خطوط أنابيب البلورات الآلية في مرفق EMBL HTX في غرونوبل
Summary
هنا، ونحن نصف كيفية استخدام خطوط أنابيب البلورات الجزيئية الكلية الآلي للبروتين إلى هيكل، وتحليل مجمع البروتين ليغاندي السريع وفحص جزء على نطاق واسع على أساس التكنولوجيا CrystalDirect في مختبر HTX في EMBL غرونوبل.
Abstract
تدير EMBL Grenoble مختبر تبلور الإنتاجية العالية (مختبر HTX) ، وهو مرفق مستخدم واسع النطاق يقدم خدمات عالية الإنتاجية للبلورات للمستخدمين في جميع أنحاء العالم. مختبر HTX لديه تركيز قوي في تطوير أساليب جديدة في علم البلورات الجزيئية الكلية. من خلال الجمع بين منصة تبلور عالية الإنتاجية ، وتكنولوجيا CrystalDirect لتركيب الكريستال الآلي بالكامل والتبريد وبرنامج CRIMS قمنا بتطوير خطوط أنابيب مؤتمتة بالكامل للبلورات الجزيئية الكبيرة التي يمكن تشغيلها عن بعد عبر الإنترنت. وتشمل هذه الخطوط خط أنابيب من البروتين إلى الهيكل لتحديد الهياكل الجديدة، خط أنابيب لتوصيف سريع لمجمعات البروتين ليغند لدعم الكيمياء الطبية، وعلى نطاق واسع، أنبوب فحص جزء الآلي تمكين تقييم المكتبات من أكثر من 1000 شظايا. هنا نحن وصف كيفية الوصول إلى واستخدام هذه الموارد.
Introduction
تم إدخال الأتمتة في جميع خطوات العملية التجريبية للبلورات الجزيئية الكلية ، من التبلور إلى جمع ومعالجة بيانات الحيود1،2،3، 4،5،6،7،8،9، بما في ذلك عدد من التقنيات لتركيب العينة10،11،12 ،13،14،15،16،17. هذا لم يسرع فقط وتيرة التي يتم الحصول على الهياكل البلورية ولكن ساهمت في تبسيط التطبيقات مثل هيكل تصميم المخدرات الموجهة18،19،20،21،22،23،24. في هذه المخطوطة، نصف بعض جوانب خطوط أنابيب البلورات الآلية المتاحة في مختبر HTX في غرونوبل وكذلك التقنيات الأساسية.
يعد مختبر HTX في EMBL Grenoble أحد أكبر المرافق الأكاديمية لفحص التبلور في أوروبا. ويقع في موقع مشترك في حرم فوتون ونيوترون الأوروبي (EPN) جنبا إلى جنب مع مرفق الإشعاع السنكروترون الأوروبي (ESRF)، الذي ينتج بعض من ألمع أشعة إكس في العالم ومعهد لاو لانجيفين (ILL)، الذي يوفر أشعة نيوترونية عالية التدفق. منذ بدء العمليات في عام 2003، قدم مختبر HTX خدمات لأكثر من 800 عالم ويعالج أكثر من 1000 عينة سنويا. مختبر HTX لديه تركيز قوي في تطوير أساليب جديدة في علم البلورات الجزيئية الكلية، بما في ذلك أساليب لتقييم العينات ومراقبة الجودة25،26 وتكنولوجيا CrystalDirect ، مما يتيح تركيب الكريستال المؤتمت بالكاملومعالجة 15،16،17. كما طور مختبر HTX نظام إدارة المعلومات البلورية (CRIMS)، وهو نظام معلومات مختبري على شبكة الإنترنت يوفر اتصالا آليا بين مرافق جمع البيانات التبلورية والسنكروترونية، مما يتيح تدفق المعلومات دون انقطاع على مدار دورة العينة بأكملها من البروتين النقي إلى بيانات الحيود. من خلال الجمع بين قدرات منشأة HTX ، وتكنولوجيا CrystalDirect وبرنامج CRIMS ، قمنا بتطوير خطوط أنابيب مؤتمتة بالكامل من البروتين إلى الهيكل تدمج فحص التبلور ، وتحسين الكريستال ، ومعالجة حصاد الكريستال الآلي والتبريد وجمع بيانات الأشعة السينية في synchrotrons متعددة في سير عمل واحد ومستمر يمكن تشغيله عن بعد من خلال متصفح الويب. ويمكن تطبيق خطوط الأنابيب هذه لدعم التحديد السريع للهياكل الجديدة، وتوصيف مجمعات البروتين- ليغاند، وفحص المركبات والشظايا على نطاق واسع من خلال التصوير البلوري بالأشعة السينية.
تم تجهيز مختبر HTX بروبوت تبلور غيرفولومي (بما في ذلك وحدة LCP التي تمكن من بلورة كل من البروتينات القابلة للذوبان والأغشية) ، ومزارع الكريستال (عند 5 درجات مئوية و 20 درجة مئوية) ، ومحطتين آليتين للتعامل مع السائل لإعداد شاشات التبلور ، وحصادتين بلوريتين آليتين من كريستال دايركت مع القدرة على إنتاج وتخزين ما يصل إلى 400 دبابيس عينة مجمدة لكل دورة عملية. يرسل العلماء عيناتهم إلى المنشأة عن طريق البريد السريع ، والتي يتم معالجتها بعد ذلك من قبل فنيين مخصصين في مختبر HTX. يمكن للعلماء تصميم فحص التبلور عن بعد وتجارب التحسين من خلال واجهة ويب يوفرها نظام CRIMS. ومن خلال هذه الواجهة، يمكنهم الاختيار من بين مجموعة واسعة من المعلمات والبروتوكولات التجريبية المتاحة في المرفق لتناسب متطلباتهم المحددة من العينات. يتم توفير النتائج مع جميع المعلمات التجريبية للمستخدمين في الوقت الحقيقي من خلال CRIMS. يتم فحص جميع العينات المستلمة من خلال طريقة مطورة خصيصا تمكن من تقدير احتمال تبلور العينة25و26و27. بناء على نتائج هذه التوصيات المحددة المقايسة يتم تقديمها للمستخدمين بشأن درجة حرارة الحضانة المثلى والتجارب المحتملة لتحسين العينة. بمجرد إعداد تجارب التبلور ، يمكن للعالم تقييم النتائج من خلال النظر في صور التبلور التي تم جمعها في نقاط زمنية مختلفة من خلال الويب. عندما يتم تحديد بلورات مناسبة لتجارب الحيود بالأشعة السينية، يمكن للعلماء استخدام واجهة مخصصة لوضع خطة تركيب الكريستال التي سيتم تنفيذها بعد ذلك من قبل الروبوت كريستال دايركت.
وتستند التكنولوجيا CrystalDirect على استخدام بخار تعديل نشر بلورة microplate وشعاع ليزر لتركيب والتبريد بارد عينات الكريستال في حيود متوافق يدعم سد الفجوة الأتمتة القائمة بين التبلور وجمع البيانات15،16،17. باختصار، تزرع البلورات في لوحة نشر بخار معدلة، لوحة كريستال دايركت الدقيقة. بمجرد ظهور البلورات ، يطبق روبوت الحصاد CrystalDirect شعاع ليزر تلقائيا لاستئصال قطعة فيلم تحتوي على الكريستال ، وإرفاقها بدبوس جمع بيانات الحيود القياسي ، وتبريده في تيار غاز النيتروجين (انظر Zander et al. 2016 و https://www.youtube.com/watch?v=Nk2jQ5s7Xx8). هذه التكنولوجيا لديها عدد من المزايا الإضافية على بروتوكولات تركيب الكريستال اليدوي أو شبه الآلي. على سبيل المثال ، حجم وشكل البلورات ليست مشكلة ، مما يجعل من السهل بنفس القدر حصاد بلورات كبيرة أو بلورات دقيقة ، فمن الممكن في كثير من الأحيان تجنب استخدام المواد حماية التبريد ، وذلك بسبب الطريقة الخاصة التي تعمل بها التكنولوجيا (انظر المرجع 17 ، زاندر وآخرون) ، مما يجعل تحليل حيود الأشعة السينية أكثر وضوحا. يمكن أيضا استخدام شعاع الليزر كأداة جراحية لتحديد أفضل أجزاء العينة عندما تنمو البلورات على مجموعات أو تظهر نموا فوق الضرائب على سبيل المثال. ويمكن أيضا أن تستخدم التكنولوجيا CrystalDirect لتجارب نقع الآلي17. تسليم المحاليل مع جزيئات صغيرة أو غيرها من المواد الكيميائية إلى بلورات. وبالتالي فإنه يمكن من دعم الآلي بالكامل، والفحص المركب على نطاق واسع وجزء. مرة واحدة يتم حصاد بلورات و cryocooled بواسطة الروبوت CrystalDirect، يتم نقلها إلى العمود الفقري أو الصولجانات Unipuck التي تتوافق مع معظم خطوط شعاعية البلورات الجزيئية الكلية متزامنة في جميع أنحاء العالم. يمكن للنظام حصاد ما يصل إلى 400 دبابيس (قدرة التخزين المبرد ديوار) بطريقة مستقلة تماما. تتواصل CRIMS مع روبوت الحصاد أثناء العملية وتوفر تتبعا آليا لعينات الكريستال (الصولجانات والدبابيس). يتم وضع علامة على الصولجانات مع كل من الباركود وعلامات RFID لتسهيل إدارة العينة21،28.
يوفر CRIMS واجهة برنامج تطبيق (API) تدعم الاتصالات الآلية مع نظام ISPyB لدعم إدارة ومعالجة جمع البيانات بالأشعة السينية في العديد من السنكروترونات في أوروبا والعالم29. بعد اكتمال حصاد الكريستال الآلي، يمكن للعلماء اختيار عينات الكريستال (الصولجانات) وإنشاء شحنات عينة لعوارض البلورات الجزيئية الكلية إما في ESRF (غرونوبل، فرنسا)7،8،9 أو البتراء الثالثة السنكروترونات (هامبورغ، ألمانيا)18،19. نقل البيانات الموافقة لعينات الحزم المحددة إلى نظام معلومات السنكروترون مع معلمات جمع البيانات المحددة مسبقا. وبمجرد وصول العينات إلى خط الحزم السينكروتروني المختار، يتم جمع بيانات الأشعة السينية إما يدويا، أو من خلال تشغيل خط الحزم عن بعد أو بطريقة مؤتمتة بالكامل (أي في خط الحزمة MASSIF-1 من ESRF8 الذي تديره مجموعة EMBL ESRF المشتركة للبيولوجيا الهيكلية المشتركة (JSBG)). بعد جمع البيانات يقوم CRIMS باسترداد المعلومات تلقائيا حول نتائج جمع البيانات جنبا إلى جنب مع نتائج معالجة البيانات الأولية التي تقوم بها أنظمة معالجة البيانات synchrotron ويعرضها على العالم من خلال واجهة مستخدم مريحة.
يطبق مختبر HTX خطوط الأنابيب الآلية هذه لدعم ثلاثة تطبيقات مختلفة ، والتحديد السريع للهياكل الجديدة ، والتوصيف السريع لمجمعات البروتين – ليغند وفحص المركبات والشظايا على نطاق واسع. فيما يلي وصف كيفية استخدامها وتشغيلها.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتوفر خطوط أنابيب البلورات الآلية الموصوفة هنا للباحثين في جميع أنحاء العالم من خلال برامج تمويل مختلفة. حاليا، يمكن الحصول على الوصول الممول لتجارب التبلور وتكنولوجيا CrystalDirect من خلال تطبيق برنامج اكتشاف iNEXT و INSTRUCT-ERIC، في حين يتم دعم الوصول إلى خطوط شعاعية بلورية مجهرية في ESRF من خلال برنامج وصول المستخدم ESRF. ويقلل هذا النهج من التأخير بين نمو الكريستال وقياسه، ويسرع من تقدم المشاريع الصعبة للغاية التي تتطلب التحسين القائم على الحيود لإنتاج البروتين وظروف التبلور ويحرر العلماء من العمليات المعقدة المرتبطة بالتبلور والمناولة البلورية وتشغيل الحزمة، مما يجعل علم البلورات أكثر سهولة للمجموعات غير الخبيرة. ويمكن أيضا استخدامه للاستكشاف السريع لإضافات التبلور أو عوامل التدرج أو للفحص المركب من خلال تجارب التبلور المشترك. وفي حين أن معظم مشاريع علم البلورات يمكن أن تستفيد من هذا النهج، فإن بعض العينات قد تتطلب بروتوكولات خاصة غير قابلة للأتمتة أو لخطوط الأنابيب المعروضة هنا، على سبيل المثال تلك التي تتطلب نظما ميكروفلويدية أو أجهزة تبلور متخصصة للغاية أو عينات شديدة التشبيه ولن تتسامح مع الشحن.
كما تمكن تقنية CrystalDirect من امتصاص الكريستال الآلي17 لتوصيف المجمعات الصغيرة المستهدفة بالجزيئات. لهذا، يتم إنشاء فتحة صغيرة مع الليزر قبل عملية الحصاد ويتم إضافة قطرة من محلول يحتوي على المواد الكيميائية المطلوبة (أي عوامل المراحل أو الليجاندس المحتملة) على القمة، بحيث يدخل في اتصال مع، ويوزع في حل تبلور تصل في نهاية المطاف إلى الكريستال. يمكن صياغة الحلول الكيميائية في الماء أو DMSO أو المذيبات العضوية الأخرى. بعد فترة حضانة معينة يمكن حصاد البلورات وتحليلها عن طريق الحيود كما هو موضح أعلاه. وقد طبق هذا النهج على التوصيف السريع لمجمعات البروتين الليغاندي في سياق تصميم الأدوية القائمة على الهيكل وكذلك على فحص المركبات والشظايا على نطاق واسع. في الحالة الأخيرة يمكن تحليل مكتبات مجزأة مع مئات إلى أكثر من ألف شظايا بسرعة. تسهل واجهات CRIMS المحددة غير المعروضة هنا تصميم تجارب نقع الكريستال وتتبعها آليا ، في حين أن التكامل بين برنامج CRIMS ومجموعة برامج Pipedream ، التي طورتها Global Phasing Ltd (المملكة المتحدة) تمكن من معالجة البيانات الآلية ، والتدرج ، وتحديد ligand وصقل الهيكل على مئات مجموعات البيانات بالتوازي ، وتبسيط تحليل البياناتوتفسيرها 32333 . على سبيل المثال ، تم تطبيق خط الأنابيب هذا مؤخرا لتحديد الأجزاء الملزمة للموقع النشط والعديد من المواقع الأل أوسترية في تريبانوسوما بروسي فارنيسيل بيريوسفات synthase ، وهو إنزيم رئيسي للطفيلي يسبب التريبانوسوسوميا الأفريقية البشرية.
يمكن أن تساهم خطوط الأنابيب المعروضة هنا في تسريع وتيرة الاكتشاف في البيولوجيا الهيكلية وجعل علم البلورات الجزيئية الكلية أكثر سهولة لعدد أكبر من مجموعات البحث. وعلاوة على ذلك، فإنها، بتسهيلها للفحص الواسع النطاق للمركبات والشظايا، يمكنها أن تسهم في تعزيز البحوث التحويلية والتعجيل بعملية اكتشاف المخدرات، مما يسهم في تيسير تطوير عقاقير أفضل وأكثر أمانا ضد عدد أكبر من الأهداف.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر مجموعة EMBL-ESRF المشتركة للبيولوجيا الهيكلية (JSBG) على الدعم في استخدام وتشغيل خطوط الحزم الجزيئية الكلية ESRF. نحن ممتنون لماثيو بولر لدعمه في جمع البيانات في خط الحزم MASSIF-1 من ESRF وتوماس شنايدر وفريق EMBL هامبورغ للدعم الممتاز مع جمع البيانات في P14 من السنكروترون PetraIII (DESY، هامبورغ، ألمانيا). تم تطوير حصادة CrystalDirect بالتعاون مع فريق الأجهزة في EMBL Grenoble. وقد تم دعم هذا المشروع بتمويل من برنامج الجماعة الأوروبيةH2020 في إطار مشروعي iNEXT (المنحة رقم 653706) و iNEXT Discovery (المنحة رقم 871037) وكذلك Région Auvergne-Rhône-Alpes من خلال برنامج الداعم.
Materials
| CrystalDirect harvester | Arinax | Automated crystal mounting and cryocooling | |
| CrystalDirect Crystallization plate | Mitegen | SKU: M-XDIR-96-2 | 96-well crytsallization microplate |
| Formulator 16 | Formulatrix | For the autoamted preparation of crystallization screens | |
| Mosquito crystallization Robot | SPT Labtech | For the preparation of crystallization experiments | |
| Tecan Evo Liquid handling station | Tecan | For the preparation of crystallization solutions | |
| Spine Pucks | Mitegen | SKU: M-SP-SC3-1 | SPINE-compatible cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers |
| UniPucks | Mitegen | SKU: M-CP-111-021 | Universal cryogenic pucks for automated synchrotron sample exchangers |
References
- Abola, E., Kuhn, P., Earnest, T., Stevens, R. C. Automation of X-ray crystallography. Nature Structural Biology. 7, 973-977 (2000).
- Banci, L., et al. First steps towards effective methods in exploiting high-throughput technologies for the determination of human protein structures of high biomedical value. Acta crystallographica. Section D, Biological. 62 (10), 1208-1217 (2006).
- Edwards, A. Large-scale structural biology of the human proteome. Annual Review in Biochemistry. 78, 541-568 (2009).
- Rupp, B., et al. The TB structural genomics consortium crystallization facility: towards automation from protein to electron density. Acta crystallographica. Section D, Biological. 58 (10), 1514-1518 (2002).
- Cipriani, F., et al. Automation of sample mounting for macromolecular crystallography. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 62 (10), 1251-1259 (2006).
- Cusack, S., et al. Small is beautiful: protein micro-crystallography. Nature Structural and Molecular Biology. 5, 634-637 (1998).
- McCarthy, A. A., et al. ID30B – a versatile beamline for macromolecular crystallography experiments at the ESRF. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 1249-1250 (2018).
- Bowler, M. W., et al. MASSIF-1: a beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
- von Stetten, D., et al. ID30A-3 (MASSIF-3) – a beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam. Journal of Synchrotron Radiation. 27 (3), 844-851 (2020).
- Viola, R., et al. First experiences with semi-autonomous robotic harvesting of protein crystals. Journal of Structural and Functional Genomics. 12, 77-82 (2011).
- Khajepour, M. Y. H., et al. REACH: Robotic Equipment for Automated Crystal Harvesting using a six-axis robot arm and a micro-gripper. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69 (3), 381-387 (2013).
- Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. . Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 69, 1297-1302 (2006).
- Collins, P. M. Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing. Acta crystallographica. D73, 246-255 (2017).
- Deller, M. C., Rupp, B. Approaches to automated protein crystal harvesting. Acta crystallographica. F70, 133-155 (2014).
- Cipriani, F., Röwer, M., Landret, C., Zander, U., Felisaz, F., Márquez, J. A. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (10), 1393-1399 (2012).
- Márquez, J. A., Cipriani, F. CrystalDirectTM: A Novel Approach for Automated Crystal Harvesting Based on Photoablation of Thin Films. Structural Genomics. 1091, 197-203 (2014).
- Zander, U., et al. Automated harvesting and processing of protein crystals through laser photoablation. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (4), 454-466 (2016).
- Cianci, M., et al. P13, the EMBL macromolecular crystallography beamline at the low-emittance PETRA III ring for high- and low-energy phasing with variable beam focusing. Journal of Synchrotron Radiation. 24 (1), 323-332 (2017).
- Gati, C., et al. Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation. IUCrJ. 1 (2), 87-94 (2014).
- iNEXT Consortium . iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology. FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).
- Papp, G., et al. Towards a compact and precise sample holder for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 73 (10), 829-840 (2017).
- Whittle, P. J., Blundell, T. L. Protein Structure-Based drug design. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 23, 349-375 (1994).
- Blundell, T. L., Jhoti, H., Abell, C. High-throughput crystallography for lead discovery in drug design. Nature Reviews Drug Discovery. 1, 45-54 (2002).
- Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein–ligand structure determination. Acta Crystallographica. D73, 267-278 (2017).
- Mariaule, V., Dupeux, F., Márquez, J. A. Estimation of Crystallization Likelihood Through a Fluorimetric Thermal Stability Assay. Structural Genomics. 1091, 189-195 (2014).
- Dupeux, F., Röwer, M., Seroul, G., Blot, D., Márquez, J. A. A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (11), 915-919 (2011).
- Dimasi, N., Dupeux, F., Marquez, J. A. Expression, crystallization and X-ray data collection from microcrystals of the extracellular domain of the human inhibitory receptor expressed on myeloid cells IREM-1. Acta Crystallographica. F63, 204-208 (2007).
- Hiraki, M., Matsugaki, N., Yamada, Y., Hikita, M., Yamanaka, M., Senda, T. . RFID tag system for sample tracking at structural biology beamlines. , 060074 (2019).
- Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
- Ericsson, U., et al. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Analytical Biochemistry. 357 (2), 289-298 (2006).
- Gabadinho, J., et al. MxCuBE: a synchrotron beamline control environment customized for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation. 17, 700-707 (2010).
- Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 67 (4), 293-302 (2011).
- Smart, O. S., et al. Exploiting structure similarity in refinement: automated NCS and target-structure restraints in BUSTER. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 68 (4), 368-380 (2012).
- Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica. D66, 486-501 (2010).
- Bezerra, G. A., et al. Bacterial protease uses distinct thermodynamic signatures for substrate recognition. Scientific Reports. 7 (1), 2848 (2017).
- Martin-Malpartida, P., et al. Structural basis for genome wide recognition of 5-bp GC motifs by SMAD transcription factors. Nature Communications. 8 (1), 2070 (2017).
- Aragón, E., et al. Structural basis for distinct roles of SMAD2 and SMAD3 in FOXH1 pioneer-directed TGF-β signaling. Genes & Development. 33 (21-22), 1506-1524 (2019).
- Münzker, L., et al. Fragment‐Based Discovery of Non‐bisphosphonate Binders of Trypanosoma brucei Farnesyl Pyrophosphate Synthase. ChemBioChem. 21 (21), 3096-3111 (2020).
