JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Türkçe

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biochemistry

Grenoble'daki EMBL HTX Tesisinde Otomatik Kristalografi Boru Hatları

Published: June 05, 2021
doi:
10.3791/62491
, , , , , , , , , ,
1European Molecular Biology Laboratory, 2ALPX S.A.S., 3Institut de Biologie Structurale

Summary

Burada, EMBL Grenoble’daki HTX Laboratuvarı’nda KristalDirekt teknolojisine dayalı proteinden yapıya, hızlı ligand-protein kompleksi analizi ve büyük ölçekli parça taraması için otomatik makromoleküler kristalografi boru hatlarının nasıl kullanılacağını açıklıyoruz.

Abstract

EMBL Grenoble, dünya çapındaki kullanıcılara yüksek verimli kristalografi hizmetleri sunan büyük ölçekli bir kullanıcı tesisi olan Yüksek Verimli Kristalizasyon Laboratuvarı’nı (HTX Lab) işletmektedir. HTX laboratuvarı makromoleküler kristalografide yeni yöntemlerin geliştirilmesine güçlü bir şekilde odaklanmıştır. Yüksek verimli kristalizasyon platformu, tam otomatik kristal montajı ve kriyokooling için CrystalDirect teknolojisi ve CRIMS yazılımı sayesinde, makromoleküler kristalografi için internet üzerinden uzaktan çalıştırılabilen tam otomatik boru hatları geliştirdik. Bunlar arasında yeni yapıların belirlenmesi için proteinden yapıya boru hattı, tıbbi kimyayı desteklemek için protein-ligand komplekslerinin hızlı karakterizasyonu için bir boru hattı ve 1000’den fazla parçadan oluşan kütüphanelerin değerlendirilmesini sağlayan büyük ölçekli, otomatik parça tarama boru hattı bulunmaktadır. Burada bu kaynaklara nasıl erişılacağını ve kullanılacağını açıklıyoruz.

Introduction

Otomasyon, kristalizasyondan kırınım veri toplama ve işleme 1 ,2,3,4,5,6,7,8,9, örnek montajı için bir dizi teknoloji dahil olmak üzere makromoleküler kristalografi deneysel sürecinin tüm adımlarında tanıtıldı 10,11,12 ,13,14,15,16,17. Bu sadece kristalografik yapıların elde edildiği hızı hızlandırmakla kalmadı, aynı zamanda yapı güdümlü ilaç tasarımı 18 ,19, 20,21,22,23,24gibi uygulamaları kolaylaştırmaya katkıda bulundu. Bu yazıda Grenoble’daki HTX laboratuvarında bulunan otomatik kristalografi boru hatlarının bazı yönlerini ve temel teknolojileri açıklıyoruz.

EMBL Grenoble’daki HTX laboratuvarı, Avrupa’da kristalizasyon taraması için en büyük akademik tesislerden biridir. Avrupa Foton ve Nötron (EPN) kampüsünde, dünyanın en parlak X-ışını ışınlarından bazılarını üreten Avrupa Senkrotron Radyasyon Tesisi (ESRF) ve yüksek akı nötron ışınları sağlayan Institut Laue Langevin (ILL) ile birlikte yer almaktadır. HTX laboratuvarı, 2003 yılında faaliyete başladığından bu yana 800’den fazla bilim insanına hizmet vermiş ve yılda 1000’den fazla numuneyi işlemeyi sağlamıştır. HTX laboratuvarı, makromoleküler kristalografide örnek değerlendirme ve kalite kontrol25, 26 ve CrystalDirect teknolojisi dahil olmak üzere yeni yöntemlerin geliştirilmesine güçlü bir şekilde odaklanarak tam otomatik kristal montajı ve işlenmesini sağlar15,16,17. HTX laboratuvarı ayrıca, kristalizasyon ve senkrotron veri toplama tesisleri arasında otomatik iletişim sağlayan ve saf proteinden kırınım verilerine kadar tüm örnek döngüsü boyunca kesintisiz bilgi akışı sağlayan web tabanlı bir laboratuvar bilgi sistemi olan Kristalografik Bilgi Yönetim Sistemi’ni (CRIMS) geliştirdi. HTX tesisinin kapasiteleri, CrystalDirect teknolojisi ve CRIMS yazılımının kombinasyonuyla, kristalizasyon taraması, kristal optimizasyonu, otomatik kristal toplama işleme ve kriyosooling ve X-ray veri toplamayı birden fazla senkrotronda bir web tarayıcısı üzerinden uzaktan çalıştırılabilen tek ve sürekli bir iş akışına entegre eden tam otomatik proteinden yapıya boru hatları geliştirdik. Bu boru hatları, yeni yapıların hızlı bir şekilde belirlenmesini, protein-ligand komplekslerinin ve X-ışını kristalografisi ile büyük ölçekli bileşik ve parça taramasının karakterizeini desteklemek için uygulanabilir.

HTX laboratuvarı, bir nonvolume kristalizasyon robotu (hem çözünür hem de membran proteinlerinin kristalleşmesini sağlayan bir LCP modülü dahil), kristal çiftlikleri (5 °C ve 20 °C’de), kristalizasyon ekranları hazırlamak için iki robotik sıvı taşıma istasyonu ve çalışma döngüsü başına 400’e kadar donmuş numune pimi üretme ve depolama kapasitesine sahip iki otomatik CrystalDirect kristal biçerdöver ile donatılmıştır. Bilim adamları, numunelerini daha sonra HTX laboratuvarındaki özel teknisyenler tarafından işlenen ekspres kurye ile tesise gönderirler. Bilim adamları, CRIMS sistemi tarafından sağlanan bir web arayüzü aracılığıyla kristalizasyon tarama ve optimizasyon deneylerini uzaktan tasarlayabilirler. Bu arayüz sayesinde, tesiste bulunan çok çeşitli parametreler ve deneysel protokoller arasından seçim yapabilir ve özel numune gereksinimlerine uygun olabilirler. Tüm deneysel parametrelerle birlikte sonuçlar CRIMS aracılığıyla gerçek zamanlı olarak kullanıcılara sunulur. Alınan tüm numuneler, numunenin kristalleşme olasılığını tahmin etmeyi sağlayan özel olarak geliştirilmiş bir yöntemle test edilir25,26,27. Bu tahlil sonuçlarına dayanarak, kullanıcılara optimum kuluçka sıcaklığı ve olası örnek optimizasyon deneyleri ile ilgili özel önerilerde bulunulmaktadır. Kristalizasyon deneyleri kurulduktan sonra, bilim adamı web üzerinden farklı zaman noktalarında toplanan kristalizasyon görüntülerine bakarak sonuçları değerlendirebilir. X-ışını kırınım deneyleri için uygun kristaller tanımlandığında, bilim adamları daha sonra CrystalDirect robotu tarafından yürütülecek bir kristal montaj planı oluşturmak için özel bir arayüz kullanabilirler.

CrystalDirect teknolojisi, kristalizasyon ve veri toplama15, 16,17arasında var olan otomasyon açığını kapatmayı destekleyen kırınım uyumlu kristal numuneleri monte etmek ve kriyo-serin kristal numuneleri monte etmek için modifiye buhar difüzyon kristalizasyon mikro plakası ve lazer ışını kullanımına dayanmaktadır. Kısaca, kristaller modifiye buhar difüzyon plakası olan CrystalDirect mikro plakasında yetiştirilir. Kristaller göründüğünde, CrystalDirect hasat robotu, kristali içeren bir film parçasını çıkarmak için otomatik olarak bir lazer ışını uygular, standart bir kırınım veri toplama pimine tutturur ve bir azot gazı akışında kriyo-soğutur (bkz. Zander ve ark. 2016 ve https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8). Bu teknoloji, manuel veya yarı otomatik kristal montaj protokollerine göre bir dizi ek avantaja sahiptir. Örneğin, kristallerin boyutu ve şekli bir sorun değildir, bu da büyük kristallerin veya mikrokristallerin hasatını eşit derecede kolaylaştırır, teknolojinin çalıştığı özel yol nedeniyle kriyo koruyucuların kullanımından kaçınmak genellikle mümkündür (bkz. referans 17, Zander ve ark.), X-ışını kırınım analizini çok daha basit hale getirir. Lazer ışını, örneğin kristaller kümeler üzerinde büyüdüğünde veya epitaksiyel büyüme gösterdiğinde bir numunenin en iyi kısımlarını seçmek için cerrahi bir araç olarak da kullanılabilir. CrystalDirect teknolojisi, otomatik ıslatma deneyleri17için de kullanılabilir. Çözeltilerin küçük moleküllerle veya diğer kimyasallarla kristallere teslimi. Böylece tam otomatik, büyük ölçekli bileşik ve parça taramasını desteklemeyi sağlar. Kristaller, CrystalDirect robotu tarafından hasat edildikten ve kriyosoole edildikten sonra, dünyadaki çoğu senkron makromoleküler kristalografi kiriş çizgisiyle uyumlu SPINE veya Unipuck paklarına aktarılır. Sistem, tam otonom bir şekilde 400 pime kadar (kriyojenik depolama Dewar kapasitesi) hasat edebilir. CRIMS, işlem sırasında biçerdöver robotu ile iletişim kurar ve kristal numunelerin (paklar ve pimler) otomatik olarak izlenmesini sağlar. Pucks, örnek yönetimini kolaylaştırmak için hem barkodlar hem de RFID etiketleri ile işaretlenmiştir21,28.

CRIMS, Avrupa ve dünyadaki birçok senkrotronda X-ray veri toplama yönetimini ve işlenmesini destekleyen ISPyB sistemi ile otomatik iletişimi destekleyen bir uygulama programı arabirimi (API) sağlar29. Otomatik kristal hasadı tamamlandıktan sonra, bilim adamları kristal örnekleri (paklar) seçebilir ve ESRF (Grenoble, Fransa)7,8,9 veya Petra III senkrotronlarında (Hamburg, Almanya)18,19’damakromoleküler kristalografi kiriş hatları için örnek gönderiler oluşturabilirler. CRIMS, seçilen beamline örneklerine karşılık gelen verileri önceden seçilmiş veri toplama parametreleriyle birlikte senkrotron bilgi sistemine aktarır. Numuneler seçilen senkrotron ışın hattına ulaştığında, X-ışını veri toplama manuel olarak, uzaktan ışın hattı çalışmasıyla veya tam otomatik bir şekilde (yani, EMBL ESRF Eklem Yapısal Biyoloji Grubu (JSBG) tarafından işletilen ESRF8’in MASSIF-1 kiriş hattında) gerçekleştirilir. Veri toplamadan sonra CRIMS, senkrotron veri işleme sistemleri tarafından gerçekleştirilen ilk veri işleme sonuçlarıyla birlikte veri toplama sonuçları hakkında otomatik olarak bilgi alır ve uygun bir kullanıcı arayüzü aracılığıyla bilim adamının beğenisine sunar.

HTX laboratuvarı bu otomatik boru hatlarını üç farklı uygulamayı, yeni yapıların hızlı belirlenmesini, protein-ligand komplekslerinin hızlı karakterizasyonunu ve büyük ölçekli bileşik ve parça taramasını desteklemek için uygular. Aşağıda bunların nasıl kullanılacağını ve kullanılacağını açıklıyoruz.

Protocol

NOT: Dünya çapındaki bilim insanları için bu boru hatlarına fonlu erişim, bir dizi finansman programı aracılığıyla desteklenmektedir. Bu makalenin yazıldığı sırada erişim başvuruları, Avrupa Komisyonu’nun Horizon2020 programı veya INSTRUCT-Eric (https://instruct-eric.eu/) tarafından finanse edilen çevirisel yapısal biyoloji 20’yi teşvik etmek için bir Avrupa tesis ağı olan iNEXT Discovery programı (https://inext-discovery.eu) aracılığıyla kabul edilmektedir. Belirli bir zamanda finanse edilen erişim için geçerli modaliteler ve rotalar için ilgili yazarla iletişime geçin. Bu protokol, proteinden yapıya işlem hattının çalışmasını açıklar ve diğer iki işlem hattının özellikleri aşağıdaki bölümde tartışılırken tüm işlem hatlarımızda ortak olan adımları içerir. Buradaki talimatlar CRIMS V4.0’a bakın. 1. Yüksek Verimli Kristalizasyon Laboratuvarı Başlamadan önce, CRIMS sistem https://htxlab.embl.fr/#/ aracılığıyla HTX laboratuvarına kayıt isteyin. Kullanıcı kimlik bilgileri, tüm deneysel tasarım ve değerlendirme arabirimlerine uzaktan erişim sağlar. Crims’e bir web gezgini aracılığıyla giriş yapın (Firefox, Chrome ve Safari desteklenir). CRIMs web sunucusu, üçüncü tarafların web üzerinden seyahat ederken verilere erişmesini önlemek için şifrelenir. CRIMS’e girdikten sonra, taramanın solundaki bir dizi menü örnekleri yönetmeye ve oluşturmaya, kristalizasyon deneyleri istemeye, plakaları yönetmeye ve görselleştirmeye vb. https://medias01-web.embl.de/Mediasite/Showcase/embl/Channel/a2168bcaa36b4564851663e5b69594014d’da bir dizi video eğitimi mevcuttur.NOT: Kurye ile numune gönderen kullanıcıların, varışta gecikmeden işlenebilmelerini sağlamak için numuneyi göndermeden önce örnekleri ve istenen kristalizasyon deneylerini CRIMS üzerinden kaydetmeleri gerekir. Lütfen, gönderi bilgilerini htx@embl.fr gönderin. Crims ‘e (https://htxlab.embl.fr) bir web tarayıcısıyla giriş yapın ve Örnekler Menüsü’nü tıklatın. Bu, proje ve örnek yönetim araçlarıyla bir arabirim açacaktır. Yeni Örnek düğmesine tıklayın ve istenen bilgileri sağlayın. CRIMS, örneklerin farklı projeler, hedefler ve yapılar altında düzenlenmesini sağlar. Örneği varolanlara atayın veya bu noktada yenilerini oluşturun. İstenen bilgiler girildikten sonra Kaydet ve İstekTe Bulun ‘atıklayın. Kristalizasyon protokolünü, kullanılacak kristalizasyon ekranlarını, kuluçka sıcaklığını ve deneyler için istenen tarihi seçin. HTX laboratuvar operatörlerinin bilmesi için önemli olan örnekler hakkında endikasyonlar sağlamak için açıklama alanlarını kullanın. Özel ekranlar da seçilebilir (aşağıya bakın). Kristalizasyon talebi gönderildikten sonra HTX Lab Team tarafından doğrulanacak ve deneylerin planlanması hakkındaki onay e-posta yoluyla gönderilecektir. Örnek gönderi için gereken saatlerle uyumlu deneme tarihlerini seçtiğinizden emin olun. Numuneler HTX laboratuvarındaki tesis operatörlerine ulaştığında deneyleri istendikleri gibi gerçekleştirecektir. Kristalizasyon deneyleri kurulduktan sonra, onay e-posta yoluyla gönderilecek ve kristalizasyon tepsileri otomatik görüntüleyicilere aktarılacaktır. CRIMS tüm deneysel parametrelere erişim sağlar ve yeni görüntüleme oturumlarını otomatik olarak izler. Yeni görüntüler kullanılabilir olduğunda e-posta bildirimleri otomatik olarak gönderilir. Tesiste geliştirilen bir protokole dayanan termofluor bazlı30 örnek kalite değerlendirme deneyi25,26 bu noktada her numune ile gerçekleştirilmekte dirilmekte diriltilmektedir ve CRIMS üzerinden temin edilebilecektir. Kristalizasyon deneylerinin görüntüleri ve örnek kalite değerlendirmesi sonuçları, kristalizasyon tepsileri kurulduktan kısa bir süre sonra CRIMS’te mevcut olacaktır. Thermofluor menüsüne tıklayın ve örnek kalite değerlendirme deneyinin sonuçlarını görmek için örneğe gidin. Kristalizasyon plakalarındaki görüntüleri görmek için Plakalar menüsüne tıklayın. Örneğe gidin ve son görüntüleme oturumunu görmek için Görünüm’ü veya farklı bir görüntüleme oturumu seçmek için + (genişlet) simgesini tıklatın. Bir dizi araç, örnekleri kolayca bulmaya ve gezinmeye yardımcı oluyor. Örneğin, ekranların üst kısmındaki bir proje kutusunu tıklatarak bu proje için örnekler filtrelenir ve tablo sütunlarının çoğu için arama işlevleri kullanılabilir. Kristalizasyon denemelerinin sonuçlarını değerlendirmeye ve puanlamaya yardımcı olmak için plaka Görünümü arayüzünü kullanın. Kristalizasyon plakalarının farklı kuyularında gezinmeye, görüntü türlerini seçmeye (örneğin, Vis, UV), örneğin görüntü çözünürlüğünü veya kayıt puanlarını seçmeye izin verir. Bu arayüz ayrıca kristalizasyon çözümlerinin bileşimi de dahil olmak üzere kristalizasyon deneyleri için kullanılan tüm deneysel parametreleri sağlar. İlk taramada tanımlanan birincil isabet koşullarına göre kristal optimizasyon ekranları tasarlamak için İyileştirme menüsüne tıklayın. Kimyasallar ve Stok Çözümleri altmenleri, kristalizasyon stok çözümlerini kaydetmeye ve yönetmeye izin verir. Ekranlar alt menüsü, kendi optimizasyonunuzu veya özel ekranlarınızı tasarlamak için bir arayüze erişim sağlar. Deneysel tasarıma en uygun plaka tipini, stok çözümlerini veya degrade konfigürasyonlarını seçin. CRIMS’den, ekranları otomatik olarak plakaya pipetlemek veya manuel çalışma için hacimleri olan yazdırılabilir bir belge çıkarmak için Formulator Robotu (Formulatrix) ile doğrudan uyumlu bir dosyanın çıktısını almak mümkündür. Kristal optimizasyon deneyleri gerçekleştirmek için 1.2-1.8 adımlarını yineleme yapın. X-ışını kırınım deneyleri için uygun kristaller belirlendikten sonra, plaka Görünümü arayüzüne gidin ve doğru kristalizasyon düşüşüne karşılık gelen görüntüyü seçin. Önceden saklanan puanlar bunu kolayca yapmanıza yardımcı olacaktır. CrystalDirect ile donatılamamış bir tesiste CRIMS kullanıyorsanız, CrystalDirect biçerdöver robotu için otomatik kristal hasat planını kaydetmek için Kristal Hasat’a veya geleneksel manuel kristal montajı için Manuel Hasat’a tıklayın. Her iki arayüz de kristal hasat sürecinde kullanıcıya rehberlik edecektir. CRIMS, hasat edilen kristallerin yerini otomatik olarak SPINE veya Unipucks21’ekaydeder ve saklar. CRIMS’de Kristal Yöneticisi menüsünü seçin. Dondurulmuş örnekleri incelemek için Hasat Kristalleri alt menüsüne tıklayın. CrystalDirect biçerdöveri kullanırken, hasat edilen kristallerle pimlerin görüntüleri de dahil olmak üzere hasat işleminin görüntüleri sunulur. ESRF veya Petra III senkrotronlarına bağlanmak ve X-ışını kırınım analizi için örnek gönderiler oluşturmak için Gönderiler menüsünü seçin. Gönderi Oluştur düğmesine tıklayın ve kullanmak istediğiniz senkrotron’u ve çanta numarasını seçin (senkrotrondaki çanta şifresi burada gereklidir). Bir sonraki arayüz serisi, gönderiye dahil edilecek pukcs’ları seçmek için kullanılır. Sistem, veri toplamayı desteklemek ve MASSIF-1 gibi otomatik kiriş hatları için veri toplama parametrelerini belirlemek için yorum sağlamayı mümkün kılar. Veri toplama ESRF veya Petra III HTX laboratuvarında gerçekleştiriliyorsa, operatörler örnekleri kiriş çizgisine aktaracak, diğer senkrotronlarda veri toplama işlemi kullanıcının kendi pahasına yapılacaktır. Senkrotrona seyahat ederek, uzaktan ışın hattı çalışmasıyla veya MASSIF-1’de veri toplamak mümkündür. İkinci durumda, veri toplama işlemi tamamen otomatiktir. Senkrotronda, ISPyB29’daki belirli arabirimler, kullanıcıların CRIMS tarafından gönderilen bilgileri kurtarmasına ve örnek diskleri onunla ilişkilendirmesine olanak sağlar, böylece veri toplama sonuçları otomatik olarak izlenir. Burada açıklanan deneyler için, senkrotronlarda veri toplama tipik olarak MXcube31 yazılımı ile gerçekleştirilirken, veri işleme ve yapı iyileştirmesi atuoPROC32, Staraninso 33 , BUSTER33, Pipedream32,33ve Coot35ile gerçekleştirildi. Veri toplama deneyleri yapıldıktan sonra CRIMS, ISPyB29 sisteminden senkrotrondaki ilk veri işleme sonuçlarıyla birlikte özet bilgileri alır. CRIMS Crystal Manager menüsüne gidin ve Kristal Kırınım Verileri alt menüsüne tıklayın. Kırınım verisi toplama ile ilgili tüm bilgiler ve meta veriler mevcuttur. İşlenmiş verileri senkrotrondan ve ham kırınım görüntülerinden indirmek de mümkündür. Birden çok veri koleksiyonunu görüntüleyin veya belirli veri kümelerini seçin. Örnek yönetim araçları, belirli proje yapıları için örneklerde gezinmeyi ve seçmeyi mümkün klar.NOT: Bu işlem hattı, saf proteinden X-ışını kırınım sonuçlarına kadar internet üzerinden tam otomatik çalışma sağlar ve aynı anda bir veya birden fazla örnekle çalıştırılabilir. Yapısal biyolojide farklı bağlam ve proje türlerine uygulanabilir.

Representative Results

Yukarıda açıklanan otomatik kristalografi boru hattı, çok sayıda iç ve dış projeyi olağanüstü bir başarıyla desteklemek için uygulanmıştır. Djinović-Carugo ve Max Perutz Laboratuvarları’ndan (Viyana) iş arkadaşları, bakteriyel bir patojenin büyümesi için gerekli olan dipeptidyl peptidazın yapısal ve fonksiyonel analizine odaklanan projeyi içerir. Kristalizasyon taraması, kırınım değerlendirmesi, kristal optimizasyonu ve X-ışını veri toplama döngülerinin (bu proje için 8’e kadar yineleme) hızlı bir şekilde art arda gelmesi, proteinin üç farklı konformasyonel durum için yapısal modellerin sadece birkaç hafta içinde elde edilmesine olanak sağladı ve bu da bu protein sınıfının işlevi hakkında önemli mekanistik anlayış sağladı36 (bkz. Şekil 1). Başka bir örnek, hücre kaderi düzenlemesinde yer alan SMAD3 ve SMAD4 transkripsiyon faktörleri için yeni DNA bağlama motiflerini tanımlamak için biyoinformatik araçları ve yapısal yaklaşımları birleştiren Macias ve Biyomedikal Araştırma Enstitüsü’nden (IRB, Barselona) iş arkadaşlarıdır. Bu çalışma, farklı DNA bağlama motifleri 37,38ile karmaşık olarak 6 yüksek çözünürlüklü SMAD3 ve4 yapısı üretmiş ve bu transkripsiyon faktörlerinin farklı biyolojik bağlamlarda işlevlerinin yorumlanması için anahtar olan çeşitli DNA dizilerini tanımak ve bağlamak için şimdiye kadar şüphe duyulmamış bir kapasitesini ortaya çıkarmıştır. Bu teknolojiler, ilaç ve biyoteknoloji şirketlerindeki araştırma gruplarından ilaç tasarım projeleri bağlamında tescilli araştırmaları desteklemek için de uygulanmıştır. Örneğin, bu boru hatlarının katkıda bulunduğu hızlılık sayesinde, birden fazla ligand hedef kompleksinin yapısal analizi birkaç gün içinde elde edilebilir, bu da ilaç geliştirme bağlamında ardışık tur tıbbi kimya optimizasyonunu desteklemek için büyük bir değere sahip. Son olarak bu altyapıyı büyük ölçekli X-ışını tabanlı parça taraması için de uyguladık39. Şekil 1: Otomatik Kristalografi Boru Hattı. CrystalDirect teknolojisi ve CRIMS yazılımı dahil olmak üzere EMBL HTX laboratuvarının ESRF’deki MASSIF-1 kiriş hattı ile entegre çalışması ve CRIMS ve ISPyB yazılımı arasındaki otomatik iletişim, kristalizasyon tarama ve optimizasyonunu, otomatik kristal hasadını ve kriyo soğutmayı ve otomatik veri toplama ve işlemeyi entegre eden tam otomatik, uzaktan kontrollü proteinden yapıya boru hattını desteklemeyi sağlar. Yapısal modeller, bu işlem hattı36uygulanarak rekor sürede tanımlanan patojenik bir bakteriden bir proteazın üç farklı konformasyon durumlarına karşılık gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Burada açıklanan otomatik kristalografi boru hatları, farklı finansman programları aracılığıyla dünya çapındaki araştırmacılar tarafından kullanılabilir. Şu anda, kristalizasyon deneyleri ve CrystalDirect teknolojisi için finanse edilen erişim iNEXT Discovery programına ve INSTRUCT-ERIC’e uygulanarak elde edilebilirken, ESRF’deki makromoleküler kristalografi kiriş hatlarına erişim ESRF kullanıcı erişim programı aracılığıyla desteklenmektedir. Bu yaklaşım, kristal büyümesi ve ölçümü arasındaki gecikmeyi en aza indirerek, protein üretiminin ve kristalizasyon koşullarının kırınım tabanlı optimizasyonunu gerektiren çok zorlu projelerin ilerlemesini hızlandırır ve bilim insanlarını kristalizasyon, kristal işleme ve kiriş çizgisi çalışması ile ilişkili karmaşık işlemlerden kurtarır ve kristalografiyi uzman olmayan gruplar için daha erişilebilir hale getirir. Ayrıca kristalizasyon katkı maddelerinin, fazlama maddelerinin hızlı keşfi veya ortak kristalizasyon deneyleri yoluyla bileşik tarama için de kullanılabilir. Çoğu kristalografi projesi bu yaklaşımdan potansiyel olarak yararlanabilse de, bazı örnekler otomasyona veya burada sunulan boru hatlarına uygun olmayan özel protokoller gerektirebilir, örneğin mikroakışkan sistemler veya son derece özel kristalizasyon cihazları veya son derece özel kristalizasyon cihazları veya son derece labile olan ve sevkiyata tolerans göstermeyen numuneler gerektirenler.

CrystalDirect teknolojisi ayrıca küçük molekül hedef komplekslerinin karakterizasyonu için otomatik kristal ıslatma17 sağlar. Bunun için, hasat işleminden önce lazerle küçük bir diyafram oluşturulur ve üzerine istenen kimyasalları (yani fazlama maddelerini veya potansiyel ligandları) içeren bir çözeltinin bir damlası eklenir, böylece temas halinde girer ve kristalleşme çözeltisine yayılır ve sonunda kristalleşmeye ulaşır. Kimyasal çözeltiler suda, DMSO’da veya diğer organik çözücülerde formüle edilebilir. Belirli bir kuluçka süresinden sonra kristaller yukarıda açıklandığı gibi kırınım ile hasat edilebilir ve analiz edilebilir. Bu yaklaşım, ligand-protein komplekslerinin yapı bazlı ilaç tasarımı bağlamında hızlı karakterizasyonunun yanı sıra büyük ölçekli bileşik ve parça taramasına da uygulanmıştır. İkinci durumda, yüzlerce ila binden fazla parçaya sahip parça kitaplıkları hızla analiz edilebilir. Burada sunulmayan belirli CRIMS arayüzleri kristal ıslatma deneylerinin tasarımını ve otomatik takibini kolaylaştırırken, Global Phasing Ltd (İngiltere) tarafından geliştirilen CRIMS yazılımı ile Pipedream yazılım paketi arasındaki entegrasyon, paralel olarak yüzlerce veri kümesi üzerinde otomatik veri işleme, aşamalı, ligand tanımlama ve yapı iyileştirmesi sağlarken, veri analizi ve yorumlamasını kolaylaştırıyor32,33 . Örneğin, bu boru hattı son zamanlarda hem aktif bölgeye hem de insan Afrika tripanosomiasis neden parazitinin önemli bir enzimi olan Trypanosoma brucei farnesyl pirofosfat synthase’in birkaç allosterik bölgesine bağlayıcı parçaların tanımlanmasına uygulanmıştır.

Burada sunulan boru hatları, yapısal biyolojideki keşif hızını hızlandırmaya ve makromoleküler kristalografiyi daha fazla sayıda araştırma grubu için daha erişilebilir hale getirmeye katkıda bulunabilir. Ayrıca, büyük ölçekli bileşik ve parça taramasını kolaylaştırarak çevirisel araştırmaları teşvik etmeye ve ilaç bulma sürecini hızlandırmaya katkıda bulunabilirler, daha fazla sayıda hedefe karşı daha iyi ve daha güvenli ilaçların geliştirilmesini kolaylaştırmaya katkıda bulunabilirler.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ortak EMBL-ESRF Yapısal Biyoloji Grubu’na (JSBG) ESRF makromoleküler kiriş çizgilerinin kullanımı ve işletilmesindeki destek için teşekkür ederiz. ESRF ve Thomas Schneider’in MASSIF-1 kiriş hattında veri toplama desteği için Matthew Bowler’a ve PetraIII senkrotronunun P14’lerinde (DESY, Hamburg, Almanya) veri toplama konusunda mükemmel destek için EMBL Hamburg Ekibi’ne minnettarız. CrystalDirect biçerdöver, EMBL Grenoble’daki Enstrümantasyon Ekibi ile işbirliği içinde geliştirilmiştir. Bu proje, iNEXT (Grant No 653706) ve iNEXT Discovery (Grant No 871037) projeleri kapsamında Avrupa TopluluğuH2020 Programı’nın yanı sıra Région Auvergne-Rhône-Alpes’in Booster programı aracılığıyla finanse edilmesiyle desteklendi.

Materials

CrystalDirect harvester Arinax Automated crystal mounting and cryocooling
CrystalDirect Crystallization plate Mitegen SKU: M-XDIR-96-2 96-well crytsallization microplate
Formulator 16 Formulatrix For the autoamted preparation of crystallization screens
Mosquito crystallization Robot SPT Labtech For the preparation of crystallization experiments
Tecan Evo Liquid handling station Tecan For the preparation of crystallization solutions
Spine Pucks Mitegen SKU: M-SP-SC3-1 SPINE-compatible cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers
UniPucks Mitegen SKU: M-CP-111-021 Universal cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abola, E., Kuhn, P., Earnest, T., Stevens, R. C. Automation of X-ray crystallography. Nature Structural Biology. 7, 973-977 (2000).
  2. Banci, L., et al. First steps towards effective methods in exploiting high-throughput technologies for the determination of human protein structures of high biomedical value. Acta crystallographica. Section D, Biological. 62 (10), 1208-1217 (2006).
  3. Edwards, A. Large-scale structural biology of the human proteome. Annual Review in Biochemistry. 78, 541-568 (2009).
  4. Rupp, B., et al. The TB structural genomics consortium crystallization facility: towards automation from protein to electron density. Acta crystallographica. Section D, Biological. 58 (10), 1514-1518 (2002).
  5. Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).
  6. Cusack, S., et al. Small is beautiful: protein micro-crystallography. Nature Structural and Molecular Biology. 5, 634-637 (1998).
  7. McCarthy, A. A., et al. ID30B – a versatile beamline for macromolecular crystallography experiments at the ESRF. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 1249-1250 (2018).
  8. Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
  9. von Stetten, D., et al. ID30A-3 (MASSIF-3) – a beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam. Journal of Synchrotron Radiation. 27 (3), 844-851 (2020).
  10. Viola, R., et al. First experiences with semi-autonomous robotic harvesting of protein crystals. Journal of Structural and Functional Genomics. 12, 77-82 (2011).
  11. Khajepour, M. Y. H., et al. REACH: Robotic Equipment for Automated Crystal Harvesting using a six-axis robot arm and a micro-gripper. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69 (3), 381-387 (2013).
  12. Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. . Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69, 1297-1302 (2006).
  13. Collins, P. M. Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing. Acta crystallographica. D73, 246-255 (2017).
  14. Deller, M. C., Rupp, B. Approaches to automated protein crystal harvesting. Acta crystallographica. F70, 133-155 (2014).
  15. Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (10), 1393-1399 (2012).
  16. Márquez, J. A., Cipriani, F. CrystalDirectTM: A Novel Approach for Automated Crystal Harvesting Based on Photoablation of Thin Films. Structural Genomics. 1091, 197-203 (2014).
  17. Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
  18. Cianci, M., et al. P13, the EMBL macromolecular crystallography beamline at the low-emittance PETRA III ring for high- and low-energy phasing with variable beam focusing. Journal of Synchrotron Radiation. 24 (1), 323-332 (2017).
  19. Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).
  20. iNEXT Consortium . iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology. FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).
  21. Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
  22. Whittle, P. J., Blundell, T. L. Protein Structure-Based drug design. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 349-375 (1994).
  23. Blundell, T. L., Jhoti, H., Abell, C. High-throughput crystallography for lead discovery in drug design. Nature Reviews Drug Discovery. 1, 45-54 (2002).
  24. Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein–ligand structure determination. Acta Crystallographica. D73, 267-278 (2017).
  25. Mariaule, V., Dupeux, F., Márquez, J. A. Estimation of Crystallization Likelihood Through a Fluorimetric Thermal Stability Assay. Structural Genomics. 1091, 189-195 (2014).
  26. Dupeux, F., Röwer, M., Seroul, G., Blot, D., Márquez, J. A. A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).
  27. Dimasi, N., Dupeux, F., Marquez, J. A. Expression, crystallization and X-ray data collection from microcrystals of the extracellular domain of the human inhibitory receptor expressed on myeloid cells IREM-1. Acta Crystallographica. F63, 204-208 (2007).
  28. Hiraki, M., Matsugaki, N., Yamada, Y., Hikita, M., Yamanaka, M., Senda, T. . RFID tag system for sample tracking at structural biology beamlines. , 060074 (2019).
  29. Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
  30. Ericsson, U., et al. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
  31. Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17, 700-707 (2010).
  32. Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).
  33. Smart, O. S., et al. Exploiting structure similarity in refinement: automated NCS and target-structure restraints in BUSTER. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (4), 368-380 (2012).
  34. Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
  35. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica. D66, 486-501 (2010).
  36. Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
  37. Martin-Malpartida, P., et al. Structural basis for genome wide recognition of 5-bp GC motifs by SMAD transcription factors. Nature Communications. 8 (1), 2070 (2017).
  38. Aragón, E., et al. Structural basis for distinct roles of SMAD2 and SMAD3 in FOXH1 pioneer-directed TGF-β signaling. Genes & Development. 33 (21-22), 1506-1524 (2019).
  39. Münzker, L., et al. Fragment‐Based Discovery of Non‐bisphosphonate Binders of Trypanosoma brucei Farnesyl Pyrophosphate Synthase. ChemBioChem. 21 (21), 3096-3111 (2020).

Tags

Automated CrystallographyEMBL HTX FacilityGrenobleCrystalDirect TechnologyCRIM SoftwareCrystal Graphic Information Management SystemCrystallization ProtocolCrystallization ScreensHigh Throughput Crystallization LabAutomated ImagersCRIMSCrystallization PlatesCrystallization ExperimentsCrystal HarvestingProtein Structure DeterminationFragment ScreeningLigand Screening

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Cornaciu, I., Bourgeas, R., Hoffmann, G., Dupeux, F., Humm, A., Mariaule, V., Pica, A., Clavel, D., Seroul, G., Murphy, P., Márquez, J. A. The Automated Crystallography Pipelines at the EMBL HTX Facility in Grenoble. J. Vis. Exp. (172), e62491, doi:10.3791/62491 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image