低分子とdNTPase SAMHD1の相互作用を調べるためのハイスループット酵素共役活性アッセイ

図1に概説したプロトコールは、酵素共役マラカイトグリーンアッセイを利用して、低分子とdNTPase SAMHD1との相互作用を調べるための基本的なワークフローを説明しており、さまざまな生化学的疑問を解明するためにさまざまな方法で適応させることができます。以下の段落で説明する代表的な結果では、このアッセイを使用して、SAMHD1に対する低分子の阻害特性を決定し、異なるヌクレオチド類似体がこの酵素の基質および/または活性化因子であるかどうかをテストする例を示しています。 図 2 に示す結果は、このアッセイのいくつかの基本原理を示しています。マラカイトグリーン試薬は、リンモリブデン酸マラカイトグリーン錯体の形成による無機リン酸塩の比色検出を可能にするため、このアプローチは、生成物がリン酸塩である酵素反応の研究に適用できます。遊離無機リン酸塩を検出するためのこの分析法の感度を実証するために、図 2A は、マラカイト緑色試薬との 20 分間のインキュベーション後に Na3PO4 の濃度を増加させて得られた吸光度値を示しています。シグナルは0.25mMのNa3PO4で飽和に達するが、リン酸塩の線形検出範囲は0.004〜0.03mMで見え(図2A、右パネル)、マラカイトグリーンアッセイを用いて最大10〜20μMのリン酸塩の線形範囲を報告した他の研究と一致している38。 SAMHD1は、dNTP分子を加水分解する際に無機三リン酸を放出するdNTPaseであるため、マラカイトグリーンで検出するための遊離無機リン酸を生成するためには、カップリング酵素が必要です。大腸菌由来の無機ピロホスファターゼ(PPase)は、SAMHD1 7,20だけでなく、他のヌクレオチド代謝酵素30,33,35に関しても、この目的に有用であることが示されている。さらに、SAMHD1はホモ四量体として活性型dNTPaseであり、これには(d)NTP、具体的にはAS1のグアニン三リン酸(GTPまたはdGTP)とAS2の任意のdNTPによるアロステリック活性化が必要です。その後、触媒部位は基質結合のためにアクセス可能になり、酵素反応が起こります。dGTPはAS1およびAS2に結合するための要件を満たし、基質であるため、阻害アッセイにこのヌクレオチドを使用することでワークフローが大幅に簡素化されます。図 2B は、630 nm での吸光度の増加によって示される測定可能な SAMHD1 活性を達成するための、さまざまなアッセイ成分の要件を示しています。SAMHD1もPPaseも、dGTPの存在下では無機リン酸を生成することができず、これらの酵素の文書化された活性と一致しています。しかし、すべてのアッセイ成分(SAMHD1、PPase、およびdGTPアクチベーター/基質)が存在する状態では、シグナルの増加が観察されます。ここに示した例(酵素なし + dGTP をネガティブコントロール、SAMHD1/PPase + dGTP をポジティブコントロールとした場合)の Z 係数37 は 0.74 であり、頑健なアッセイであることを示しています。 酵素共役SAMHD1活性アッセイの潜在的な用途の1つは、ハイスループットスクリーニング(HTS)による阻害剤の同定です。したがって、このレポートでは、すでに文献に記載されている多様な化合物のセットを使用して、このアッセイでのSAMHD1阻害の検出を検証します。Seamonらは、ここに示されているのと同様のアッセイを用いて、SAMHD1に対するカノニカルヌクレオシドの用量依存的な阻害を評価し、デオキシグアノシン(dGuo)がSAMHD1を有意に阻害できる唯一のカノニカルヌクレオシドであり、IC50値は488μM20であることを発見しました。直接b4NPPアッセイで実施されたFDA承認薬物のHTSは、マイクロモル濃度でSAMHD1活性を阻害するいくつかのヒットを明らかにし、そこからロモファンギンはin vitroでSAMHD1 dNTPase活性を最も強力に阻害する分子であり、基質としてdGTPの存在下で測定すると20.1μMのIC50を示しました21.さらに、4つのα,β-imido-dNTP類似体は、MDCC-PBPセンサーとSAMHD1をPpx活性に結合させることでSAMHD1の競合阻害剤として同定され、dNMPNPP類似体の阻害定数が低マイクロモル/高ナノモルの範囲にあることが示されました6,22。したがって、酵素共役SAMHD1活性アッセイがSAMHD1阻害剤、dGuo、ロモファンギンおよび2′-デオキシチミジン-5′-[(α,β)-イミド]三リン酸(dTMPNPP)の同定に使用できることを実証するために、この技術を検証するために使用しました。図3Aは、これらの化合物について得られた用量反応曲線を示しており、濃度の上昇がSAMHD1活性を効果的に阻害することを示しています。3つの独立した実験から得られたこれらの分子の平均IC50値(標準偏差±)は、dGuo = 361.9 ± 72.8 μM、ロモファンギン6.78±3.9 μM、およびdTMPNPP = 2.10±0.9 μMであった。陰性結果の例として、SAMHD1活性に対するヒドロキシ尿素(HU)の影響も決定されました。HUはリボヌクレオチドレダクターゼの阻害剤であり、さまざまなAMLモデルでSAMHD1 ara-CTPase活性を制限しますが、SAMHD1に対するHUの影響は間接的であり、SAMHD1のアロステリック調節の攪乱に依存していることが示されました18。HUの用量反応曲線を図3Bに示し、HUの用量を増やしてもSAMHD1活性の変化は観察されず、HUがin vitroでSAMHD1活性を阻害しないことが実証された。 酵素結合SAMHD1活性アッセイの別の用途は、ヌクレオチドおよびその類似体がこの酵素の基質および/またはアロステリック活性化因子であるかどうかを調べることであり、これは 図4に示されています。この実験では、標準ヌクレオチド、およびシタラビン(ara-CTP)、クロファラビン(Cl-F-ara-ATP)、ゲムシタビン(dF-dCTP)などのいくつかの抗がんヌクレオシド類似体の活性代謝物を、SAMHD1基質および活性化剤として試験しました。SAMHD1の複雑なアロステリック制御により、AS1活性化因子としてのGTPまたはAS1およびAS2を占有する可能性のある非加水分解性dGTPアナログ2′-デオキシグアノシン-5′-(α-チオ)-三リン酸(dGTPαS)の存在下で反応が行われます。試験されたヌクレオチド類似体およびGTPの存在下でのSAMHD1活性は、ヌクレオチドが二次アロステリック部位および触媒部位(すなわち、AS2活性化因子および基質)に結合できることを示し、ヌクレオチド類似体およびdGTPαSによるSAMHD1活性は、ヌクレオチドが触媒部位(すなわち、基質のみ)のみを占有できることを示します。ヌクレオチドがAS1とAS2の両方のアロステリック部位と触媒部位に結合できる場合、dGTPの場合に示されるように、SAMHD1はヌクレオチドのみの存在下で活性を発揮します。この結果は、すべての標準的なdNTPがAS2部位と触媒部位に結合できることを示しています。ヌクレオチド類似体の場合、クロファラビン三リン酸はAS2活性化因子および基質であるのに対し、シタラビン三リン酸は触媒部位のみを占めることができる。一方、ゲムシタビン三リン酸では活性は観察されず、試験された条件下ではゲムシタビン三リン酸はアロステリックエフェクターまたは基質として作用できないことを示唆しています。この結果は以前の予測と一致しているが9、その後の結晶化と速度論的研究10 により、ゲムシタビン三リン酸がSAMHD1触媒ポケットに結合することができ、実際に酵素の基質であることが明らかになった。しかし、後者の研究10では、加水分解速度がシタラビン三リン酸などの他の報告された基質と比較してかなり低いことを示しており、このスクリーニング設定でこれを観察できなかった理由を説明しています。 全体として、これらの代表的な結果は、SAMHD1阻害剤、アロステリック調節因子、および基質の同定および特性評価のための堅牢な技術としての酵素共役SAMHD1活性アッセイの使用を実証しています。ただし、すべての実験的アプローチと同様に、この方法にも注意点があるため、直交アッセイ(異なるアッセイ技術を使用するなど)を使用して、所見をさらに検証する必要があります。 図1:この記事で説明するプロトコルの概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図2:酵素共役SAMHD1活性アッセイ。 (a)マラカイトグリーンアッセイにおけるNa3PO4標準曲線。 Na3PO4 段階希釈液(2 倍)を 1 mM から 0.004 mM まで 3 回に分けて調製し、マラカイト緑色試薬と 20 分間インキュベートしました。試験濃度の全範囲にわたる生の吸光度値は、左のパネルに、線形範囲は右のパネルに示されています。示されている2つの独立した実験の代表。(B)酵素共役活性アッセイのバリデーション。SAMHD1(0.35 μM)および/またはPPase(12.5 U/mL)を、アクチベーター/基質dGTP(25 μM)の存在下または非存在下で、酵素共役活性アッセイで20分間インキュベートしました。生の吸光度値をプロットした2つの独立した実験の代表的な4つ子、棒グラフ、およびエラーバーは平均とSDを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:酵素共役活性アッセイにおけるSAMHD1阻害化合物の評価。 活性化剤/基質としてdGTP(25μM)を用いた酵素結合SAMHD1活性アッセイにおけるロモファンギン(0.78-100μM)、2′-デオキシチミジン-5′-[(α,β)-イミド]三リン酸(dTMPNPP、0.01-100μM)およびデオキシグアノシン(dGuo、10-1,500μM)(A)またはヒドロキシ尿素(HU)(0.78-100μM)(B)の用量反応。個々の繰り返しからの反応コントロールに対する活性の割合をプロットし(DMSO + SAMHD1/PPase + dGTP = 100% 活性、DMSO + dGTP = 0% 活性)、3 つの実験の代表を示しました。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図4:酵素共役活性アッセイにおけるSAMHD1アロステリックアクチベーターおよび基質としてのヌクレオチド類似体の評価。 抗がん剤シタラビン(ara-CTP)、クロファラビン(Cl-F-ara-ATP)、およびゲムシタビン(dF-dCTP)の標準ヌクレオチドおよび選択された三リン酸代謝物を、GTPまたは非加水分解性dGTPアナログdGTPαS(12.5μM)の存在下または非存在下で、酵素結合SAMHD1活性アッセイで200 μMで試験しました。プロットされた個々の実験反復からの正規化された吸光度値、平均、およびSDが示されています。示されている2つの独立した実験の代表であり、以前の研究7から適応されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 歩 試薬 分注量(μL) 最終反応量(μL) 分注濃度 反応による倍増希釈 反応中の最終濃縮 1 阻害 剤 5 20 0.4ミリメートル 4 0.1ミリメートル 2 SAMHD1+PPaseミックス 5 1.4 μM SAMHD1、50 U/mL PPase 4 0.35 μM SAMHD1、12.5 U/mL Ppase 3 dGTPの 10 50μM 2 25 μM 4 20分間のインキュベーション 5 EDTAソリューション 20 40 7.9ミリメートル 2 3.95メートル 6 MG試薬 10 50 2.5 mM マラカイトグリーン、64.4 mM モリブデン酸アンモニウム、0.18% Tween-20 5 0.5 mM マラカイトグリーン、12.9 mM モリブデン酸アンモニウム、0.036% Tween-20 7 20分間のインキュベーション 8 読み取り@ 630 nm 表1:阻害剤スクリーニングのための酵素共役アッセイの最終条件の要約。 歩 試薬 分注量(μL) 最終反応量(μL) 分注濃度 反応による倍増希釈 反応中の最終濃縮 1 アロステリックレギュレーター 5 20 800μM 4 200μM 2 GTP または dGTPαS 5 50μM 4 12.5μM 3 SAMHD1および/またはPPase 10 0.7 μM SAMHD1、25 U/mL PPase 2 0.35 μM SAMHD1、12.5 U/mL PPase 4 20分間のインキュベーション 5 EDTAソリューション 20 40 7.9ミリメートル 2 3.95メートル 6 MG試薬 10 50 2.5 mM マラカイトグリーン、64.4 mM モリブデン酸アンモニウム、0.18% Tween-20 5 0.5 mM マラカイトグリーン、12.9 mM モリブデン酸アンモニウム、0.036% Tween-20 7 20分間のインキュベーション 8 読み取り@ 630 nm 表2:アロステリックレギュレータースクリーニングのための酵素共役アッセイの最終条件の要約