^RNAの1H _R1ρ緩和分散実験のサンプル調製とセットアップの実態

図2:報告されたタンデムIVTプロトコルの模式図表現(A)T7RNAPを用いた線形化プラスミドテンプレートからのタンデム転写(左)およびRNAAse Hによる連続切断を標的長RNAを達成し、キメラDNAガイド(右)で示した。(B)ウイルスT7RNAPプロモーターから始まるタンデムテンプレートの詳細な概略、開始シーケンス。ターゲットシーケンス(濃い青色、例は20nt long)を繰り返す。.反復は、最後の8個と最初の4つのヌクレオチドからなる5′および3′スペーサ配列によって横たわる、最初および最後の反復単位からの開始および制限配列の除去を可能にする。(C)タンデム転写産物(赤)とキメラ切断ガイド(緑色)のハイブリダイゼーション。RNase HはDNA 5′末端とは反対のRNAを切断する。2’OMe RNA側面は標的RNAへの切断ガイドの結合の関係性を高めることによって特異性を高める。この図は21から変更されています。略語: T7RNAP = T7 RNAポリメラーゼこの図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。 1. 新しいRNA構築物の準備 プラスミドの設計と準備 テンプレートシーケンスを複製ツール (.,シリアルクローナーなど)で書き込みます。 T7プロモートのシーケンスを取り、高収率開始シーケンスを追加します (T7: 5’TAATACGACTACTATA ^GGGAGA-3′)。注:転写はキャレット(^)で示されたヌクレオチドから始まります。開始シーケンス GGGAGA は可変ですが、厳密にシーケンス依存します。したがって、このシーケンスの使用をお勧めします。 標的配列の最後の8ヌクレオチド(nt)を5’スペーサー(5’S)として加える。 ターゲット シーケンス (TS) の繰り返しを追加します。 最初の4つのヌクレオチドを3’スペーサーとして、繰り返し(5’S)後に加えます。 BamHI 制限サイト (RS) または同様の一意の制限サイトを追加します。注:示されている全配列は、細菌の高コピープラスミド(例えば、pUC19)でクローン化されるか、容易に順序付けられます:5′-T7-5’S-(TS)n -3’S-RS-3′ (図2B)。繰り返しの数は、遺伝子合成で許容される限り多く(このプロトコルでは最大600 nt)にする必要があります。 市販キットを使用して 大腸菌 中のプラスミドを増幅します。 適切な制限部位を使用して、精製されたプラスミドを20 ng/μLで直線化します。規模制限は、最大 1 mL の BamHI でダイジェストします。 消化したプラスミドを精製し、1%アガロースゲルで線形化に成功したことを確認します。数ヶ月間-20 °Cで線形化されたプラスミドを保管してください。 切断ガイドデザイン(図2C) 標的RNA配列の最後の8ヌクレオチドを5′-3’方向に書き、3’末端の標的RNA配列の最初の4ヌクレオチドを5′-3’方向にも加える。 その配列の逆DNA補体を生成する ヌクレオチド文字の前に’m’を追加して、最初と最後の4つのヌクレオチドを2′-OMe修飾に変更します。注: 合成には、mT の代わりに mU が使用されます。 標準の脱塩精製でオリゴを注文してください。注:生成されたオリゴが2つのRNA配列の結合以外の別の場所で結合できるかどうかを確認してください。中央の4つのDNAヌクレオチドの完全な相補性が必要であり、隣接する領域はミスマッチを可能にする可能性がある。必要に応じて、側面を最大 18 nt まで拡張して、一意のバインド シーケンス36を生成します。 小規模IVT注意:RNaseフリーの作業のために、無菌およびRNaseフリー条件下ですべての試薬を準備してください。RNase除染試薬( 材料表を参照)と95%v/vエタノールを使用して、使用前に作業面とピペットをきれいにしてください。95%エタノールで手袋を洗い、糸くずのない長袖の服を着用してください。RNaseの汚染を最小限に抑えるために、開いた管の上で呼吸しないでください。 Tris-Cl (pH 8.0)、ジチオスレイトール、MgCl2、スペルミジン、およびNTPs/GMP(バッファなし)のストック溶液を準備します。 表1に示すように試薬を混合する。酵素または核酸を添加する前に、これらの試薬のマスターミックスを事前に準備してください。注:冷凍試薬を使用する場合は、解凍後に十分に混合してください。試薬は、高濃度で混合すると沈殿する可能性があるので、 表1の順序に従うことを強くお勧めします。 プラスミド、切断ガイド、無機ホスファターゼ(IPPase)、RNase H、T7RNAPの順に追加します。酵素活性は、体内で生産される酵素のために異なる場合がありますので、最良のものを選択する前にいくつかの濃度をテストします。注:例 えば 、RNase Hなしで、切断反応のための陰性制御を含めて、不足している標的バンドを欠陥のあるRNase H切断に起因させ、転写に失敗しないようにする。 37°Cで1時間反応をインキュベートし、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)上で反応を確認する(図3A)。サンプルを10倍の溶液に希釈し、ゲルに1μLをロードします。注:ゲル混合物:8M尿素、20%アクリルアミド(19:1アクリルアミド:ビサクリアミド)1x TBEで。ローディング溶液:5 mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、300 μMのブロモフェノールブルーのホルムアミド。新しいRNAが絶えず産生されるので、RNase H切断反応は1時間後には完全であるとは考えられない。この時点で、明確な標的バンドと類似の分子量の種(例えば、±3ヌクレオチド(nt)産物)の欠如を探してください。 試薬 在庫集中 少量の小さいスケール(μL) H2O – 24 トリス 1 M 5 MgCl2 1 M 0.5 DTT 1 M 0.5 スペルミジン 250mM 5 GMP 100mM 2.5 ATP 100mM 1.5 GTP 100mM 1.5 UTP 100mM 1.5 CTP 100mM 1.5 プラスミド 20 ng/μL 5 切断ガイド 100 μM 10 iPPase 10 mg/mL 0.5 ルナセ H 10 μg/mL 2 T7 RNAポリメラーゼ 5 mg/mL 2 表1:タンデムIVTおよび同時RNase H切断のための試薬テーブル。 在庫濃度はユーザーの利便性に合わせて調整できます。RNase H切断をT7 IVT後に行う必要がある場合は、T7RNAPの熱不活性化後に切断ガイドとRNase Hを追加します。使用量は、反応スケールで線形にスケールします。略語: T7RNAP = T7 RNAポリメラーゼ;IVT = インビトロ 転写。 2. NMR サンプル調製 目的の体積(通常10mL)に反応をスケールアップし、一晩反応を実行します。変性PAGEゲルを使用して翌日の反応完了試験を行う(図3A)。注:不完全な切断反応は、標的バンドの上の高分子量種によって示される。 切断が成功しなかったか完全であった場合、反応容器内の再膜RNAおよび開裂ガイドは、15sの450Wで従来のマイクロ波で溶液を加熱することによって行う。 溶液を37°Cにゆっくりと冷却し、40分間冷却します。1 mL 未満のボリュームには、加熱ブロックを使用してください。新しい沈殿物の形成に注意してください。 さらにIPPaseとRNase Hを追加し、37°Cでさらに1〜3時間インキュベートします。 変性PAGEで切断反応の完了を確認する。 RNase H切断反応が完了したら、50 mM最終濃度と渦を完全に加えて反応を焼き付けます。注:潜在的なピロリン酸沈殿物が溶解し、新しいタンパク質沈殿物が形成されます。 0.2 μmシリンジフィルターを介して溶液をフィルターし、注入ループサイズに応じてHPLCシステムに注入可能なボリュームに濃縮します。注: このプロトコルは、-20 °Cでサンプルを凍結することで、ここで一時停止することができます。 大規模なHPLC精製 イオン交換バッファー A と B を使用後 1 週間以内に準備します。バッファをフィルター処理して、ガスを解除します。注:緩衝剤A:20 mM酢酸ナトリウム;20 mM過塩素酸ナトリウム、pH 6.5。バッファー B: 20 mM 酢酸ナトリウム;600 mM過塩素酸ナトリウム、pH 6.5. 75°Cで少なくとも2列の体積に対して100%バッファAを続けてカラムを平衡化します。 HPLCシーケンス(図3B)を5.5mL/minの流量で準備します。20から30 ntの間のサイズのRNAの精製のために次の配列を使用してください: 0-7分: 0% B;7-16分:勾配0-20%B;16-46分:溶出、典型的には20〜30%Bの勾配(ニーズに応じて最適化する);46-62分:100%B;62-73分:0% B.注: 5.5 mL/min の流量の変化は、このプロトコルの分離に影響を与えませんでした。 1 mLの転写反応(標識なし)を一度に1mLに注入して溶出勾配を最適化します。注: 詳細と議論については、カールソンら31 および Feyrer ら21を参照してください。 変性ページで収集された分数をテストします。主溶出ピークが十分に単離され、純粋な標的RNAが含まれている場合、精製を10mLの転写反応にスケールアップします。 関心のある分数を収集し、濃縮し、NMR バッファとバッファーを交換します。50 mL を超えるボリュームについては、超遠心フィルターユニット( 材料表を参照)を使用してください。注:NMRバッファー:15 mMリン酸ナトリウム;25 mM 塩化ナトリウム;0.1 mM EDTA, pH 6.5.プラスチックチューブの壁に付着したRNAからの損失を最小限に抑えるために、1 mLの水、渦、遠心分離機ですべての回収管を洗浄して、すべての液体を回収します。 紫外線分光法を介して濃度を決定します。Feyrerら21に従って反応収率を計算します。注:RD実験用のNMRサンプルの濃度は、NMRチューブを使用して250 μLのサンプル体積で500 μMに相当する130 nmol以下であってはなりません(材料表)。 RNAサンプルの折りたたみ 1管あたり1mLに〜10mLの体積のサンプルを希釈し、アリコートする。 RNAアリコートを95°Cに5分間加熱します。 サンプルを氷の上または水氷塩混合物に入れてスナップ冷却し、30分間インキュベートします。 サンプルをプールし、2 mL 遠心フィルターユニットで〜250 μL まで濃縮します。 NMRチューブの充填 豊富な水、RNase除染試薬、水、95%エタノール(EtOH)、および再び水で洗い流すことによって、NMRチューブクリーナー内のNMRチューブを洗浄します。乾かしておきます。 水ですすいで、RNase除染試薬で拭き取り、糸くずのない拭き取りを使用して95%EtOHを拭いてプランジャーを洗浄します。乾かしておきます。 NMR サンプルに D2O の 10% (v/v) を加えます。 大きなピペットチップを使用して、RNAサンプルをNMRチューブに充填します。液体がチューブウォールの側面に沿って流れてみましょう。 プランジャーを挿入し、速いねじれ運動と一緒にプランジャーを押し下げて気泡を取り除きます。 新しい気泡を作成せずにゆっくりとプランジャーを引き上げ、パラフィンワックスフィルムで固定します。 NMRによる折りたたみを確認します。注:この時点で、少なくとも部分的な共鳴割り当てを行ってRNAサンプルの二次構造を確認し、立体構造ダイナミクスの研究に関心のある領域を特定する必要があります。RNA共鳴の割り当てに関する網羅的な記述はこのプロトコルを超えているため、この時点で確立された文献を参照してください 19,37,38.電気泳動移動シフトアッセイ(EMSA)は、RNAフォールディングの有用な指標となり、NMR実験の補完データとして役立ちます。 1H R1ρ RD実験が適切に折り畳まれた参照サンプル(図4):1H 1D、特にイミノ領域10~15ppmで、次のスペクトルを比較します。 芳香族1H、13C-HSQC;1H,1H-セロペ (任意).注:ダイマー形成はRNAヘアピンと同じまたは類似したイミノ信号を示すことが多いため、イミノ信号間で一致する場合でも、芳香族指紋も必要です。SELOPE実験は、非標識サンプルのヘテロ核実験は非常に時間がかかるため、芳香族フィンガープリント用の1H、13C-HSQCを置き換えることができます。 指紋参照として UUCG ループを使用します (存在する場合)。 1H R1ρ RD実験が記録される前に毎回この比較を行う。 3. 1H R1ρ 緩和分散—オン共振(ラベル1D版) 注: 以下の手順では、1D バージョンの HSQC ベースの RD パルス シーケンスを使用した、ラベル付きサンプルの RD 実験の設定について説明します。ラベルなしサンプルの SELOPE ベースの 1D シーケンスでも同じ手順に従います。両方のケースのパラメータ名と設定の概要を表 2に示します。1Dバージョンの焦点は、オフ共鳴測定に対してより実用的であり、SELOPEおよびHSQCベースの実験の2Dバージョンの設定は、それぞれシュラグニトヴァイトら20 とシュタイナーら10によって詳細に議論されているからです。 ハード 90°パルス(P1)の1H 電力を決定します。 オプション A: ブルカー パルスカルコマンドを 使用します。 Bオプション:zg実験では、水のピーク上のプロトンハードパルスパワーレベルでのヌテネーション曲線を測定して360°パルスを測定します。注:90°パルス長は、ゼロ信号が観測される持続時間の4分の1です(完全なヌテネーション曲線が測定された場合、それは2番目のゼロです。しかし、実際には、360°の予想値の周りの領域のみがサンプリングされます)。 ステップ3.1で決定したパルス長を使用して1H1Dスペクトルzgesgp.f2f3decを実行し、R1ρ測定のたびにRNA折りたたみを確認します。注: 1H SL 実験を初めて実行する場合は、必要な帯域幅ごとに SL 電力を校正して、計算された SL 電力がサンプルに供給される電力に対応しているかどうかを確認します。詳細なキャリブレーション手順については、Steinerら10に記載されています。 ラベル付きデータ・セットに 1H R1ρ を 作成し、キー・パラメーターを設定します。 新しいデータ・セットを作成します。理想的には、RNA割り当てのために完全に標識されたRNAサンプルに使用される1H-13C芳香族HSQCデータセットに基づいています。注: これにより 、13C と 15N の電力とデカップリング電源がすでに設定されていることを確認できます。 表 2の最初の部分に従って一般パラメータを設定します。 表 2の 2 番目の部分に従って RD 固有のパラメータを設定します。 テストのために1H SLの電力を最低値(1.2 kHz)に設定します。 1 つのエントリ、0 ms、(手順 3.4 で説明されているように vd リストを最適化する)を含むテスト vd リストを生成し、TDF1を 1 に設定し、D30を更新します。 これらの設定でテストスペクトルを実行します。 vd リスト (使用する SL の長さのリスト) を最適化します。 テストvdリスト(例えば、6つのエントリ:0メートル、5メートル、10メートル、20メートル、30メートル、40メートル;加熱による系統的なエラーを避けるためにこれらの値をスクランブル)で実験を実行します。 D30とTDF1をそれに応じて更新します(この例では、D30 = 42m および TDF1 = 6)。 ピーク と SL の長さのプロットの強度。元のピークの強度が 1/3 に減少する SL の長さを識別します。 実験で使用する最終的な vd リストを作成します。リストの下の順序を下げ、昇順にする場合は使用しないでください。統計調査のためにいくつかの重複を追加します。vd リストに変更が加えられたたびに、D30 と TDF1 を更新してください。注: 実験は、疑似 2D の方法で vd リストに指定された異なる SL 長さで実行されます。 スキャン数を選択して、リストの最も弱いピークのシグナル対ノイズ比(SINO)が少なくとも10になるようにします。メモ:vdリストは低SLパワー(1.2 kHz)に最適化されていますが、このvdリストは、使用するSLパワーの最高値(例えば.,15 kHz)でテストする必要があります。これは、かなりの kEX 寄与を伴うピークの高SLパワーで減衰が大幅に遅くなるからです。したがって、SLの高い電力で十分な減衰も検証する必要があります。 パラメーターの説明 パルスシーケンスのパラメータ名 1D ラベル付け 1Dセロペ オン共鳴1Dのためのパルスプログラム 1HR1rho_HCP_onres1D.es 1HR1r_HH_onres1D.js 1H キャリア周波数 (ppm) O1P = ppm の水共振 O1P = 関心ピークの化学シフト (ppm) CNST28 = 関心ピークの化学シフト (ppm) CNST29 = ppm の水共振 1H堅い90ºの脈拍 P1 @ PL1 (3.1.1でキャリブレーション) P1 @ PL1 (3.1.1でキャリブレーション) 水抑制のための形状パルスとパワー P25 = 1000 私たち @ sp3 P12 = 2000 私たち @ sp1 (ウォーターゲート) (励起彫刻) 13Cキャリア周波数、関心のピークの 13C化学シフトとのオン共鳴 O2P – 15Nキャリア周波数、デカップリングのための平均 15N化学シフト(芳香族HSQCで使用される) O3P – 13C/15N デカップリング(HSQC のように設定) pcpd2, cpd2 – pcpd3, cpd3 HCP 転送 (例: p=1/J @ 100 Hz) – パルス と pulsef2 コマンドは、ハードパルスからパワーを決定するために使用することができます 対象となるピークの持続時間(1/J(1H-13C)に設定) P11 電源 1Hと 13Cの電源 SP1、SP12 セロペ転送(d = 1/4J(H5-H6)) – D5 セロペ(4000私たち、Eburp)の選択的パルス(例えば、芳香領域) – P13 と SP4 SL /RD固有のパラメータ: 1HSLパワーは、較正されたハードパルスから得られる(例えば、パルス指令を使用する)。 Pl25 と CNST12 (1.2 – 15 kHz) Pl24 (50 Hz – 15 kHz) SL 期間の変数遅延リスト (最初は 1 項目、0、最適化 3.1.3 の下で説明) vdlist (~ 0 ~ 40 ミリ秒) vdlist (ラベルなしサンプルの低 R2 のため、 ~ 0 ~ 150 ミリ秒) VD リスト内の項目の TDF1 数 (初期値 1) TDF1 TDF1 熱補償: D30 = vd リストの最大値 + 2ms D30 D30 非常に広範なSLsに対する追加の熱補償 PL25 オフ共鳴固有のパラメータ: オフレゾナンス1Dのためのパルスプログラム 1HR1rho_HCP_offres1D.es 1HR1r_HH_offres1D.js オフ共鳴実験のためのオフセット CNST30 CNST30 表2:1D HCPベースおよび1D-SELOPEベースの1H R1ρ実験を設定するためのパラメータの概要。略語: 1D = 1 次元;HCP = 異核間分極化;SELOPE = セレクティブ最適化プロトン実験;ppm = 100 万分の 1 の部品。HSQC=ヘテロ核スピン量子相関;SL = スピンロック;RD = 緩和分散 オン共鳴1H1ρ実験のセットアップと取得 セクション 3.4 から Topspinの新しいフォルダに実験をコピーします。 このフォルダでは 、PL25 と CNST12を変更するたびに、さまざまな SL 強度で実験を設定します。 pulse コマンドを使用して、各 SL 強度の正しい電力レベルを決定します。SL 強度は 1.2 ~ 15 kHz の範囲で、SL 強度を低くする場合は高密度のサンプリングを使用します(SL 強度の選択については 図 5G を参照)。いくつかの SL の強みについて重複する実験のコピーを追加します。 これらの実験を実行します。 オン共鳴1 H R1ρ実験の解析 TopSpinでは、xf2コマンドを使用して同じ処理パラメータ(例えば、線の広げ、位相)を使用して各疑似2Dデータセットの各スライスを処理し、Bruker AUプログラムsplit2Dを使用してデータセットを1Dに分割します。 各1Dスライスの信号強度と音量を取得します。注:実際には、潜在的に重複するピークからの貢献を取り除くためにスペクトルをデコンし、Bruker AUプログラム multidconの 使用を可能にする方が便利にテキストファイル デコール .txt 1つの実験ですべてのスライスのピークの強度または領域を要約します。 その後、他のプログラムで簡単に読み出すことができます (ここでは、Steiner ら10で説明されているように、ここでは書かれた Python スクリプトを使用して、手順 3.6.3 および 3.6.4. 各SL強度にモノ指数減衰を合わせて、R1ρ(またはオン共振、R2+ REX)値を求めます。 これらのR2+REX値 (y)と をプロットします。SL強度(x)(図5F、G)。注: SL強度が低い値が大幅に高く、SLパワーが高くなると減少する場合( 図5Gを参照)、調査対象のピークは分散を示し、励 起状態の母集団と化学シフトの違いに関する情報を得るために追加の(オフ共鳴)実験を行うことが興味深いかもしれません。地盤状態。 4. 1H R1ρ 緩和分散-オフ共振(ラベル1D版) オフレゾナンス1H1ρ実験のセットアップと取得 新しいトップスピンフォルダでは、あるSL強度で実験を設定します(通常 、REX の寄与が最も高いため、最初に最も低いSL強度で、オフ共鳴SLsの代表的な選択については 図5G を参照してください)が、異なるオフセットを持つ、毎回 CNST30を変更します。 図 5H,Iに示すように、オフセットを0オフセット前後で密度の高い±(3 または 4)*SL 強度のオフセットを使用します。 これらの実験を実行します。 オフレゾナンス 1 HR1ρ実験の 解析 3.6.1~3.6.3 と同じ処理方法を使用して、各オフセットの R1ρ 値を決定します。 これらの値とオフセットをプロットします (図 5G)。注: この曲線の非対称性は、励起状態の化学シフト情報が取得できることを示している可能性があります。ブロッホ・マッコネルまたはラゲール方程式を用いた徹底的な適合と解析は、kEX、p ES、ならびにΔω10、20(図5G)に関する情報を得るために行われなければならない。両方の 1D 実験のデータセット、パルス プログラム、およびマクロの例は、Petzold Lab Github リポジトリ (https://github.com/PetzoldLab) にあります。パラメータの概要は、表 2に示しています。