SAMHD1 è un deossinucleoside trifosfato trifoidrolasi con ruoli critici nella salute e nelle malattie umane. Qui presentiamo un versatile saggio di attività SAMHD1 accoppiato ad enzimi, distribuito in un formato di micropiastra a 384 pozzetti, che consente la valutazione di piccole molecole e analoghi nucleotidici come substrati, attivatori e inibitori di SAMHD1.
Il motivo alfa sterile e la proteina 1 contenente il dominio HD (SAMHD1) è un regolatore fondamentale dei pool intracellulari di deossinucleosidi trifosfato (dNTP), poiché questo enzima può idrolizzare i dNTP nei loro corrispondenti nucleosidi e trifosfati inorganici. A causa del suo ruolo critico nel metabolismo dei nucleotidi, della sua associazione a diverse patologie e del suo ruolo nella resistenza alla terapia, sono attualmente in corso intense ricerche per una migliore comprensione sia della regolazione che della funzione cellulare di questo enzima. Per questo motivo, lo sviluppo di metodi semplici ed economici ad alto rendimento per sondare l’interazione di piccole molecole con SAMHD1, come regolatori allosterici, substrati o inibitori, è vitale. A questo scopo, il saggio del verde di malachite accoppiato enzimatico è un saggio colorimetrico semplice e robusto che può essere utilizzato in un formato di piastra da 384 micropozzetti che consente la misurazione indiretta dell’attività di SAMHD1. Poiché SAMHD1 rilascia il gruppo trifosfato dai substrati nucleotidici, possiamo accoppiare un’attività di pirofosfatasi a questa reazione, producendo così fosfato inorganico, che può essere quantificato dal reagente verde malachite attraverso la formazione di un complesso verde di fofosfomolibdato malachite. Qui, mostriamo l’applicazione di questa metodologia per caratterizzare gli inibitori noti di SAMHD1 e per decifrare i meccanismi coinvolti nella catalisi di SAMHD1 di substrati non canonici e nella regolazione da parte di attivatori allosterici, esemplificati da farmaci antitumorali a base di nucleosidi. Pertanto, il saggio del verde di malachite accoppiato enzimatico è un potente strumento per studiare SAMHD1 e, inoltre, potrebbe anche essere utilizzato nello studio di diversi enzimi che rilasciano specie di fosfato.
Il motivo alfa sterile e la proteina 1 contenente il dominio istidina-aspartato (SAMHD1) è un regolatore centrale dell’omeostasi nucleotidica nelle cellule di mammifero1 con molti ruoli nella salute e nella malattia umana2. Questo enzima è in grado di idrolizzare i deossinucleosidi trifosfati (dNTP) nelle loro molecole affini di deossinucleoside e trifosfato inorganico 3,4, con questa attività regolata allostericamente dall’abbondanza di (d)NTP (esaminata nel riferimento5). Ogni monomero SAMHD1 contiene due siti allosterici (AS1 e AS2) e un sito catalitico, e la formazione dell’enzima attivo richiede l’assemblaggio ordinato di un omotetramero al legame (d)NTP. La dimerizzazione dei monomeri SAMHD1 viene prima innescata attraverso il legame di un trifosfato di guanina (GTP o dGTP) ad AS1 e la successiva tetramerizzazione si ottiene quando un’ulteriore molecola di dNTP si lega ad AS2, consentendo l’accesso del substrato al sito catalitico e la successiva idrolisi.
I substrati di SAMHD1 includono i quattro dNTP canonici 3,4 insieme ad alcuni nucleotidi modificati con basi e zuccheri, inclusi i metaboliti trifosfato di diversi farmaci a base di nucleosidi utilizzati nel trattamento delle infezioni virali e del cancro, molti dei quali possono anche fungere da attivatori allosterici 6,7,8,9,10,11. Di conseguenza, SAMHD1 modula l’efficacia di molti di questi composti nei modelli di malattia 7,8,9,10,11,12,13,14,15 e, inoltre, nel caso dell’analogo della deossicitidina citarabina (ara-C), che è rimasta per decenni la terapia standard per la leucemia mieloide acuta (LMA), in realtà detta Efficacia del trattamento in questa malattia 7,8,16. SAMHD1 è quindi un potenziale biomarcatore e bersaglio terapeutico per migliorare l’efficacia delle terapie a base di nucleosidi17 e, di conseguenza, noi e altri abbiamo cercato di identificare strategie per inattivare SAMHD1 nelle cellule. Abbiamo proposto l’uso della proteina virale X (Vpx) come inibitore biologico per colpire SAMHD1 per la degradazione all’interno delle cellule tumorali7, tuttavia, questo approccio ha una serie di limitazioni (discusse nel riferimento12), e recentemente abbiamo anche riportato un approccio indiretto per sopprimere l’attività di SAMHD1 attraverso l’inibizione della ribonucleotide reduttasi che abbiamo dimostrato in vari modelli di LMA18. Un certo numero di studi ha cercato di identificare piccole molecole in grado di inibire direttamente SAMHD1 e, ad oggi, diverse di queste molecole sono state riportate, tuttavia, documentando solo l’inibizione in vitro 6,9,19,20,21,22. Di conseguenza, la mancanza di piccole molecole che inibiscono potentemente l’attività di SAMHD1 nelle cellule, unita ai complessi meccanismi di catalisi di SAMHD1 di terapie a base di nucleosidi, sottolinea la necessità di ulteriori indagini. Pertanto, metodi robusti e idealmente ad alto rendimento per sondare l’interazione di piccole molecole con SAMHD1 sono ideali per identificare substrati, regolatori allosterici e inibitori di questo enzima clinicamente rilevante.
Sono disponibili diverse metodologie che misurano direttamente l’attività della dNTPasi di SAMHD1, come la cromatografia su strato sottile (TLC)9,20,23 e la cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)9,21, ma queste non sono prontamente suscettibili a configurazioni ad alto rendimento. Un’eccezione è il saggio riportato da Mauney et al., che sfrutta la capacità di SAMHD1 di idrolizzare il bis (4-nitrofenil) fosfato (b4NPP) a p-nitrofenolo e p-nitrofenilfosfato quando Mn2+ viene utilizzato come catione attivante, con conseguente cambiamento colorimetrico che può essere prontamente misurato in una piastra a micropozzetti21. Questo saggio è stato utilizzato con successo per l’identificazione e la caratterizzazione degli inibitori di SAMHD1, ma va notato che l’idrolisi si verifica in assenza di attivatori (d)NTP e in presenza di un probabile catione attivante non fisiologico, entrambi importanti avvertimenti da considerare. Ciò rende questo test meno applicabile allo studio e all’identificazione di regolatori allosterici di SAMHD1.
In questo contesto, un approccio accoppiato enzimatico combinato con il reagente verde della malachite, come dettagliato in questo rapporto, può essere un metodo versatile per misurare indirettamente l’attività dNTPasica di SAMHD1 e, inoltre, interrogare l’impatto di varie piccole molecole su di esso. Il saggio del verde di malachite è una tecnica colorimetrica robusta e affidabile per la rilevazione del fosfato inorganico libero (Pi), basata sulla formazione di un complesso di acido molibdofosforico che porta a una variazione colorimetrica misurata a 620 nm24. Poiché l’idrolisi di SAMHD1 rilascia il gruppo trifosfato dai substrati nucleotidici, è quindi necessario accoppiare questa reazione con un’attività di (piro)fosfatasi, che genererà fosfato inorganico libero, prima dell’aggiunta del reagente verde malachite. Il saggio del verde di malachite è sensibile ed economico ed è stato ampiamente utilizzato per l’identificazione e la caratterizzazione di inibitori e substrati per enzimi che rilasciano gruppi fosfato inorganici nelle loro reazioni o in presenza di un enzima di accoppiamento. È stato ampiamente applicato nella caratterizzazione delle attività dell’ATPasi delle elicasi 25,26,27 o nello studio dell’attività enzimatica di CD73, che media la degradazione dell’AMP in adenosina e fosfato inorganico 28. Inoltre, quando accoppiato, è stato impiegato nella scoperta di farmaci antibiotici che hanno come bersaglio la UDP-2,3-diacilglucosamina pirofosfatasi LpxH, un enzima essenziale nella maggior parte dei patogeni Gram-negativi29. Per quanto riguarda la ricerca sul cancro, l’approccio accoppiato enzimatico è stato ampiamente utilizzato contro le idrolasi NUDIX, una famiglia di enzimi che metabolizzano i nucleotidi, sia nella caratterizzazione dei substrati 30,31,32 che nell’identificazione e sviluppo di farmaci e sonde chimiche 33,34,35,36.
Per quanto riguarda la dNTPasi SAMHD1, questo approccio è stato utilizzato in diversi rapporti. Utilizzando l’esopolifosfatasi Ppx1 di Saccharomyces cerevisiae come enzima di accoppiamento, questo test è stato utilizzato per testare diversi analoghi nucleotidici come substrati, attivatori o inibitori di SAMHD1 e ha portato all’identificazione del metabolita trifosfato del farmaco antileucemico clofarabina come attivatore e substrato6. Inoltre, con la pirofosfatasi inorganica di Escherichia coli come enzima di accoppiamento, è stata impiegata nello screening di una libreria di composti clinicamente approvati contro SAMHD1 per identificare gli inibitori20. Nella nostra ricerca, abbiamo utilizzato questo approccio per dimostrare che ara-CTP, il metabolita attivo di ara-C, è un substrato di SAMHD1 ma non un attivatore allosterico7 e successivamente abbiamo utilizzato questo test per dimostrare che diverse piccole molecole che potrebbero sensibilizzare i modelli di LMA ad ara-C in modo SAMHD1-dipendente, in realtà non inibiscono direttamente SAMHD118. In questo rapporto, descriveremo in dettaglio questo metodo versatile e ne dimostreremo l’applicabilità, in una configurazione ad alto rendimento, per l’identificazione di inibitori, attivatori e substrati di SAMHD1.
Il saggio di attività accoppiata enzimatica qui descritto è un saggio colorimetrico ad alto rendimento che consente la misurazione indiretta dell’idrolisi del dNTP da parte di SAMHD1. Questo metodo sfrutta la capacità della PPasi inorganica di E. coli, che se inclusa in eccesso nella miscela di reazione, converte ogni trifosfato inorganico generato da SAMHD1 in tre singoli fosfati liberi che possono essere quantificati utilizzando il semplice ed economico reagente verde malachite. Forniamo questo test in un formato di piastra a 384 micropozzetti, ideale per lo screening di librerie di composti, e dimostriamo l’applicabilità e la versatilità di questa tecnica nell’identificazione e caratterizzazione di inibitori, attivatori e substrati di SAMHD1.
Come per tutti i saggi di screening biochimico in vitro , ci sono una serie di passaggi critici e considerazioni importanti, e molti di questi sono discussi in modo approfondito nel Manuale di guida per i saggi39 disponibile gratuitamente. L’integrità degli enzimi ricombinanti purificati, sia SAMHD1 che dell’enzima accoppiato PPasi inorganica, è estremamente importante e deve essere confermata prima di stabilire il saggio. E di conseguenza, ogni nuova purificazione di questi enzimi dovrebbe essere soggetta a un certo livello di test per lotti, poiché le variabilità da lotto a lotto potrebbero introdurre incongruenze nei risultati. Idealmente, l’uso di un test diretto ortogonale, come l’HPLC, che consente la rilevazione sia del substrato che del prodotto di reazione, dovrebbe essere utilizzato per verificare l’attività della dNTP trifosfoidrolasi del ricombinante purificato SAMHD1 utilizzato.
Per quanto riguarda i limiti di questo saggio, il principale è che misura l’attività dNTPasica di SAMHD1 in modo indiretto, sfruttando l’attività della PPasi inorganica, che ha una serie di implicazioni. È importante confermare che la PPasi possiede poca o nessuna attività nei confronti dei nucleotidi utilizzati nel saggio e, allo stesso modo, che le piccole molecole inibitorie identificate non possiedono alcuna attività nei confronti della PPasi. Pertanto, per quanto riguarda lo screening, un contro-screening contro la PPasi può essere una considerazione importante. La presenza di PPasi nella reazione rende inoltre fondamentale l’utilizzo di un test ortogonale per confermare i risultati. Per quanto riguarda i saggi di attività diretta, ad oggi ne sono stati riportati alcuni, tra cui TLC 9,20,23 e HPLC 9,21, che rilevano con precisione l’esaurimento del substrato e la formazione di prodotti. Inoltre, il saggiob4NPP 21, anch’esso ad alto rendimento, potrebbe essere utilizzato per testare potenziali inibitori; Tuttavia, non è l’ideale testare substrati o attivatori allosterici. Anche i saggi biofisici, come la fluorimetria a scansione differenziale (DSF), che abbiamo precedentemente riportato con SAMHD118, possono essere particolarmente potenti nell’identificazione e caratterizzazione dei ligandi. Un’altra limitazione del saggio, in particolare come mostrato nella configurazione qui per l’identificazione di substrati e attivatori, è l’uso del dGTPαS analogico dGTP non idrolizzabile come attivatore AS1 e AS2. Mentre questo consente l’attivazione di SAMHD1 senza attività osservabile nel saggio, dGTPαS è un inibitore competitivo di SAMHD1 e quindi l’uso di alte concentrazioni inattiverà l’enzima. Man mano che la nostra comprensione di SAMHD1 progredisce, studi futuri potrebbero utilizzare molecole che occupano esclusivamente ogni sito di SAMHD1, negando così questo potenziale problema.
Come abbiamo mostrato qui, questo metodo è versatile e può essere utilizzato per affrontare una serie di domande biochimiche. Abbiamo descritto due varianti di questo saggio, una per l’identificazione di regolatori allosterici e substrati di SAMHD1, e un’altra per la caratterizzazione di inibitori, ma possono essere fatti ulteriori adattamenti. Per quanto riguarda i potenziali inibitori, questo saggio, essendo basato su piastre a micropozzetti, lo rende adatto per studi sul meccanismo d’azione a valle39,40. Allo stesso modo, per un’ulteriore caratterizzazione dei substrati e dei regolatori allosterici, questa tecnica può essere utilizzata per determinare i parametri cinetici della catalisi, come abbiamo fatto per il metabolita attivo della citarabina e della clofarabina7. Tuttavia, uno svantaggio è che il saggio accoppiato enzimatico qui riportato è un test endpoint e quindi, sebbene adatto per lo screening, un test continuo sarebbe più adatto per alcuni studi meccanicistici. Arnold et al. hanno riportato un test enzimatico continuo che utilizza il biosensore MDCC-PBP6, che si basa sull’uso della proteina legante il fosfato periplasmatico (PBP) marcata con il fluoroforo cumarina maleimmide (MDCC) che può legarsi a un gruppo fosfato libero. MDCC-PBP è molto sensibile e consente la quantificazione di concentrazioni di fosfato molto basse, con un tempo di risposta del sensore compreso tra i millisecondi e i secondi.
SAMHD1 svolge una serie di importanti funzioni nella salute e nella malattia umana2 , molte delle quali potrebbero essere collegate al suo ruolo centrale nel mantenimento dei livelli intracellulari di dNTP1. Pertanto, l’identificazione di una sonda chimica di alta qualità verso l’attività della dNTPasi di SAMHD1 sarebbe un potente strumento nella definizione di questi legami e il saggio accoppiato enzimatico qui riportato potrebbe essere prontamente impiegato per identificare tali sonde. Inoltre, poiché i farmaci a base di nucleosidi, molti dei quali sono modulati da SAMHD1, costituiscono un gruppo diversificato e importante diterapie 41; le sonde chimiche potrebbero essere ulteriormente sviluppate in farmaci per colpire SAMHD1 in ambito clinico, con l’obiettivo di migliorare l’efficacia di queste terapie. È inoltre fondamentale comprendere l’intera portata dell’interazione di questi composti a base di nucleosidi con SAMHD1, una questione che può essere affrontata utilizzando anche questo test accoppiato enzimatico. Nel complesso, il saggio di attività SAMHD1 accoppiato all’enzima, come riportato qui, è un test a basso costo, versatile e ad alto rendimento che può essere utilizzato per approfondire la nostra comprensione di questo importante enzima.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Thomas Lundbäck e i membri del laboratorio di Thomas Helleday per la consulenza e il supporto. Parte di questo lavoro è stato facilitato dalla Protein Science Facility del Karolinska Institutet/SciLifeLab (http://ki.se/psf), e ringraziamo il National Cancer Institute (NCI), la Division of Cancer Treatment and Diagnosis (DCTD) e il Developmental Therapeutics Program (DTP) (http://dtp.cancer.gov) per aver fornito un composto. Il finanziamento è stato fornito da sovvenzioni concesse a S.G.R. dal Consiglio svedese della ricerca (2018-02114), dalla Società svedese sul cancro (19-0056-JIA, 20-0879-PJ), dal Fondo svedese per il cancro infantile (PR2019-0014) e dal Karolinska Institutet.
2'-deoxyadenosine-5'-triphosphate (dATP) | Jena bioscience | NU-1001 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
2'-deoxycytidine-5'-triphosphate (dCTP) | Jena bioscience | NU-1002 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
2'-Deoxyguanosine-5'-(α-thio)-triphosphate (dGTPαS) | Jena bioscience | NU-424 | Non-hydrolyzable dGTP analogue for SAMHD1 activator/substrate assay |
2'-deoxyguanosine-5'-triphosphate (dGTP) | GE Healthcare | 27-1870-04 | SAMHD1 allosteric activator and substrate used in inhibition assay and activator/substrate assay |
2'-Deoxythymidine-5'-[(α,β)-imido]triphosphate (dTMPNPP) | Jena bioscience | NU-907-1 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
2'-deoxythymidine-5'-triphosphate (dTTP) | Jena bioscience | NU-1004 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
2'Deoxyguanosine mohohydrate (dGuo) | Sigma-Aldrich | D0901 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
384 well clear flat-bottom microplate | Thermo Fisher Scientific | 262160 | Assay plate |
96 well clear U-bottom polypropylene microplate | Thermo Fisher Scientific | 267245 | Compound dilution plate |
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A1343 | Reagent required for malachite green working reagent |
ara-Cytidine-5'-triphosphate (ara-CTP) | Jena bioscience | NU-1170 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
Clofarabine-5'-triphosphate (Cl-F-ara-ATP) | Jena bioscience | NU-874 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | VWR | 23486.297 | Solvent |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | EDTA stop solution component |
Gemcitabine-5'-triphosphate (dF-dCTP) | Jena bioscience | NU-1607 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Data analysis and visualisation |
Guanosine 5′-triphosphate (GTP) sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G8877 | Allosteric activator for SAMHD1 activator/substrate assay |
His-tagged E. coli inorganic pyrophosphatase (PPase) | Generated in house using Protein Science Facility, Karolinska Institutet | – | Recombinant PPase protein, hydrolises inorganic triphosphate and pyrophosphate to orthophosphate so it can form complex with malachite green |
His-tagged human SAMHD1 | Generated in house using Protein Science Facility, Karolinska Institutet | – | Recombinant SAMHD1 protein, hydrolizes dNTPs into its corresponding nucleoside and inorganic triphosphate |
Hydroxyurea | Sigma-Aldrich | H8627 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
Lomofungin | National Cancer Institute (NCI)/Division of Cancer Treatment and Diagnosis (DCTD)/Developmental Therapeutics Program (DTP) | NSC106995 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | SAMHD1 reaction buffer component |
Malachite green Carbinol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 213020 | Malachite green stock component |
Microplate Reader | Hidex | Hidex Sense Microplate reader | Data acquisition, absorption read at 630 nm wavelength |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434 | SAMHD1 reaction buffer component |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 567530 | SAMHD1 reaction buffer component |
Sodium phosphate (Na3PO4) | Sigma-Aldrich | 342483 | Required for phosphate standard curve |
Sulphuric acid 95-97% | Sigma-Aldrich | 84720 | Malachite green stock component |
Tris-Acetate salt | Sigma-Aldrich | T1258 | SAMHD1 reaction buffer component |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706 | SAMHD1 reaction buffer component |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | SAMHD1 reaction buffer and malachite green working reagent component |