Isolement de fibroblastes primaires associés au cancer à partir d’un modèle murin syngénique du cancer du sein pour l’étude de nanoparticules ciblées

1. Établissement d’un modèle syngénique 4T1 du cancer du sein REMARQUE: Le présent protocole décrit l’isolement des CAF primaires d’une tumeur mammaire 4T1 chez la souris. L’étude animale décrite ici a été approuvée par le ministère italien de la Santé (numéro d’autorité 110/2018-PR). Culture et implantation de cellules tumorales Décongeler 1 ×10 6 cellules de 4T1-luc dans une fiole T75 avec 10 mL de milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS), 1% de pénicilline / streptomycine (P / S) et 1% de L-glutamine. Ajouter l’agent d’élimination des mycoplasmes (1:100) dans le milieu de culture.REMARQUE: Les cellules 4T1-luc expriment de manière stable la luciférase et peuvent être visualisées par bioluminescence (BLI) lors d’une stimulation appropriée avec de la D-luciférine. Cela permet une surveillance in vivo de la viabilité et de la prolifération des cellules tumorales lors de l’implantation chez la souris (Figure 1). Maintenir les cellules à 37 °C et 5 % deCO2 dans une atmosphère humidifiée jusqu’à ~80 % de confluence, en changeant le milieu tous les 2 jours.REMARQUE: Continuer le traitement avec un agent d’élimination des mycoplasmes pendant 1 semaine (~ 2/3 passages) avant l’injection chez la souris pour s’assurer que les cellules injectées sont exemptes de mycoplasmes. Le jour de l’intervention, détacher les cellules à l’aide de 1 mL de solution d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (trypsine 1:250) pendant 5 min à 37 °C. Arrêtez l’activité de la trypsine en ajoutant un milieu de culture, comptez les cellules avec du bleu de trypan (1:1) et calculez le nombre de cellules/mL. Pipette le volume correspondant à 1 × 106 cellules et centrifuger pendant 5 min à 400 × g. Versez le surnageant et resuspendez la pastille dans 1 mL de milieu de base RPMI 1640. Gardez les cellules sur la glace jusqu’à ce qu’elles entraitent prêtes pour l’injection.REMARQUE: Pour chaque souris, 1 × 105 cellules sont nécessaires; cependant, calculez toujours pour un excès de 2 souris (correspondant à 2 × 105 cellules) pour faciliter le chargement de la seringue. Un jour avant l’opération, rasez la fourrure de 8 souris BALB/c (femelle, âgées de sept semaines) pour exposer la zone des glandes mammaires abdominales du côté droit. Utilisez un rasoir électrique et appliquez une fine couche de crème dépilatoire pendant 4 min; ensuite, lavez la crème avec de l’eau et un morceau de papier. Induire l’anesthésie par inhalation continue de gaz isoflurane à 2% pendant environ 5 min, et effectuer une injection sous-cutanée dans la région des glandes mammaires abdominales avec une seringue à tuberculine de 27 G. Tournez l’aiguille vers le haut pour pénétrer dans la peau par voie sous-cutanée; ensuite, maintenez la peau vers le haut et injectez lentement 100 μL de suspension cellulaire (1 × 105 cellules). Tournez légèrement l’aiguille avant de rétracter lentement la seringue.REMARQUE: N’oubliez pas de porter la suspension cellulaire à température ambiante 15 minutes avant l’injection. Croissance tumorale et dissection 5 jours après l’injection cellulaire, injecter 150 mg/kg de D-lucifératonéalement (100 μL) 5 min avant l’imagerie. Capturez des images BLI à l’aide d’un système d’imagerie in vivo réglant une exposition de 10 s, un binning moyen et un f/stop à 4. Définissez la zone luminescente de la tumeur comme la région d’intérêt (ROI) et quantifiez le signal total dans le ROI (photon/ sec / m2)à l’aide d’un logiciel d’imagerie. Répétez la procédure d’imagerie (1.2.1) tous les 5 jours à partir de l’injection pour surveiller la croissance tumorale en termes d’augmentation du BLI. Pour établir le volume de la tumeur, tenez la souris et exposez son ventre. Utilisez des étriers pour mesurer la longueur (L) et la largeur de la tumeur (W) une fois par semaine. Calculer le volume tumoral (V) à l’aide de l’équation 1.[V = (L x L2)/2]     (1) À 20 jours après l’injection de cellules, sacrifier les animaux par luxation cervicale, dissocier les tumeurs de la peau avec des ciseaux et les recueillir dans une solution de stockage de tissus (voir le tableau des matériaux).REMARQUE: Les échantillons tumoraux peuvent être utilisés immédiatement pour la dissociation en cellules individuelles (section 2) ou stockés à 4 °C jusqu’à 48 h. 2. Dissociation tumorale en cellules uniques REMARQUE: Pour les étapes suivantes, utilisez des réactifs stériles et des produits jetables dans une hotte à flux laminaire. Travailler avec 4 tumeurs à la fois. Placez l’échantillon de tumeur dans une boîte de Pétri et retirez soigneusement tout fragment de peau, de graisse et de zones nécrotiques à l’aide d’une pince à épiler et d’un scalpel. Ensuite, réduisez la tumeur en petits morceaux d’environ 1 à 2 mm et transférez-les dans un tube(Figure 2A).REMARQUE: Les tumeurs 4T1 deviennent très nécrotiques en croissance, avec une tendance à l’ulcération. Il est important d’enlever soigneusement les zones nécrotiques pour éviter toute interférence de débris avec les étapes suivantes. Préparer un mélange de digestion pour la dissociation tumorale: mélanger 2,35 mL de milieu RPMI 1640, 100 μL d’enzyme D, 50 μL d’enzyme R et 12,5 μL d’enzyme A. Faire tremper les fragments de tumeur dans la solution et fermer fermement le tube.REMARQUE: Les volumes indiqués de mélange de digestion sont valables pour les tumeurs jusqu’à 1 g et peuvent être ajustés pour les tumeurs plus grandes en fonction de leur poids. Les tumeurs 4T1 cultivées pendant 20 jours normalement sont dans une plage de 0,5 à 0,8 g. Tournez le tube à l’envers, en vérifiant que tous les morceaux de tumeur se trouvent dans le bas du tube vers le capuchon. Fixez le tube à un dissociateur mécanique dans le boîtier approprié et exécutez un programme de dissociation spécifique conçu pour les tumeurs dures (voir les instructions du fabricant).REMARQUE: Des tubes spéciaux peuvent être nécessaires pour s’insérer dans le dissociateur. Les tubes en C portent un rotor à l’intérieur du capuchon pour favoriser la dissociation mécanique du tissu. Détachez le tube, maintenez-le à l’envers et incubez l’échantillon à 37 °C pendant 40 min en le secouant doucement. Ensuite, fixez le tube au dissociateur dans le boîtier approprié et exécutez deux fois le programme de dissociation spécifique suivant conçu pour les tumeurs dures. Assurez-vous qu’il n’y a pas de gros morceaux de tissu à la fin de la procédure (Figure 2B).REMARQUE: Pour dissocier la tumeur, d’autres cocktails enzymatiques pourraient être utilisés pour dégrader la matrice extracellulaire. Cependant, dans ce protocole, un kit de dissociation tumorale disponible dans le commerce contenant un mélange d’enzymes optimisé (enzymes D, R, A) et un dissociateur semi-automatisé qui dissocie mécaniquement le tissu ont été utilisés. Cette combinaison a assuré une dégradation appropriée de la matrice extracellulaire ainsi que le maintien de l’intégrité cellulaire et des épitopes de surface cellulaire. Filtrer l’échantillon à travers une passoire cellulaire de 40 μm dans un tube de 50 mL, laver le filtre avec 10 mL de milieu RPMI 1640 et centrifuger le tube pendant 7 min à 300 × g. Si la pastille cellulaire apparaît rouge, lyse érythrocytes en ajoutant 1 mL de tampon de lysage ammonium-chlorure-potassium (ACK) pendant 5 min à température ambiante, laver avec 10 mL de RPMI 1640, transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL et centrifuger à nouveau. Resuspensez la pastille dans 1 mL de tampon PBE composé d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), d’albumine sérique bovine (BSA) à 0,5 % et de 2 mM d’EDTA, et comptez les cellules avec du bleu de trypan (1:1). En cas d’amas cellulaires, filtrer la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 μm, préalablement imbibée de PBS.REMARQUE: Surtout lorsque les tumeurs sont grosses, il est important de vérifier le nombre de cellules et éventuellement de diviser chaque échantillon de tumeur dans différents tubes avec pas plus de 107 cellules dans chaque tube avant de passer à l’étape 2.7. Préparer le tampon de liaison d’élimination des cellules mortes en diluant la solution tampon de liaison 20x (voir le tableau des matériaux)avec de l’eau stérile double distillée. Laver les cellules avec 5 mL de tampon de liaison de 1×(Figure 2C).REMARQUE : Maintenez le tampon à 4 °C. Centrifuger pendant 7 min à 300 × g, et ressuspender la pastille cellulaire avec 0,1 mL de microbilles d’élimination des cellules mortes (voir le Tableau des matériaux). Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 15 min. Pendant l’incubation avec des billes, préparez un support magnétique sous le capot et accrochez des colonnes de séparation ferromagnétique (une colonne pour un nombre de 107 cellules) dessus avec les pointes pointant vers le bas. Équilibrez les colonnes avec 0,5 mL de tampon de liaison froid 1×. Attendez que la solution ait coulé sous la gravité.REMARQUE: Il est important de ne pas dépasser le nombre de cellules par colonne pour éviter tout risque de coagulation du lit de la colonne et de réduire le rendement de récupération. Lorsque vous travaillez avec plus de 107 cellules, utilisez plus de colonnes en fonction du nombre total de cellules ou utilisez des colonnes plus grandes. Dans de tels cas, ajustez les volumes de réactif décrits dans les étapes suivantes à ceux indiqués par le fabricant. À la fin de l’incubation, ajouter 400 μL de tampon de liaison froid de 1× à la suspension perle/cellule, charger tout le volume sur la colonne et recueillir l’effluent (correspondant aux cellules non étiquetées) dans un tube de 15 mL. Lavez la colonne quatre fois avec 0,5 mL de tampon de liaison froid 1× et recueillez l’effluent total (correspondant à la fraction cellulaire vivante) dans le même tube. Comptez les cellules avec le bleu trypan (1:1). Placez 1 × 105 cellules dans deux tubes pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), et maintenez-les à 4 °C jusqu’à la validation du procédé (voir étape 4.1) : utilisez le premier tube pour définir les paramètres d’analyse et les régions de positivité (tube témoin) et l’autre pour l’analyse des biomarqueurs (tube échantillon). Utilisez les cellules restantes pour l’extraction des CAF (voir rubrique 3).REMARQUE: L’élimination des cellules mortes est importante pour réduire les réactions non spécifiques avec les microbilles de la rubrique 3. Cependant, pour améliorer le rendement, évitez l’élimination des cellules mortes si la proportion de cellules mortes est de <20%. 3. Extraction des CAF primaires de la tumeur du sein REMARQUE: Pour la section 3, utilisez le kit d’isolement de fibroblastes associés à la tumeur de souris contenant un cocktail d’épuisement des fibroblastes non associés à la tumeur et des microbilles de fibroblastes associées à la tumeur adaptées au profilage magnétique des cellules (voir la table des matériaux). Épuisement des fibroblastes non associés au cancer Humidifiez une passoire cellulaire de 70 μm avec du PBS et filtrez la suspension cellulaire pour éliminer les amas. Ensuite, centrifugez les cellules pendant 10 min à 300 × g et aspirez le surnageant.REMARQUE: Si une seule tumeur a été divisée en deux échantillons pour l’étape 2.7, remettez en commun la suspension cellulaire deux par deux avant de passer à l’étape 3.1.2. Resuspendez la pastille dans 80 μL de tampon PBE froid et ajoutez 20 μL de cocktail d’épuisement des fibroblastes non associés à la tumeur. Bien mélanger et incuber à 4 °C pendant 15 min dans l’obscurité. Pendant l’incubation avec des billes, préparer des colonnes d’épuisement ferromagnétiques (1 par échantillon) sur un support magnétique et équilibrer les colonnes avec 2 mL de tampon PBE froid. Attendez que la solution soit passée. À la fin de l’incubation, ajouter 400 μL de tampon PBE froid à la suspension perle/cellule, charger tout le volume sur la colonne et recueillir l’effluent (correspondant aux cellules non étiquetées) dans un tube de 15 mL. Lavez la colonne deux fois avec 2 mL de tampon PBE froid et collectez l’effluent total dans le même tube. Centrifuger pendant 10 min à 300 × g et mettre en réserve dans 0,1 mL de tampon PBE froid.REMARQUE: L’épuisement des fibroblastes non associés au cancer réduit considérablement la quantité totale de cellules récupérées. Il est généralement nécessaire et recommandé de regrouper les suspensions cellulaires de quatre échantillons différents pour obtenir une pastille visible et suffisamment de cellules pour l’étape 3.2. Cela garantira un rendement optimal. Placer 20 μL de la suspension cellulaire dans un tube FACS et la maintenir à 4 °C pour la validation du procédé (voir rubrique 4). Utilisez les cellules restantes pour la sélection CAF (voir étape 3.2). Sélection positive des fibroblastes associés au cancer Ajouter 20 μL de microbilles de fibroblastes associées à la tumeur à 80 μL de suspension cellulaire. Bien mélanger et incuber à 4 °C pendant 15 min dans l’obscurité. Pendant l’incubation avec des billes, préparer des colonnes de séparation ferromagnétique (1 par échantillon) sur un support magnétique et équilibrer les colonnes avec 0,5 mL de tampon PBE froid. Attendez que la solution soit passée. À la fin de l’incubation, ajoutez 400 μL de tampon PBE froid à la suspension perle/cellule, chargez tout le volume sur la colonne et laissez les cellules non étiquetées s’écouler dans un tube de 15 mL. Lavez la colonne trois fois avec 0,5 mL de tampon PBE froid et collectez l’effluent total dans le même tube.REMARQUE: Le flux contient des cellules CD90.2 négatives non étiquetées, qui peuvent être jetées comme fibroblastes non associés au cancer. Retirez la colonne de l’aimant et placez-la dans un tube de 1,5 mL. Ajoutez 1 mL de PBE froid sur la colonne et poussez immédiatement le piston dans la colonne pour rincer les cellules. Centrifuger pendant 10 min à 400 × g et mettre en réserve dans 0,1 mL de tampon PBE froid. Placer 20 μL de suspension cellulaire dans un tube FACS et le maintenir à 4 °C pour la validation du procédé (voir rubrique 4).REMARQUE: Après la centrifugation, la pastille peut être à peine visible, surtout lorsque les tumeurs d’origine sont petites. Utilisez des tubes centrifuges à fond conique et veillez à ne pas perdre de cellules lorsque vous aspirez le surnageant. Diluer les cellules restantes dans un volume approprié de Milieu d’Aigle Modifié (DMEM) de Dulbecco/F-12 de Ham complété par 15% de FBS, 2 mM de L-glutamine, 1% de P/S et 1% d’acides aminés non essentiels, et ensemencer les cellules dans une plaque de culture tissulaire. Vérifiez la densité cellulaire au microscope et placez la plaque dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pour laisser les cellules adhérer et se développer.REMARQUE: Si les cellules sont trop denses, divisez immédiatement la suspension cellulaire en deux puits de la plaque de culture tissulaire avant de placer la plaque dans l’incubateur. 4. Validation du processus Cytométrie en fluxREMARQUE: La section 4.1 ne nécessite pas de conditions stériles et peut être effectuée à l’extérieur de la hotte laminaire. Effectuer la rubrique 4.1 en parallèle pour les échantillons prélevés à l’étape 2.11 (tumeur dissociée), à l’étape 3.1.6 (après épuisement des fibroblastes non associés au cancer) et à l’étape 3.2.6 (après enrichissement des fibroblastes associés au cancer). Centrifugez les tubes FACS préparés aux étapes 2.11, 3.1.6 et 3.2.6 pendant 10 min à 300 × g. Jetez le surnageant.REMARQUE: Préparez au moins un tube supplémentaire, qui contient des cellules non colorées agissant comme un contrôle pour définir les paramètres pour l’analyse. Dans les tubes d’échantillonnage, resussuspendez les cellules dans 88 μL de PBE et ajoutez 2 μL d’anticorps anti-CD45 conjugués avec de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC, dilution 1:50, selon les instructions du fabricant) et 10 μL d’anticorps anti-CD90.2 conjugués avec de la phycoérythrine (PE, dilution 1:10, selon les instructions du fabricant). Bien mélanger et incuber pendant 10 min à 4 °C dans l’obscurité. Dans le tube témoin (non coloré), ressuspendez les cellules dans 100 μL de PBE. Incuber pendant 10 min à 4 °C dans l’obscurité pour reproduire la procédure suivie pour les cellules colorées par anticorps.REMARQUE: La température et le temps d’incubation doivent être vérifiés avec soin, car une variation de ces variables pourrait entraîner une coloration médiocre ou non spécifique, modifiant ainsi les résultats. Après avoir terminé l’étape d’incubation, effectuez un lavage en ajoutant 1 mL de PBE. Centrifuger pendant 10 min à 300 x g. Jetez le surnageant. Resuspendez les cellules (tous les tubes) dans 500 μL de PBS. Bien mélanger et procéder à l’analyse de cytométrie en flux. Réglez les canaux pour mesurer la fluorescence des anticorps (c.-à-d. FITC et PE). À partir du tube de commande, sélectionnez toutes les cellules viables en dessinant une première porte (P1) sur le tracé de dispersion avant ou latérale (FSC vs SSC). Dans P1, définissez une deuxième porte (P2) comprenant uniquement des cellules individuelles. En utilisant les canaux de fluorescence spécifiques des anticorps (c.-à-d. FITC et PE), définissez des portes appropriées pour discerner les cellules colorées positivement. Commencez l’analyse et enregistrez au moins 10 000 événements dans P2. Lisez les signaux des deux canaux simultanément.REMARQUE: Si le nombre total de cellules est inférieur à celui prévu, il pourrait être préférable de lire le tube entier. (FACULTATIF) Si d’autres colorations avec des anticorps/fluorophores supplémentaires sont programmées, définissez une matrice de compensation appropriée avant de commencer l’analyse. Surveillance de la morphologie et des caractéristiques des cellulesREMARQUE: Une fois ensemencées, les cellules doivent être manipulées dans des conditions stériles. Le lendemain de l’ensemencement, visualisez les cellules au microscope optique pour vérifier l’adhésion et la morphologie des cellules. Aspirer le surnageant et le remplacer par un milieu frais.REMARQUE: Les CAF sont de grandes cellules en forme de fuseau, qui peuvent être facilement distinguées de la structure épithéliale des cellules tumorales 4T1. Maintenir les cellules à 37 °C et 5% de CO2 dans une atmosphère humidifiée, en changeant le milieu tous les 2 jours. Lorsque les cellules atteignent environ 80% de confluence (environ 4 à 6 jours après l’ensemencement), détachez les cellules à l’aide de la solution TrypLE Select (voir le tableau des matériaux)pendant 5 minutes à température ambiante. Ajouter le milieu frais (4:1), centrifuger la suspension cellulaire à 400 × g pendant 5 min et ressuspener la pastille dans un milieu frais. Divisez les cellules 1:2 et développez la culture jusqu’à ce que le nombre de cellules nécessaires à l’expérience soit obtenu. À chaque passage, vérifiez la morphologie et la croissance des cellules au microscope optique. Si la morphologie cellulaire n’est pas homogène (par exemple, des clones de petites cellules de forme ronde apparaissant en culture), analyser un échantillon de cellules par cytométrie en flux comme décrit à la rubrique 4.1. S’il est homogène, passez à l’étape 4.2.7.REMARQUE: Les changements dans la morphologie cellulaire peuvent indiquer une contamination par des fibroblastes non associés au cancer, qui doivent être enlevés pour assurer la pureté de la culture. Analyser les résultats de la cytométrie en flux et procéder selon l’un des scénarios suivants : (i) en cas de contamination des cellules CD90.2-/CD45-, prélever toutes les cellules et répéter la sélection positive en suivant l’étape 3.2; ii) si des cellules CD45+ sont également contaminées, prélever toutes les cellules et répéter l’épuisement à l’étape 3.1; iii) s’il n’y a pas de contamination (seules des cellules CD90.2+/CD45- sont présentes), garder les cellules en culture et passer directement au point 4.2.7.REMARQUE: Comme la répétition du processus d’épuisement avec des microbilles réduira la récupération cellulaire, il n’est recommandé que lorsque les cellules n’ont pas besoin d’être utilisées immédiatement. Comptez les cellules avec du bleu de trypan (1:1), placez 5 ×10 5 cellules dans deux tubes FACS et centrifugez pendant 10 min à 300 × g. Jeter le surnageant et ressusser la pastille dans 0,5 mL de tampon bloquant (PBS complété par 2% de BSA, 2% de sérum de chèvre) pendant 15 min à température ambiante.REMARQUE: Un tube agit comme un contrôle composé uniquement de cellules non colorées, tandis que les cellules du deuxième tube seront colorées pour l’analyse de cytométrie en flux. Centrifuger pendant 10 min à 300 × g, jeter le surnageant et ressuspender dans 99 μL de tampon bloquant. Ajouter 1 μg d’anticorps anti-FAP au tube d’échantillonnage et 1 mL de tampon bloquant au tube témoin. Bien mélanger et incuber pendant 15 min à température ambiante.REMARQUE: FAP est un marqueur de surface du stroma tumoral réactif et peut être utilisé pour identifier et caractériser les CAF. Laver trois fois avec du PBS, centrifuger et incuber avec l’anticorps secondaire approprié conjugué avec un colorant fluorescent (1 μg) dans un tampon bloquant pendant 15 min à température ambiante. Laver trois fois avec du PBS et analyser par cytométrie en flux (suivre les étapes 4.1.5 à 4.1.7 en réglant le canal approprié pour détecter le fluorophore utilisé). Ensuite, utilisez les cellules pour des expériences (étape 5.2). (FACULTATIF) Congeler un échantillon de cellules dans 1 mL de 90 % de FBS et de 10 % de diméthylsulfoxyde (DMSO); conserver à -80 °C pour une utilisation ultérieure. 5. CAF ciblant par des nanoparticules de ferritine modifiées REMARQUE: Une variante recombinante de la chaîne lourde de ferritine humaine (HFn) a été utilisée comme nanoparticule nue ou a été conjuguée avec des fractions de ciblage. Ici, les nanoparticules HFn fonctionnalisées avec la partie variable d’un anticorps anti-FAP (Fab@FAP) ont été préparées par le NanoBioLab de l’Université de Milan-Bicocca à deux rapports molaires HFn:Fab@FAP, 1:1 et 1:5, selon un protocole32décrit précédemment. Marquage fluorescent des nanoparticules HFnREMARQUE: Les nanocages HFn nus et fonctionnalisés sont marqués par fluorescence avec FITC. Dissoudre la poudre de FITC dans de l’éthanol à 99 % pour obtenir une concentration de 2 mg/mL.REMARQUE: Cette solution doit être préparée fraîchement. Incuber 50 μL de la solution préparée (200 μg de FITC) pour 1 mg de protéine (c.-à-d. 100 μL de HFn à 10 mg/mL). Ajouter 50 μL de 1 M de bicarbonate de sodium (NaHCO3),et régler le volume à 500 μL avec 0,1 M de NaHCO3.REMARQUE: Augmentez les volumes en fonction des besoins expérimentaux. Incuber le mélange réactionnel à température ambiante, dans l’obscurité et sous agitation continue pendant 1 h. Éliminer l’excès de FITC du conjugué par filtration sur gel à l’aide d’une colonne de dessalement par spin (7 kDa MWCO). Évaluer la concentration de la protéine marquée récupérée à l’aide d’un spectrophotomètre. Estimer les quantités de protéines et de colorants en mesurant l’absorbance à 280 nm et à 488 nm, respectivement. Liaison des nanoparticules de HFn aux CAFREMARQUE : Utilisez des CAF d’au plus tard les passages 4 à 5 dans culture. Placer 5 × 10 5 cellules danschaque tube FACS, centrifuger pendant 10 min à 300 × g, et resuspenter dans 0,5 mL de PBS, 0,3% de BSA complété par 0,1 mg/mL des différentes préparations de nanoparticules (HFn nu, HFn-Fab@FAP 1:1, HFn-Fab@FAP 1:5) préalablement étiquetées avec FITC.REMARQUE : Exécutez chaque condition en trois exemplaires. Préparer un tube supplémentaire comme échantillon témoin non étiqueté auquel aucune nanoparticule n’est ajoutée. Incuber pendant 2 h à 4 °C dans l’obscurité, centrifuger et laver trois fois dans du PBS. Resuspendez les cellules avec 0,5 mL de PBS, mélangez bien et analysez par cytométrie en flux. Définissez les canaux pour mesurer la fluorescence du FITC. Après avoir râté sur des cellules individuelles vivantes, acquérez 20 000 événements. Utilisez le tube témoin non étiqueté pour définir la porte de positivité FITC et obtenir le pourcentage d’événements FITC+ (correspondant à la liaison aux nanoparticules). 6. Analyse statistique et réplications expérimentales Animaux Effectuer trois expériences indépendantes de croissance tumorale et d’isolement des CAF, en utilisant 8 animaux par expérience, comme décrit au point 1.1.5. Pour optimiser le rendement d’isolement des CAF, divisez les tissus excisés en sous-groupes (n = 4) et traitez-les en suivant les étapes décrites à la section 2. Interaction HFn avec les cellules Évaluer l’interaction des HFn fonctionnalisées et non fonctionnalisées avec les cellules cibles et non ciblées (CAF et 4T1, respectivement) en termes de pourcentage de cellules colorées positivement par des nanocages marqués par fluorescence. Déclarez les résultats sous forme d’écart-type moyen ± de trois expériences indépendantes. Analyse statistique Pour calculer la signification statistique dans les expériences de liaison cellulaire avec HFn et HFn-FAP, utilisez le test ANOVA unidirectionnelle ordinaire.