SAMHD1 ist eine Desoxynukleosidtriphosphat-Triphosphohydrolase, die eine entscheidende Rolle bei der menschlichen Gesundheit und Krankheit spielt. Hier stellen wir einen vielseitigen enzymgekoppelten SAMHD1-Aktivitätsassay vor, der in einem 384-Well-Mikrotiterplattenformat eingesetzt wird und die Evaluierung von kleinen Molekülen und Nukleotidanaloga als SAMHD1-Substrate, Aktivatoren und Inhibitoren ermöglicht.
Steriles Alpha-Motiv und HD-Domänen-enthaltendes Protein 1 (SAMHD1) ist ein zentraler Regulator der intrazellulären Desoxynukleosidtriphosphat (dNTP)-Pools, da dieses Enzym dNTPs in ihre entsprechenden Nukleoside und anorganischen Triphosphate hydrolysieren kann. Aufgrund seiner entscheidenden Rolle im Nukleotidstoffwechsel, seiner Assoziation mit verschiedenen Pathologien und seiner Rolle bei der Therapieresistenz wird derzeit intensiv daran geforscht, sowohl die Regulation als auch die zelluläre Funktion dieses Enzyms besser zu verstehen. Aus diesem Grund ist die Entwicklung einfacher und kostengünstiger Hochdurchsatzmethoden zur Untersuchung der Wechselwirkung kleiner Moleküle mit SAMHD1, wie z. B. allosterische Regulatoren, Substrate oder Inhibitoren, von entscheidender Bedeutung. Zu diesem Zweck ist der enzymgekoppelte Malachitgrün-Assay ein einfacher und robuster kolorimetrischer Assay, der in einem 384-Mikrotiterplatten-Format eingesetzt werden kann, was die indirekte Messung der SAMHD1-Aktivität ermöglicht. Da SAMHD1 die Triphosphatgruppe aus Nukleotidsubstraten freisetzt, können wir eine Pyrophosphatase-Aktivität an diese Reaktion koppeln, wodurch anorganisches Phosphat entsteht, das durch das Malachitgrün-Reagenz durch die Bildung eines Phosphomolybdat-Malachitgrün-Komplexes quantifiziert werden kann. In dieser Arbeit zeigen wir die Anwendung dieser Methodik, um bekannte Inhibitoren von SAMHD1 zu charakterisieren und die Mechanismen zu entschlüsseln, die an der SAMHD1-Katalyse von nicht-kanonischen Substraten und der Regulation durch allosterische Aktivatoren beteiligt sind, am Beispiel von Nukleosid-basierten Krebsmedikamenten. Daher ist der enzymgekoppelte Malachitgrün-Assay ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung von SAMHD1 und könnte darüber hinaus auch bei der Untersuchung mehrerer Enzyme eingesetzt werden, die Phosphatspezies freisetzen.
Steriles Alpha-Motiv und Histidin-Aspartat-Domänen-enthaltendes Protein 1 (SAMHD1) ist ein zentraler Regulator der Nukleotidhomöostase in Säugetierzellen1 mit vielen Rollen bei der menschlichen Gesundheit und Krankheit2. Dieses Enzym ist in der Lage, Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs) in ihre verwandten Desoxynukleosid- und anorganischen Triphosphatmoleküle 3,4 zu hydrolysieren, wobei diese Aktivität allosterisch durch die (d)NTP-Häufigkeit reguliert wird (siehe Referenz5). Jedes SAMHD1-Monomer enthält zwei allosterische Stellen (AS1 und AS2) und eine katalytische Stelle, und die Bildung des aktiven Enzyms erfordert die geordnete Assemblierung eines Homotetramers bei (d)NTP-Bindung. Die Dimerisierung von SAMHD1-Monomeren wird zunächst durch die Bindung eines Guanintriphosphats (GTP oder dGTP) an AS1 ausgelöst, und die anschließende Tetramerisierung wird erreicht, wenn ein zusätzliches dNTP-Molekül an AS2 bindet, was den Substratzugang zum katalytischen Zentrum und die anschließende Hydrolyse ermöglicht.
SAMHD1-Substrate umfassen die vier kanonischen dNTPs 3,4 zusammen mit einigen basen- und zuckermodifizierten Nukleotiden, einschließlich der Triphosphatmetaboliten mehrerer nukleosidbasierter Arzneimittel, die bei der Behandlung von Virusinfektionen und Krebs verwendet werden, von denen einige auch als allosterische Aktivatoren dienen können 6,7,8,9,10,11. In der Konsequenz moduliert SAMHD1 die Wirksamkeit vieler dieser Substanzen in den Krankheitsmodellen 7,8,9,10,11,12,13,14,15 und diktiert darüber hinaus im Falle des Desoxycytidin-Analogons Cytarabin (ara-C), das seit Jahrzehnten die Standardtherapie der akuten myeloischen Leukämie (AML) ist, tatsächlich Wirksamkeit der Behandlung bei dieser Krankheit 7,8,16. SAMHD1 ist daher ein potenzieller Biomarker und therapeutisches Ziel, um die Wirksamkeit von Nukleosid-basierten Therapien zu verbessern17, und dementsprechend haben wir und andere versucht, Strategien zur Inaktivierung von SAMHD1 in Zellen zu identifizieren. Wir schlugen die Verwendung des viralen Proteins X (Vpx) als biologischen Inhibitor vor, um SAMHD1 für den Abbau in Krebszellen zu beeinflussen7, jedoch hat dieser Ansatz eine Reihe von Einschränkungen (diskutiert in Referenz12), und wir berichteten kürzlich auch über einen indirekten Ansatz zur Unterdrückung der SAMHD1-Aktivität durch Hemmung der Ribonukleotidreduktase, den wir in verschiedenen Modellen der AMLdemonstrierten 18. Eine Reihe von Studien hat versucht, kleine Moleküle zu identifizieren, die in der Lage sind, SAMHD1 direkt zu hemmen, und bis heute wurden mehrere solcher Moleküle berichtet, die jedoch nur eine Hemmung in vitro dokumentieren 6,9,19,20,21,22. Folglich unterstreicht der Mangel an kleinen Molekülen, die die SAMHD1-Aktivität in Zellen stark hemmen, in Verbindung mit den komplexen Mechanismen der SAMHD1-Katalyse von Nukleosid-basierten Therapeutika, die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen. Daher sind robuste und im Idealfall für den Hochdurchsatz zugängliche Methoden zur Untersuchung der Interaktion kleiner Moleküle mit SAMHD1 ideal, um Substrate, allosterische Regulatoren und Inhibitoren dieses klinisch relevanten Enzyms zu identifizieren.
Es stehen mehrere Methoden zur Verfügung, die die dNTPase-Aktivität von SAMHD1 direkt messen, wie z. B. die Dünnschichtchromatographie (TLC)9,20,23 und die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)9,21, aber diese sind für Hochdurchsatzaufbauten nicht ohne weiteres geeignet. Eine Ausnahme ist der von Mauney et al. berichtete Assay, der die Fähigkeit von SAMHD1 ausnutzt, Bis(4-nitrophenyl)phosphat (b4NPP) zu p-Nitrophenol und p-Nitrophenylphosphat zu hydrolysieren, wennMn2+ als aktivierendes Kation verwendet wird, was zu einer kolorimetrischen Änderung führt, die leicht in einer Mikrotiterplatte21 gemessen werden kann. Dieser Assay wurde erfolgreich für die Identifizierung und Charakterisierung von SAMHD1-Inhibitoren eingesetzt, aber es sollte beachtet werden, dass die Hydrolyse in Abwesenheit von (d)NTP-Aktivatoren und in Gegenwart eines wahrscheinlich nicht-physiologischen aktivierenden Kations auftritt, was beides wichtige Vorbehalte sind, die es zu berücksichtigen gilt. Dies macht diesen Assay auch weniger anwendbar für die Untersuchung und Identifizierung allosterischer Regulatoren von SAMHD1.
In diesem Zusammenhang kann ein enzymgekoppelter Ansatz in Kombination mit dem Malachitgrün-Reagenz, wie in diesem Bericht beschrieben, eine vielseitige Methode sein, um die dNTPase-Aktivität von SAMHD1 indirekt zu messen und darüber hinaus den Einfluss verschiedener kleiner Moleküle darauf zu untersuchen. Der Malachitgrün-Assay ist ein robustes und zuverlässiges kolorimetrisches Verfahren zum Nachweis von freiem anorganischem Phosphat (Pi), das auf der Bildung eines Molybdophosphorsäurekomplexes basiert, der zu einer kolorimetrischen Änderung führt, die bei 620 nm24 gemessen wird. Da bei der SAMHD1-Hydrolyse die Triphosphatgruppe aus Nukleotidsubstraten freigesetzt wird, ist es daher notwendig, diese Reaktion vor der Zugabe des Malachitgrün-Reagenzes mit einer (Pyro-)Phosphatase-Aktivität zu koppeln, die freies anorganisches Phosphat erzeugt. Der Malachitgrün-Assay ist empfindlich und kostengünstig und wird häufig zur Identifizierung und Charakterisierung von Inhibitoren und Substraten für Enzyme eingesetzt, die anorganische Phosphatgruppen entweder in ihren Reaktionen oder in Gegenwart eines Kupplungsenzyms freisetzen. Es wurde häufig bei der Charakterisierung der ATPase-Aktivitäten von Helikasen25,26,27 oder bei der Untersuchung der enzymatischen Aktivität CD73 eingesetzt, die den Abbau von AMP zu Adenosin und anorganischem Phosphat vermittelt28. Darüber hinaus wurde es, wenn es gekoppelt ist, bei der Entdeckung von Antibiotika eingesetzt, die auf die UDP-2,3-Diacylglucosamin-Pyrophosphatase LpxH abzielen, ein essentielles Enzym in den meisten gramnegativen Krankheitserregern29. In Bezug auf die Krebsforschung wurde der enzymgekoppelte Ansatz in großem Umfang gegen die NUDIX-Hydrolasen, eine Familie von Nukleotid-metabolisierenden Enzymen, sowohl bei der Charakterisierung von Substraten 30,31,32 als auch bei der Identifizierung und Entwicklung von Medikamenten und chemischen Sonden 33,34,35,36 eingesetzt.
In Bezug auf die dNTPase SAMHD1 wurde dieser Ansatz in mehreren Berichten verwendet. Unter Verwendung der Exopolyphosphatase Ppx1 aus Saccharomyces cerevisiae als Kopplungsenzym wurde dieser Assay verwendet, um mehrere Nukleotidanaloga entweder als Substrate, Aktivatoren oder Inhibitoren von SAMHD1 zu testen, und führte zur Identifizierung des Triphosphatmetaboliten des Antileukämiemedikaments Clofarabin als Aktivator und Substrat6. Darüber hinaus wurde es mit anorganischer Pyrophosphatase aus Escherichia coli als Kupplungsenzym beim Screening einer Bibliothek klinisch zugelassener Verbindungen gegen SAMHD1 eingesetzt, um Inhibitorenzu identifizieren 20. In unserer Forschung haben wir diesen Ansatz verwendet, um zu zeigen, dass ara-CTP, der aktive Metabolit von ara-C, ein SAMHD1-Substrat, aber kein allosterischer Aktivator7 ist, und anschließend diesen Assay verwendet, um zu zeigen, dass mehrere kleine Moleküle, die AML-Modelle auf SAMHD1-abhängige Weise für ara-C sensibilisieren könnten, tatsächlich SAMHD118 nicht direkt hemmen. In diesem Bericht werden wir diese vielseitige Methode detailliert beschreiben und ihre Anwendbarkeit in einem Hochdurchsatz-Aufbau für die Identifizierung von Inhibitoren, Aktivatoren und Substraten von SAMHD1 demonstrieren.
Der hier beschriebene enzymgekoppelte Aktivitätsassay ist ein kolorimetrischer Hochdurchsatz-Assay, der die indirekte Messung der dNTP-Hydrolyse durch SAMHD1 ermöglicht. Diese Methode nutzt die Fähigkeit der anorganischen PPase aus E. coli, die, wenn sie im Überschuss in der Reaktionsmischung enthalten ist, jedes von SAMHD1 erzeugte anorganische Triphosphat in drei einzelne freie Phosphate umwandelt, die mit dem einfachen und kostengünstigen Malachitgrün-Reagenz quantifiziert werden können. Wir bieten diesen Assay in einem 384-Mikrotiterplattenformat an, das sich ideal für das Screening von Substanzbibliotheken eignet, und demonstrieren die Anwendbarkeit und Vielseitigkeit dieser Technik bei der Identifizierung und Charakterisierung von SAMHD1-Inhibitoren, Aktivatoren und Substraten.
Wie bei allen biochemischen In-vitro-Screening-Assays gibt es eine Reihe kritischer Schritte und wichtiger Überlegungen, von denen viele im frei verfügbaren Assay Guidance Manual39 ausführlich erörtert werden. Die Integrität der gereinigten rekombinanten Enzyme, sowohl SAMHD1 als auch des gekoppelten Enzyms anorganische PPase, ist äußerst wichtig und sollte vor der Etablierung des Assays bestätigt werden. Dementsprechend sollte jede neue Aufreinigung dieser Enzyme einem gewissen Maß an Chargentests unterzogen werden, da Schwankungen von Charge zu Charge zu Inkonsistenzen in den Ergebnissen führen können. Im Idealfall sollte ein orthogonaler Direktassay wie HPLC verwendet werden, der den Nachweis sowohl des Substrats als auch des Reaktionsprodukts ermöglicht, um die dNTP-Triphosphohydrolase-Aktivität des verwendeten gereinigten rekombinanten SAMHD1 zu überprüfen.
Was die Einschränkungen dieses Assays betrifft, so besteht das Prinzip darin, dass er die dNTPase-Aktivität von SAMHD1 auf indirekte Weise misst, wobei die Aktivität der anorganischen PPase ausgenutzt wird, was eine Reihe von Implikationen hat. Es ist wichtig zu bestätigen, dass PPase wenig bis gar keine Aktivität gegenüber Nukleotiden besitzt, die im Assay verwendet werden, und ebenso, dass identifizierte inhibitorische kleine Moleküle keine Aktivität gegenüber PPase besitzen. Daher kann im Hinblick auf das Screening ein Gegenschirm gegen PPase eine wichtige Überlegung sein. Das Vorhandensein von PPase in der Reaktion macht es auch wichtig, einen orthogonalen Assay zu verwenden, um die Ergebnisse zu bestätigen. In Bezug auf direkte Aktivitätsassays wurden bisher eine Reihe von Assays beschrieben, darunter TLC 9,20,23 und HPLC 9,21, die Substraterschöpfung und Produktbildung genau nachweisen. Darüber hinaus könnte der b4NPP-Assay21, der ebenfalls einen hohen Durchsatz aufweist, zum Testen potenzieller Inhibitoren verwendet werden. Es ist jedoch nicht ideal, Substrate oder allosterische Aktivatoren zu testen. Biophysikalische Assays, wie z. B. die dynamische Differenzfluorimetrie (DSF), über die wir bereits mit SAMHD118 berichtet haben, können ebenfalls besonders leistungsfähig sein, um Liganden zu identifizieren und zu charakterisieren. Eine weitere Einschränkung des Assays, insbesondere wie im Aufbau hier zur Identifizierung von Substraten und Aktivatoren gezeigt, ist die Verwendung des nicht-hydrolysierbaren dGTP-Analogons dGTPαS als AS1- und AS2-Aktivator. Während dies die Aktivierung von SAMHD1 ohne beobachtbare Aktivität im Assay ermöglicht, ist dGTPαS ein kompetitiver Inhibitor von SAMHD1, und daher wird die Verwendung hoher Konzentrationen das Enzym inaktivieren. Mit dem Fortschreiten unseres Verständnisses von SAMHD1 könnten zukünftige Studien Moleküle verwenden, die ausschließlich jede Stelle von SAMHD1 besetzen, wodurch dieses potenzielle Problem negiert wird.
Wie wir hier gezeigt haben, ist diese Methode vielseitig einsetzbar und kann zur Beantwortung einer Reihe von biochemischen Fragestellungen eingesetzt werden. Wir haben zwei Variationen dieses Assays beschrieben, eine für die Identifizierung von allosterischen Regulatoren und Substraten von SAMHD1 und eine andere für die Charakterisierung von Inhibitoren, aber es können weitere Anpassungen vorgenommen werden. In Bezug auf potentielle Inhibitoren eignet sich dieser Assay, der auf Mikrotiterplatten basiert, gut für nachgelagerte Studien zum Wirkmechanismus39,40. In ähnlicher Weise kann diese Technik zur weiteren Charakterisierung von Substraten und allosterischen Regulatoren verwendet werden, um kinetische Parameter der Katalyse zu bestimmen, wie wir es für den aktiven Metaboliten von Cytarabin und Clofarabin durchgeführthaben 7. Ein Nachteil ist jedoch, dass es sich bei dem hier berichteten enzymgekoppelten Assay um einen Endpunkt-Assay handelt, so dass ein kontinuierlicher Assay, obwohl er gut für das Screening geeignet ist, für einige mechanistische Studien besser geeignet wäre. Arnold et al. berichteten über einen kontinuierlichen enzymgekoppelten Assay, der den Biosensor MDCC-PBP6 verwendet, der auf der Verwendung des periplasmatischen Phosphatbindungsproteins (PBP) beruht, das mit Cumarinmaleimid (MDCC)-Fluorophor markiert ist und an eine freie Phosphatgruppe binden kann. MDCC-PBP ist sehr empfindlich und ermöglicht die Quantifizierung sehr niedriger Phosphatkonzentrationen, wobei die Reaktionszeit des Sensors im Millisekunden- bis Sekundenbereich liegt.
SAMHD1 spielt eine Reihe wichtiger Funktionen für die menschliche Gesundheit und Krankheit2 , von denen viele mit seiner zentralen Rolle bei der Aufrechterhaltung des intrazellulären dNTP-Spiegels in Verbindung gebracht werdenkönnten 1. Daher wäre die Identifizierung einer hochwertigen chemischen Sonde in Bezug auf die dNTPase-Aktivität von SAMHD1 ein leistungsfähiges Werkzeug zur Definition dieser Verbindungen, und der hier beschriebene enzymgekoppelte Assay könnte leicht zur Identifizierung solcher Sonden eingesetzt werden. Darüber hinaus sind nukleosidbasierte Arzneimittel, von denen viele durch SAMHD1 moduliert werden, eine vielfältige und wichtige Gruppe von therapeutischen41; Chemische Sonden könnten im klinischen Umfeld zu Medikamenten weiterentwickelt werden, die auf SAMHD1 abzielen, mit dem Ziel, die Wirksamkeit dieser Therapien zu erhöhen. Es ist auch wichtig, das volle Ausmaß der Wechselwirkung dieser nukleosidbasierten Verbindungen mit SAMHD1 zu verstehen, eine Frage, die auch mit diesem enzymgekoppelten Assay beantwortet werden kann. Zusammenfassend ist der hier beschriebene enzymgekoppelte SAMHD1-Aktivitätsassay ein kostengünstiger, vielseitiger Hochdurchsatz-Assay, der verwendet werden kann, um unser Verständnis dieses wichtigen Enzyms zu erweitern.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Thomas Lundbäck und den Mitarbeitern des Labors von Thomas Helleday für Rat und Unterstützung. Ein Teil dieser Arbeit wurde von der Protein Science Facility am Karolinska Institutet/SciLifeLab (http://ki.se/psf) ermöglicht, und wir danken dem National Cancer Institute (NCI), der Division of Cancer Treatment and Diagnosis (DCTD) und dem Developmental Therapeutics Program (DTP) (http://dtp.cancer.gov) für die Bereitstellung eines Wirkstoffs. Die Finanzierung erfolgte durch Zuschüsse, die S.G.R. vom Schwedischen Forschungsrat (2018-02114), der Schwedischen Krebsgesellschaft (19-0056-JIA, 20-0879-PJ), dem Schwedischen Kinderkrebsfonds (PR2019-0014) und dem Karolinska Institutet gewährt wurden.
2'-deoxyadenosine-5'-triphosphate (dATP) | Jena bioscience | NU-1001 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
2'-deoxycytidine-5'-triphosphate (dCTP) | Jena bioscience | NU-1002 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
2'-Deoxyguanosine-5'-(α-thio)-triphosphate (dGTPαS) | Jena bioscience | NU-424 | Non-hydrolyzable dGTP analogue for SAMHD1 activator/substrate assay |
2'-deoxyguanosine-5'-triphosphate (dGTP) | GE Healthcare | 27-1870-04 | SAMHD1 allosteric activator and substrate used in inhibition assay and activator/substrate assay |
2'-Deoxythymidine-5'-[(α,β)-imido]triphosphate (dTMPNPP) | Jena bioscience | NU-907-1 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
2'-deoxythymidine-5'-triphosphate (dTTP) | Jena bioscience | NU-1004 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
2'Deoxyguanosine mohohydrate (dGuo) | Sigma-Aldrich | D0901 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
384 well clear flat-bottom microplate | Thermo Fisher Scientific | 262160 | Assay plate |
96 well clear U-bottom polypropylene microplate | Thermo Fisher Scientific | 267245 | Compound dilution plate |
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A1343 | Reagent required for malachite green working reagent |
ara-Cytidine-5'-triphosphate (ara-CTP) | Jena bioscience | NU-1170 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
Clofarabine-5'-triphosphate (Cl-F-ara-ATP) | Jena bioscience | NU-874 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | VWR | 23486.297 | Solvent |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma-Aldrich | E5134 | EDTA stop solution component |
Gemcitabine-5'-triphosphate (dF-dCTP) | Jena bioscience | NU-1607 | Compound tested in SAMHD1 activator/substrate assay |
GraphPad Prism | GraphPad Software | Prism 8 | Data analysis and visualisation |
Guanosine 5′-triphosphate (GTP) sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | G8877 | Allosteric activator for SAMHD1 activator/substrate assay |
His-tagged E. coli inorganic pyrophosphatase (PPase) | Generated in house using Protein Science Facility, Karolinska Institutet | – | Recombinant PPase protein, hydrolises inorganic triphosphate and pyrophosphate to orthophosphate so it can form complex with malachite green |
His-tagged human SAMHD1 | Generated in house using Protein Science Facility, Karolinska Institutet | – | Recombinant SAMHD1 protein, hydrolizes dNTPs into its corresponding nucleoside and inorganic triphosphate |
Hydroxyurea | Sigma-Aldrich | H8627 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
Lomofungin | National Cancer Institute (NCI)/Division of Cancer Treatment and Diagnosis (DCTD)/Developmental Therapeutics Program (DTP) | NSC106995 | Compound tested in SAMHD1 inhibition assay |
Magnesium Chloride hexahydrate (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M2670 | SAMHD1 reaction buffer component |
Malachite green Carbinol hydrochloride | Sigma-Aldrich | 213020 | Malachite green stock component |
Microplate Reader | Hidex | Hidex Sense Microplate reader | Data acquisition, absorption read at 630 nm wavelength |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | 31434 | SAMHD1 reaction buffer component |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | 567530 | SAMHD1 reaction buffer component |
Sodium phosphate (Na3PO4) | Sigma-Aldrich | 342483 | Required for phosphate standard curve |
Sulphuric acid 95-97% | Sigma-Aldrich | 84720 | Malachite green stock component |
Tris-Acetate salt | Sigma-Aldrich | T1258 | SAMHD1 reaction buffer component |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma-Aldrich | C4706 | SAMHD1 reaction buffer component |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | SAMHD1 reaction buffer and malachite green working reagent component |