Выделение первичных связанных с раком фибробластов из сингенной мышиной модели рака молочной железы для изучения целевых наночастиц

1. Создание сингенной модели рака молочной железы 4T1 ПРИМЕЧАНИЕ: Настоящий протокол описывает выделение первичных КАФ из опухоли молочной железы мыши 4T1. Исследование на животных, описанное здесь, было одобрено Министерством здравоохранения Италии (aut. number 110/2018-PR). Культивирование опухолевых клеток и имплантация Оттаивание 1 ×10 6 клеток 4T1-luc в колбе T75 с 10 мл среды Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640, дополненной 10% фетальной бычий сывороткой (FBS), 1% пенициллином / стрептомицином (P / S) и 1% L-глутамином. Добавьте средство для удаления микоплазмы (1:100) в культуральная среда.ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки 4T1-luc стабильно экспрессированы люциферазой и могут быть визуализированы биолюминесценцией (BLI) при правильной стимуляции D-люциферином. Это позволяет in vivo контролировать жизнеспособность и пролиферацию опухолевых клеток при имплантации мышам(рисунок 1). Поддерживают клетки при 37 °C и 5% CO2 в увлажненной атмосфере до ~80% слияния, меняя среду каждые 2 дня.ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте лечение агентом для удаления микоплазмы в течение 1 недели (~ 2/3 прохода) перед инъекцией мышам, чтобы убедиться, что введенные клетки не имеют микоплазмы. В день процедуры отсоединяют клетки с помощью 1 мл раствора трипсин-этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) (трипсин 1:250) в течение 5 мин при 37 °C. Остановите активность трипсина, добавив культурную среду, подсчитайте клетки с трипан-синим (1:1) и рассчитайте количество клеток/мл. Пипетка объемом, соответствующим 1 × 106 ячеек и центрифуга в течение 5 мин при 400 × г. Вылейте супернатант и повторно суспендьте гранулу в 1 мл базовой среды RPMI 1640. Держите клетки на льду до готовности к инъекции.ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой мыши необходимо 1 ×10 5 ячеек; однако всегда рассчитывайте для избытка 2 мышей (что соответствует 2 × 105 клеткам), чтобы облегчить нагрузку на шприц. За день до операции побрить мех 8 мышей BALB/c (самок, семинедельного ребенка), чтобы обнажить область брюшных молочных желез с правой стороны. Используйте электробритву и нанесите тонкий слой крема для депиляции на 4 мин; затем смойте крем водой и листом бумаги. Индуцируют анестезию путем непрерывного вдыхания 2% газа изофлурана в течение ~5 мин и выполняют подкожную инъекцию в область брюшных молочных желез с помощью туберкулинового шприца 27 Г. Поверните иглу вверх, чтобы попасть в кожу подкожно; затем удерживайте кожу вверх и медленно вводите 100 мкл клеточной суспензии (1 × 105 клеток). Слегка поверните иглу, прежде чем медленно втянуть шприц.ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте довести клеточную суспензию до комнатной температуры за 15 минут до инъекции. Рост опухоли и рассечение Через 5 дней после клеточной инъекции вводят 150 мг/кг D-люциферина внутрибрюшинно (100 мкл) за 5 мин до визуализации. Делайте снимки BLI с помощью системы визуализации in vivo, устанавливая экспозицию 10 с, среднюю биннинг и f/stop на 4. Определите люминесцентную область опухоли как область интереса (ROI) и количественно оцените общий сигнал в ROI (фотон / сек /м 2)с помощью программного обеспечения для визуализации. Повторяют процедуру визуализации (1.2.1) каждые 5 дней после инъекции, чтобы контролировать рост опухоли с точки зрения увеличения ЛЛИ. Чтобы установить объем опухоли, держите мышь и обнажайте ее живот. Используйте суппорты для измерения длины и ширины опухоли (L) и ширины (W) один раз в неделю. Рассчитайте объем опухоли (V) с помощью уравнения 1.[V = (Дх Ш 2)/2]     (1) Через 20 дней после инъекции клетки приносят животных в жертву путем вывиха шейки матки, отделяют опухоли от кожи ножницами и собирают их в раствор для хранения тканей (см. Таблицу материалов).ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы опухоли могут быть использованы немедленно для диссоциации в отдельные клетки (раздел 2) или храниться при 4 °C в течение 48 ч. 2. Диссоциация опухоли на отдельные клетки ПРИМЕЧАНИЕ: Для следующих шагов используйте стерильные реагенты и одноразовые материалы в ламинарной вытяжке. Работа с 4 опухолями одновременно. Поместите образец опухоли в чашку Петри и аккуратно удалите любой фрагмент кожи, жира и некротических участков с помощью пинцетом и скальпеля. Затем уменьшают опухоль на мелкие кусочки примерно 1–2 мм и переносят их в трубку(рисунок 2А).ПРИМЕЧАНИЕ: Опухоли 4T1 становятся высоко некротическими во время роста, с тенденцией к изъязвлению. Важно тщательно удалить некротические участки, чтобы избежать каких-либо помех мусора на следующих этапах. Приготовьте смесь для пищеварения для диссоциации опухоли: смешайте 2,35 мл среды RPMI 1640, 100 мкл фермента D, 50 мкл фермента R и 12,5 мкл фермента А. Замочите фрагменты опухоли в растворе и плотно закройте трубку.ПРИМЕЧАНИЕ: Указанные объемы смеси пищеварения действительны для опухолей до 1 г и могут быть скорректированы для более крупных опухолей в соответствии с их весом. Опухоли 4T1, выращенные в течение 20 дней, обычно находятся в диапазоне 0,5–0,8 г. Переверните трубку вверх дном, проверив, чтобы все кусочки опухоли стояли в нижней части трубки по направлению к колпачку. Прикрепите трубку к механическому диссоциатору в соответствующем корпусе, и запустите специальную программу диссоциации, предназначенную для тяжелых опухолей (см. инструкцию производителя).ПРИМЕЧАНИЕ: Для вхождение в диссоциатор могут потребоваться специальные трубки. С-трубки несут ротор внутри колпачка, чтобы способствовать механической диссоциации ткани. Отсоедьте пробирку, поддерживайте ее вверх дном и инкубирует образец при 37 °C в течение 40 мин с легким встряхиванием. Затем прикрепите трубку к диссоциатору в соответствующем корпусе и дважды запустите следующую специфическую программу диссоциации, предназначенную для тяжелых опухолей. Убедитесь, что в конце процедуры нет больших кусочков ткани(рисунок 2B).ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы диссоциировать опухоль, другие ферментные коктейли могут быть использованы для деградации внеклеточного матрикса. Однако в этом протоколе использовался коммерчески доступный набор для диссоциации опухоли, содержащий оптимизированную смесь ферментов (ферменты D, R, A) и полуавтоматизированный диссоциатор, который механически диссоциирует ткань. Эта комбинация обеспечила надлежащую деградацию внеклеточного матрикса вместе с поддержанием целостности клеток и эпитопов клеточной поверхности. Отфильтруйте образец через клеточный сетчатый фильтр 40 мкм в пробирке 50 мл, промывайте фильтр 10 мл среды RPMI 1640 и центрифугировать трубку в течение 7 мин при 300 × г. Если клеточная гранула кажется красной, лизуют эритроциты, добавляя 1 мл буфера лизирования аммония-хлорида-калия (ACK) в течение 5 мин при комнатной температуре, промывают 10 мл RPMI 1640, переносят клеточную суспензию в 15 мл пробирки и снова центрифугируют. Повторно суспендировать гранулу в 1 мл буфера ПБЭ, состоящего из фосфат-буферного физиологического раствора (PBS), 0,5% бычих сывороточных альбуминов (BSA) и 2 мМ ЭДТА, и подсчитать клетки с трипан-синим (1:1). В случае клеточных сгустков фильтруйте клеточную суспензию через 70-мкм клеточный сетчатый фильтр, предварительно пропитанный PBS.ПРИМЕЧАНИЕ: Особенно когда опухоли большие, важно проверить количество клеток и в конечном итоге разделить каждый образец опухоли в разных пробирках с не более чем 107 клетками в каждой трубке, прежде чем перейти к шагу 2.7. Подготовьте буфер связывания для удаления мертвых клеток, разбавляя 20-кратный связывающий буферный раствор (см. Таблицу материалов)стерильной двухдистиллированной водой. Промывайте ячейки 5 мл 1× связывающим буфером(рисунок 2C).ПРИМЕЧАНИЕ: Держите буфер при 4 °C. Центрифугу в течение 7 мин при 300 × г и повторно суспендировать ячейку гранулы с 0,1 мл микрограсин для удаления мертвых клеток (см. Таблицу материалов). Хорошо перемешать и инкубировать при комнатной температуре в течение 15 мин. Во время инкубации с шариками подготовьте магнитную подставку под капотом и повесьте на нее ферромагнитные разделительные колонны (одна колонна на10-7 ячеек) с наконечниками, направленными вниз. Уравновешивают колонны 0,5 мл холодного 1× буфера связывания. Подождите, пока раствор не протечет под действием силы тяжести.ПРИМЕЧАНИЕ: Важно не превышать количество ячеек на столбец, чтобы избежать любого риска свертывания слоя колонны и снижения выхода на восстановление. При работе с более чем 107 ячейками либо используйте больше столбцов в соответствии с общим количеством ячеек, либо используйте столбцы большего размера. В таких случаях отрегулируйте объемы реагентов, описанные в следующих шагах, на те, которые указаны производителем. В конце инкубации добавьте 400 мкл холодного 1× связующего буфера в суспензию шарика/ячейки, загрузите весь объем на колонну и соберите стоки (соответствующие немаркированных ячейках) в трубку объемом 15 мл. Промыть колонну четыре раза 0,5 мл холодного 1× связующего буфера и собрать общий объем сточных вод (соответствующий фракции живых клеток) в той же трубке. Подсчитайте ячейки трипан-синим цветом (1:1). Поместите 1 × 105 ячеек в две трубки для флуоресцентной активированной сортировки клеток (FACS) и держите их при 4 °C до валидации процесса (см. шаг 4.1): используйте первую трубку для установки параметров анализа и областей положительности (контрольная трубка), а другую для анализа биомаркеров (пробка). Используйте оставшиеся ячейки для извлечения CAF (см. раздел 3).ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление мертвых клеток важно для уменьшения неспецифических реакций с микрошаровами в разделе 3. Однако, чтобы улучшить выход, избегайте удаления мертвых клеток, если доля мертвых клеток составляет <20%. 3. Извлечение первичных КАФ из опухоли молочной железы ПРИМЕЧАНИЕ: Для раздела 3 используйте набор для изоляции фибробластов, ассоциированный с опухолью, содержащий коктейль для истощения фибробластов, не связанный с опухолью, и микрогранулы, ассоциированные с опухолью, подходящие для магнитной маркировки клеток (см. Таблицу материалов). Истощение не связанных с раком фибробластов Смочите 70-мкм клеточный ситечко PBS и отфильтруйте клеточную суспензию, чтобы удалить любые сгустки. Затем центрифугируют клетки в течение 10 мин при 300 × г и аспирируют супернатант.ПРИМЕЧАНИЕ: Если одна опухоль была разделена на два образца для этапа 2.7, объедините клеточную суспензию два на два, прежде чем переходить к этапу 3.1.2. Повторно суспендировать гранулу в 80 мкл холодного буфера ПБЭ и добавить 20 мкл коктейля истощения фибробластов, не связанных с опухолью. Хорошо перемешать и инкубировать при 4 °C в течение 15 мин в темноте. Во время инкубации с шариками подготовьте ферромагнитные обедненческие колонны (1 на образец) на магнитной подставке и уравновешивайте колонны 2 мл холодного буфера ПБЭ. Подождите, пока раствор не протечет. В конце инкубации добавьте 400 мкл холодного буфера ПБЭ в суспензию шарика/ячейки, загрузите весь объем на колонну и соберите сточные воды (соответствующие немаркированных ячейкам) в трубку объемом 15 мл. Дважды промыть колонну 2 мл холодного буфера ПБЭ и собрать общий объем сточных вод в одну и ту же трубу. Центрифуга в течение 10 мин при 300 × г и повторное суспендировать в 0,1 мл холодного буфера ПБЭ.ПРИМЕЧАНИЕ: Истощение не связанных с раком фибробластов резко снижает общее количество восстановленных клеток. Как правило, необходимо и рекомендуется объединять клеточные суспензии из четырех различных образцов для получения видимой гранулы и достаточного количества клеток для этапа 3.2. Это обеспечит оптимальную урожайность. Поместите 20 мкл клеточной суспензии в трубку FACS и держите ее при 4 °C для проверки процесса (см. раздел 4). Используйте оставшиеся ячейки для выбора CAF (см. шаг 3.2). Положительный отбор связанных с раком фибробластов Добавьте 20 мкл опухолеациоциированных фибробластных микрограбластов к 80 мкл клеточной суспензии. Хорошо перемешать и инкубировать при 4 °C в течение 15 мин в темноте. Во время инкубации с шариками подготовьте ферромагнитные разделительные колонны (1 на образец) на магнитной подставке и уравновесьте колонны 0,5 мл холодного буфера ПБЭ. Подождите, пока раствор не протечет. В конце инкубации добавьте 400 мкл холодного буфера PBE в суспензию шарика/ячейки, загрузите весь объем на колонку и позвольте немаркированным клеткам пройти в трубку объемом 15 мл. Промыть колонну три раза 0,5 мл холодного буфера ПБЭ и собрать общий объем сточных вод в той же трубе.ПРИМЕЧАНИЕ: Проточный содержит немаркированные CD90.2-отрицательные клетки, которые могут быть отброшены как не связанные с раком фибробласты. Снимите столбец с магнита и поместите его в трубку 1,5 мл. Добавьте 1 мл холодного ПБЭ на столбец и немедленно втолкните плунжер в колонну, чтобы промыть ячейки. Центрифуга в течение 10 мин при 400 × г и повторное суспендировать в 0,1 мл холодного буфера ПБЭ. Поместите 20 мкл клеточной суспензии в пробирку FACS и держите ее при 4 °C для проверки процесса (см. раздел 4).ПРИМЕЧАНИЕ: После центрифугирования гранула может быть едва заметна, особенно когда исходные опухоли небольшие. Используйте конические донные центрифужные трубки и будьте осторожны, чтобы не потерять никаких клеток при наддувке супернатанта. Разбавьте оставшиеся клетки в соответствующем объеме модифицированной среды Dulbecco Eagle’s Medium (DMEM)/Ham’s F-12, дополненной 15% FBS, 2 мМ L-глутамина, 1% P/S и 1% носменимыми аминокислотами, и посейте клетки в тканевую культурную пластину. Проверьте плотность клеток под микроскопом и поместите пластину в инкубатор при 37 ° C и 5% CO2, чтобы клетки прилипли и росли.ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки слишком плотные, немедленно разделите клеточную суспензию на два колодца тканевой культуры пластины перед размещением пластины в инкубаторе. 4. Проверка процесса Проточная цитометрияПРИМЕЧАНИЕ: Раздел 4.1 не требует стерильных условий и может выполняться вне ламинарной вытяжки. Параллельно выполнять раздел 4.1 для образцов, собранных на этапе 2.11 (диссоциированная опухоль), этапе 3.1.6 (после истощения фибробластов, не связанных с раком) и этапе 3.2.6 (после обогащения фибробластов, связанных с раком). Центрифуги из трубОК FACS готовят на этапах 2.11, 3.1.6 и 3.2.6 в течение 10 мин при 300 × г. Выбросьте супернатант.ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте по меньшей мере одну дополнительную трубку, которая содержит неиспорченные ячейки, выступающие в качестве элемента управления для установки параметров для анализа. В пробах повторно суспендируют клетки в 88 мкл ПБЭ и добавляют 2 мкл антитела против CD45, конъюгированного с флуоресцеином изотиоцианатом (FITC, разведение 1:50, согласно инструкциям производителя) и 10 мкл анти-CD90.2 антител, конъюгированных с фикоэритрином (ПЭ, разведение 1:10, согласно инструкциям производителя). Тщательно перемешать и инкубировать в течение 10 мин при 4 °C в темноте. В контрольной трубке (неокраженной) повторно суспендировали клетки в 100 мкл ПБЭ. Инкубировать в течение 10 мин при 4 °C в темноте, чтобы воспроизвести процедуру, выполненную для клеток, окрашенных антителами.ПРИМЕЧАНИЕ: Температура и время инкубации должны быть тщательно проверены, так как изменение таких переменных может привести к плохому или неспецифическому окрашиванию, что приведет к изменению результатов. После завершения этапа инкубации выполните промывку, добавив 1 мл ПБЭ. Центрифуга в течение 10 мин при 300 х г. Выбросьте супернатант. Повторное суспендированных клеток (все пробирки) в 500 мкл PBS. Хорошо перемешайте и приступайте к анализу проточной цитометрии. Установите каналы для измерения флуоресценции антител (т.е. FITC и PE). Из контрольной трубки выберите все жизнеспособные ячейки, нарисовав первый затвор (P1) на графике рассеяния вперед и стороны (FSC против SSC). В пределах P1 установите второй затвор (P2), состоящий только из одиночных ячеек. Используя специфические флуоресцентные каналы антител (т.е. FITC и PE), установите надлежащие ворота для распознавания положительно окрашенных клеток. Начните анализ и запишите не менее 10 000 событий в P2. Считывание сигналов с обоих каналов одновременно.ПРИМЕЧАНИЕ: Если общее количество ячеек меньше, чем ожидалось, может быть предпочтительнее считывать всю трубку. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Если запрограммировано дальнейшее окрашивание дополнительными антителами/флуорофорами, перед началом анализа установите соответствующую компенсационную матрицу. Мониторинг морфологии и характеристик клетокПРИМЕЧАНИЕ: После посева клетки должны обрабатываться в стерильных условиях. На следующий день после посева визуализируйте клетки под оптическим микроскопом, чтобы проверить адгезию и морфологию клеток. Аспирировать супернатант и заменить свежим носителем.ПРИМЕЧАНИЕ: CAF представляют собой крупные веретенообразные клетки, которые можно легко отличить от эпителиально-подобной структуры опухолевых клеток 4T1. Поддерживают клетки при 37 °C и 5% CO2 в увлажненной атмосфере, меняя среду каждые 2 дня. Когда клетки достигнут ~80% слияния (примерно через 4-6 дней после посева), отсоедините клетки с помощью раствора TrypLE Select (см. Таблицу материалов)на 5 мин при комнатной температуре. Добавить свежую среду (4:1), центрифугировать клеточную суспензию по 400 × г в течение 5 мин и повторно суспендировать гранулу в свежей среде. Разделите клетки 1:2 и расширяйте культуру до тех пор, пока не будет получено необходимое для эксперимента количество клеток. При каждом прохождении проверяйте морфологию и рост клеток под оптическим микроскопом. Если морфология клеток не однородна (например, клоны небольших клеток круглой формы, появляющиеся в культуре), проанализируйте образец клеток с помощью проточной цитометрии, как описано в разделе 4.1. Если однородный, перейдите к этапу 4.2.7.ПРИМЕЧАНИЕ: Изменения в морфологии клеток могут указывать на загрязнение фибробластами, не связанными с раком, которые необходимо удалить для обеспечения чистоты культуры. Проанализировать результаты проточной цитометрии и действовать в соответствии с одним из следующих сценариев: (i) если происходит загрязнение CD90.2-/CD45-клеток, соберите все клетки и повторите положительный отбор, выполнив следующий шаг 3.2; (ii) если загрязнение клеток CD45+ также происходит, соберите все клетки и повторите истощение на этапе 3.1; iii) если загрязнения не происходит (присутствуют только CD90.2+/CD45- клетки), держите клетки в культуре и переходите непосредственно к 4.2.7.ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку повторение процесса истощения с помощью микрошаров уменьшит восстановление клеток, рекомендуется только тогда, когда клетки не нужно использовать немедленно. Подсчитайте ячейки с трипаном синего цвета (1:1), поместите 5 ×10 5 клеток в две трубки FACS и центрифугу в течение 10 мин при 300 × г. Выбросьте супернатант и повторно суспендируют гранулу в 0,5 мл блокирующего буфера (PBS, дополненный 2% BSA, 2% козьей сывороткой) в течение 15 мин при комнатной температуре.ПРИМЕЧАНИЕ: Одна трубка действует как контроль, состоящий только из неокрашивания клеток, в то время как клетки во второй трубке будут окрашены для анализа проточной цитометрии. Центрифугу в течение 10 мин при 300 × г, отбрасывают супернатант и повторно суспендируют в 99 мкл блокирующего буфера. Добавьте 1 мкг антифап-антитела в пробирку для образцов и 1 мл блокирующего буфера в контрольную пробирку. Тщательно перемешать и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.ПРИМЕЧАНИЕ: FAP является поверхностным маркером реактивной стромы опухоли и может быть использован для идентификации и характеристики CAF. Трижды промыть PBS, центрифугой и инкубировать соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с флуоресцентным красителем (1 мкг) в блокирующем буфере в течение 15 мин при комнатной температуре. Трижды промыть PBS и проанализировать с помощью проточной цитометрии (выполните шаги с 4.1.5 по 4.1.7, установив соответствующий канал для обнаружения используемого флуорофора). Затем используйте клетки для экспериментов (шаг 5.2). (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Заморозить образец клеток в 1 мл 90% FBS и 10% диметилсульфоксида (DMSO); хранить при -80 °C для дальнейшего использования. 5. Нацеливание на КАФ с помощью разработанных наночастиц ферритина ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомбинантный вариант тяжелой цепи ферритина человека (HFn) использовался в качестве голой наночастицы или был сопряжен с целевыми частями. Здесь наночастицы HFn, функционализированные переменной частью антифап-антитела (Fab@FAP), были получены NanoBioLab в Университете Милано-Бикокка при двух молярных соотношениях HFn:Fab@FAP, 1:1 и 1:5, в соответствии с ранее описанным протоколом32. Флуоресцентная маркировка наночастиц HFnПРИМЕЧАНИЕ: Как голые, так и функционализированные наносчажки HFn флуоресцентно маркируются FITC. Растворите порошок FITC в 99% этаноле до получения концентрации 2 мг/мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор должен быть приготовлен свежим. Инкубировать 50 мкл приготовленного раствора (200 мкг FITC) на каждый 1 мг белка (т.е. 100 мкл HFn при 10 мг/мл). Добавьте 50 мкл 1 М бикарбоната натрия (NaHCO3)и отрегулируйте объем до 500 мкл с 0,1 М NaHCO3.ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение объемов в соответствии с экспериментальными потребностями. Инкубировать реакционную смесь при комнатной температуре, в темноте и при непрерывном перемешивание в течение 1 ч. Удалите избыток FITC из конъюгата путем гелевой фильтрации с помощью колонки расщеливания спина (7 кДа MWCO). Оцените концентрацию восстановленного меченого белка с помощью спектрофотометра. Оцените количество белка и красителя, измерив абсорбсию при 280 нм и при 488 нм соответственно. Связывание наночастиц HFn с ЦАФПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ВКК не позднее отрывков 4–5 в культуре. Поместите 5 × 105 клеток в каждую трубку FACS, центрифугу в течение 10 мин при 300 × г и повторное суспендировать в 0,5 мл PBS, 0,3% BSA, дополненное 0,1 мг/мл различных препаратов наночастиц (голый HFn, HFn-Fab@FAP 1:1, HFn-Fab@FAP 1:5), предварительно помеченных FITC.ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните каждое условие в трех номерах. Подготовьте дополнительную трубку в качестве контрольного немаркированного образца, в который не добавляют наночастицы. Инкубировать в течение 2 ч при 4 °C в темноте, центрифугу и трижды промыть в PBS. Повторное суспендирование клеток с 0,5 мл PBS, хорошо перемешивают и анализируют с помощью проточной цитометрии. Установите каналы для измерения флуоресценции FITC. После наживки на живые одиночные клетки приобретите 20 000 событий. Используйте контрольную немаркированную трубку для установки затвора позитивности FITC и получения процента событийFITC+ (соответствующего связыванию наночастиц). 6. Статистический анализ и экспериментальные реплики Животные Выполните три независимых эксперимента по росту опухоли и выделению CAF, используя 8 животных в одном эксперименте, как описано в 1.1.5. Чтобы оптимизировать выход выделения CAF, разделите иссеченные ткани на подгруппы (n = 4) и обработайте их, следуя шагам, описанным в разделе 2. Взаимодействие HFn с клетками Оценить взаимодействие функционализированного и нефункционализированного HFn с клетками-мишенями и нецелевые клетками (CAF и 4T1 соответственно) с точки зрения процента положительно окрашенных клеток флуоресцентно мечеными нанокажами. Сообщайте о результатах как о среднем ± стандартном отклонении трех независимых экспериментов. Статистический анализ Чтобы рассчитать статистическую значимость в экспериментах по связыванию клеток с HFn и HFn-FAP, используйте обычный односторонний тест ANOVA.