al cáncer Humedezca un colador celular de 70 μm con PBS y filtre la suspensión celular para eliminar cualquier grumos. Luego, centrifuga las células durante 10 min a 300 × g y aspira el sobrenadante.NOTA: Si un solo tumor se dividió en dos muestras para el paso 2.7, auna la suspensión celular de dos en dos antes de continuar con el paso 3.1.2. Resuspend el pellet en 80 μL de tampón frío de PBE y agregue 20 μL de cóctel de agotamiento de fibroblastos no asociado a tumores. Mezclar bien e incubar a 4 °C durante 15 min en la oscuridad. Durante la incubación con perlas, prepare columnas de agotamiento ferromagnético (1 por muestra) en un soporte magnético y equilibre las columnas con 2 ml de tampón de PBE frío. Espere hasta que la solución haya fluido. Al final de la incubación, agregue 400 μL de tampón de PBE frío a la suspensión de perlas / células, cargue todo el volumen en la columna y recoja el efluente (correspondiente a células no etiquetadas) en un tubo de 15 ml. Lave la columna dos veces con 2 ml de tampón de PBE frío y recoja el efluente total en el mismo tubo. Centrifugar durante 10 min a 300 × g y resuspend en 0,1 mL de tampón PBE frío.NOTA: El agotamiento de los fibroblastos no asociados al cáncer reduce drásticamente la cantidad total de células recuperadas. En general, es necesario y recomendado agrupar suspensiones celulares de cuatro muestras diferentes para obtener un gránulo visible y suficientes células para el paso 3.2. Esto asegurará un rendimiento óptimo. Coloque 20 μL de la suspensión celular en un tubo FACS y manténgala a 4 °C para la validación del proceso (ver sección 4). Utilice las celdas restantes para la selección de CAF (consulte el paso 3.2). Selección positiva de fibroblastos asociados al cáncer Añadir 20 μL de microperlas de fibroblastos asociadas a tumores a 80 μL de suspensión celular. Mezclar bien e incubar a 4 °C durante 15 min en la oscuridad. Durante la incubación con perlas, prepare columnas de separación ferromagnética (1 por muestra) en un soporte magnético y equilibre las columnas con 0,5 ml de tampón PBE frío. Espere hasta que la solución haya fluido. Al final de la incubación, agregue 400 μL de tampón de PBE frío a la suspensión de perlas / células, cargue todo el volumen en la columna y deje que las células no etiquetadas fluyan a través de un tubo de 15 ml. Lave la columna tres veces con 0,5 ml de tampón de PBE frío y recoja el efluente total en el mismo tubo.NOTA: El flujo continuo contiene células CD90.2 negativas sin etiquetar, que pueden descartarse como fibroblastos no asociados al cáncer. Retire la columna del imán y colóquela en un tubo de 1,5 ml. Agregue 1 ml de PBE frío a la columna e inmediatamente empuje el émbolo hacia la columna para eliminar las celdas. Centrifugar durante 10 min a 400 × g y resuspend en 0,1 mL de tampón PBE frío. Colocar 20 μL de suspensión celular en un tubo FACS y mantenerlo a 4 °C para la validación del proceso (ver sección 4).NOTA: Después de la centrifugación, el pellet puede ser apenas visible, especialmente cuando los tumores originales son pequeños. Use tubos cónicos de centrífuga inferior y tenga cuidado de no perder ninguna célula cuando aspire al sobrenadante. Diluya las células restantes en un volumen apropiado de Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)/Ham’s F-12 suplementado con 15% de FBS, 2 mM de L-glutamina, 1% de P/S y 1% de aminoácidos no esenciales, y semeque las células en una placa de cultivo de tejidos. Verifique la densidad celular bajo un microscopio y coloque la placa en una incubadora a 37 ° C y 5% de CO2 para permitir que las células se adhieran y crezcan.NOTA: Si las células son demasiado densas, divida inmediatamente la suspensión celular en dos pozos de la placa de cultivo de tejidos antes de colocar la placa en la incubadora. 4. Validación de procesos Citometría de flujoNOTA: La sección 4.1 no requiere condiciones estériles y se puede realizar fuera de la campana laminar. Realizar la sección 4.1 en paralelo para las muestras recogidas en el paso 2.11 (tumor disociado), el paso 3.1.6 (después del agotamiento de los fibroblastos no asociados al cáncer) y el paso 3.2.6 (después del enriquecimiento de los fibroblastos asociados al cáncer). Centrifugar los tubos FACS preparados en los pasos 2.11, 3.1.6 y 3.2.6 durante 10 min a 300 × g. Deseche el sobrenadante.NOTA: Prepare al menos un tubo adicional, que contenga células no teñidas que actúen como un control para establecer los parámetros para el análisis. En los tubos de muestra, resuspenda las células en 88 μL de PBE, y agregue 2 μL de anticuerpo anti-CD45 conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC, dilución 1:50, según las instrucciones del fabricante) y 10 μL de anticuerpo anti-CD90.2 conjugado con ficoeritirina (PE, dilución 1:10, según las instrucciones del fabricante). Mezclar bien e incubar durante 10 min a 4 °C en la oscuridad. En el tubo de control (sin teñir), resuspend las células en 100 μL de PBE. Incubar durante 10 min a 4 °C en la oscuridad para replicar el procedimiento seguido para las células teñidas con anticuerpos.NOTA: La temperatura y el tiempo de incubación deben verificarse cuidadosamente, ya que una variación en tales variables podría resultar en una tinción deficiente o inespecífico, alterando así los resultados. Después de completar el paso de incubación, realice un lavado agregando 1 ml de PBE. Centrífuga durante 10 min a 300 x g. Deseche el sobrenadante. Resuspend células (todos los tubos) en 500 μL de PBS. Mezclar bien y proceder con el análisis de citometría de flujo. Establezca los canales para medir la fluorescencia de los anticuerpos (es decir, FITC y PE). Desde el tubo de control, seleccione todas las celdas viables dibujando una primera puerta (P1) en la gráfica de dispersión hacia adelante versus lado (FSC vs SSC). Dentro de P1, establezca una segunda puerta (P2) que comprenda solo celdas individuales. Utilizando los canales de fluorescencia específicos de los anticuerpos (es decir, FITC y PE), establezca las puertas adecuadas para discernir las células teñidas positivamente. Inicie el análisis y registre al menos 10,000 eventos en P2. Lea las señales de ambos canales simultáneamente.NOTA: Si el número total de células es menor de lo esperado, podría ser preferible leer todo el tubo. (OPCIONAL) Si se programa una tinción adicional con anticuerpos / fluoróforos adicionales, establezca una matriz de compensación adecuada antes de iniciar el análisis. Seguimiento de la morfología y características celularesNOTA: Una vez secuestradas, las células deben manipularse en condiciones estériles. El día después de la siembra, visualice las células bajo un microscopio óptico para verificar la adhesión y la morfología celular. Aspirar el sobrenadante y sustituirlo por medio fresco.NOTA: Los CAF son células grandes en forma de huso, que se pueden distinguir fácilmente de la estructura epitelial de las células tumorales 4T1. Mantener las células a 37 °C y 5% de CO2 en atmósfera humidificada, cambiando el medio cada 2 días. Cuando las células alcancen ~ 80% de confluencia (aproximadamente 4-6 días después de la siembra), separe las celdas usando la solución TrypLE Select (consulte la Tabla de materiales)durante 5 minutos a temperatura ambiente. Añadir medio fresco (4:1), centrifugar la suspensión celular a 400 × g durante 5 min, y volver a colocar el pellet en medio fresco. Divida las células 1:2 y amplíe el cultivo hasta obtener el número de células necesarias para el experimento. En cada pasaje, verifique la morfología y el crecimiento celular bajo un microscopio óptico. Si la morfología celular no es homogénea (por ejemplo, clones de pequeñas células de forma redonda que aparecen en cultivo), analice una muestra de células mediante citometría de flujo como se describe en la sección 4.1. Si es homogéneo, continúe con el paso 4.2.7.NOTA: Los cambios en la morfología celular pueden indicar contaminación por fibroblastos no asociados al cáncer, que deben eliminarse para garantizar la pureza del cultivo. Analice los resultados de la citometría de flujo y proceda de acuerdo con uno de los siguientes escenarios: (i) si se produce contaminación de las células CD90.2 – / CD45-, recoja todas las células y repita la selección positiva siguiendo el paso 3.2; ii) si también se produce contaminación de células CD45+, recoger todas las células y repetir el agotamiento en la etapa 3.1; iii) si no se produce contaminación (sólo están presentes células CD90.2+/CD45-), mantenga las células en cultivo y proceda directamente a 4.2.7.NOTA: Como repetir el proceso de agotamiento con microperlas reducirá la recuperación celular, se recomienda solo cuando las células no necesitan usarse de inmediato. Cuente las células con azul tripano (1:1), coloque 5 × 105 células en dos tubos FACS y centrífuga durante 10 min a 300 × g. Deseche el sobrenadante y vuelva a colocar el pellet en 0,5 ml de tampón de bloqueo (PBS suplementado con BSA al 2%, suero de cabra al 2%) durante 15 min a temperatura ambiente.NOTA: Un tubo actúa como un control que consiste solo en células no teñidas, mientras que las células en el segundo tubo se teñirán para el análisis de citometría de flujo. Centrifugar durante 10 min a 300 × g, desechar el sobrenadante y resuspend en 99 μL de tampón de bloqueo. Agregue 1 μg de anticuerpo anti-FAP al tubo de muestra y 1 ml de tampón de bloqueo al tubo de control. Mezclar bien e incubar durante 15 min a temperatura ambiente.NOTA: FAP es un marcador de superficie del estroma tumoral reactivo y se puede utilizar para identificar y caracterizar LOS CAF. Lavar tres veces con PBS, centrifugar e incubar con el anticuerpo secundario apropiado conjugado con un colorante fluorescente (1 μg) en tampón de bloqueo durante 15 min a temperatura ambiente. Lavar tres veces con PBS, y analizar por citometría de flujo (siga los pasos 4.1.5 a 4.1.7 estableciendo el canal apropiado para detectar el fluoróforo utilizado). A continuación, utilice las celdas para experimentos (paso 5.2). (OPCIONAL) Congelar una muestra de células en 1 ml de 90% de FBS y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO); conservar a -80 °C para su uso posterior. 5. Focalización de CAFs por nanopartículas de ferritina diseñadas NOTA: Una variante recombinante de la cadena pesada de ferritina humana (HFn) se utilizó como nanopartícula desnuda o se conjudicó con las partes objetivo. Aquí, las nanopartículas de HFn funcionalizadas con la porción variable de un anticuerpo anti-FAP (Fab@FAP) fueron preparadas por el NanoBioLab de la Universidad de Milano-Bicocca en dos proporciones molares HFn: Fab@FAP, 1: 1 y 1: 5, de acuerdo con un protocolo previamente descrito32. Etiquetado fluorescente de nanopartículas de HFnNOTA: Tanto las nanociágenas HFn desnudas como las funcionalizadas están etiquetadas fluorescentemente con FITC. Disolver el polvo FITC en etanol al 99% para obtener una concentración de 2 mg/mL.NOTA: Esta solución debe prepararse recién preparada. Incubar 50 μL de la solución preparada (200 μg de FITC) por cada 1 mg de proteína (es decir, 100 μL de HFn a 10 mg/ml). Añadir 50 μL de bicarbonato de sodio 1 M (NaHCO3), y ajustar el volumen a 500 μL con 0,1 M NaHCO3.NOTA: Amplíe los volúmenes de acuerdo con las necesidades experimentales. Incubar la mezcla de reacción a temperatura ambiente, en la oscuridad y con agitación continua durante 1 h. Eliminar el exceso de FITC del conjugado mediante filtración en gel mediante una columna desarenado de espín (7 kDa MWCO). Evaluar la concentración de la proteína etiquetada recuperada mediante el uso de un espectrofotómetro. Estimar las cantidades de proteína y colorante midiendo la absorbancia a 280 nm y a 488 nm, respectivamente. Unión de nanopartículas de HFn a CAFNOTA: Use CAF de no más tarde de los pasajes 4–5 en cultivo. Coloque 5 × 105 células en cada tubo FACS, centrífuga durante 10 min a 300 × g, y resuspenda en 0.5 mL de PBS, 0.3% BSA suplementada con 0.1 mg / mL de las diferentes preparaciones de nanopartículas (HFn desnudo, HFn-Fab@FAP 1: 1, HFn-Fab@FAP 1: 5) previamente etiquetadas con FITC.NOTA: Ejecute cada condición por triplicado. Prepare un tubo adicional como una muestra de control sin etiquetar a la que no se agreguen nanopartículas. Incubar durante 2 h a 4 °C en la oscuridad, centrifugar y lavar tres veces en PBS. Resuspend células con 0.5 mL PBS, mezcla bien y analiza por citometría de flujo. Ajuste los canales para medir la fluorescencia de FITC. Después de la activación en celdas individuales vivas, adquiera 20,000 eventos. Utilice el tubo de control no etiquetado para establecer la puerta de positividad fitc y obtener el porcentaje de eventos FITC+ (correspondiente a la unión de nanopartículas). 6. Análisis estadístico y réplicas experimentales Animales Realizar tres experimentos independientes de crecimiento tumoral y aislamiento de CAF, utilizando 8 animales por experimento individual, como se describe en 1.1.5. Para optimizar el rendimiento de aislamiento de los CAF, divida los tejidos extirpados en subgrupos (n=4) y procesarlos, siguiendo los pasos descritos en la sección 2. Interacción HFn con las células Evaluar la interacción de HFn funcionalizada y no funcionalizada con células diana y no diana (CAF y 4T1, respectivamente) en términos del porcentaje de células teñidas positivamente por nanocijas etiquetadas fluorescentemente. Informe los resultados como desviación estándar promedio ± de tres experimentos independientes. Análisis estadístico Para calcular la significación estadística en experimentos de unión celular con HFn y HFn-FAP, utilice la prueba ANOVA unidireccional ordinaria.