Parça Bazlı Kurşun Keşfinde Tarama için Nano-Diferansiyel Tarama Florüretrisi
Summary
Hedef proteinin erime sıcaklığındaki değişiklikleri izlemek(yani,termal kayma tahlili, TSA), birkaç yüz bileşik parça kütüphanelerini taramak için etkili bir yöntemdir. İç triptofan floresanını ve parça taraması için hafif geri saçılmaları izlemek için robotik destekli nano-Diferansiyel Tarama Florüreti (nano-DSF) uygulayan bir TSA protokolü sunuyoruz.
Abstract
Termal kayma tahlilleri (TSA’lar), hedef proteinin erime sıcaklığının (Tm)ortamındaki değişikliklere(örneğintampon bileşimi) yanıt olarak nasıl değiştiğini inceler. TSA’nın ve özellikle nano-Diferansiyel Tarama Florürünün (nano-DSF) faydası, hem belirli bir proteini stabilize eden koşulları bulmak hem de belirgin Tm’dekideğişiklikleri izleyerek ligand bağlamaya bakmak için yıllar içinde kurulmuştur. Bu makale, Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) parça kütüphanesinin (768 bileşik) nano-DSF kullanılarak verimli bir şekilde taranmasını ve potansiyel parça bağlamasını tanımlamak için Tm’nin izlenmesini sunun. Nano-DSF deneyleri yapmak için protein kalitesi ve konsantrasyonu ile ilgili önkoşullar, 96 kuyu plakalarında gerekli örnekleri hazırlamak için yapısal biyoloji laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılan nano litrelik bir robotik dağıtıcı kullanan adım adım bir protokol ile kısaca özetlenmiştir. Protokol, reaktif karışımlarının nano-DSF ölçümleri için gerekli kılcal damarlara nasıl aktarıldığını açıklar. Buna ek olarak, bu makale termal denatürasyonu (iç triptofan floresan izleme) ve toplamayı (ışık geri saçılımını izleme) ve veri aktarımı ve analizi için sonraki adımları ölçmek için protokoller sağlar. Son olarak, bu prosedürün lider keşif kampanyaları bağlamında kullanımını göstermek için üç farklı protein hedefiyle tarama deneyleri tartışılmaktadır. Açıklanan yöntemin genel prensibi diğer parça kitaplıklarına kolayca aktarılabilir veya diğer araçlara uyarlanabilir.
Introduction
İlaç keşif programları genellikle kimyasal bileşikleri, çoğu zaman proteinler olan ilaç hedeflerinin işleviyle etkileşime girme ve/ veya değiştirme yetenekleri için tarayarak başlar. Bu tür ekranlarda bulunan sözde “hitler”, yeni başrol ve geliştirme adaylarının ve bugünlerde ruhsat verilen yeni ilaçların çoğunun keşfine zemin hazırlamaktadır. Bu nedenle, yüksek aktarım hızı yöntemlerinin kullanılabilirliği, sıkı bağlamalarını veya hedefin belirli bir işlevini modüle etme yeteneklerini hızlı bir şekilde tanımlamak için çok sayıda farklı bileşikle çok sayıda mevcut hedefi taramak için vazgeçilmezdir. İsabetler belirlendikten sonra, en umut verici hit-target kombinasyonları, “yapı-aktivite ilişkilerini” (SAR) anlamak için diğer, genellikle pahalı ve zaman alıcı teknolojiler kullanılarak kapsamlı bir ilaç geliştirme boru hattına itilir.
“Çevirisel Araştırmalar için NMR, EM ve X ışınları altyapısı” (iNEXT) ve mevcut halefi iNEXT-Discovery tarafından sunulanlar gibi yapısal biyoloji yaklaşımları, genellikle birkaç sentetik kimya turu tarafından ilk isabetlerin benzeşimini ve farmakolojik özelliklerini geliştirirken çok sayıda bileşiğin etkileşimlerini aşırı ayrıntılı olarak incelemek için kullanılır1. Bu “darbeden kurşuna” kampanyalardan çıkan kurşun bileşikleri kalkınma adayı olur ve preklinik çalışmalara girer. İyi gelişmiş moleküler tarama metodolojisi kabaca iki yaklaşıma kategorize edilebilir, yani ligand tabanlı kurşun keşfi (LBLD) ve parça bazlı kurşun keşfi (FBLD). LBLD kampanyalarında, protein reseptörleri ya birkaç bin elle seçilmiş ligandla (doğal ligandların yapısına veya hedefin yapısına göre) ya da kimyasal alanın büyük bir kısmını kaplayan ilaç benzeri ligand kütüphanelerinde on binlerce bileşikle taranır.
Genellikle, bileşikler bir aktivite testinde inhibitör aktiviteleri için test edilir, tipik olarak enzmatik bir işlevin izlenmesi. Bununlabirlikte,FBLD kampanyaları2,3,4,5‘te, genellikle ilaçlardan (100-200 Dalton) daha küçük olan bazı yüzlerce bileşik, bir etkinlik testi kullanmadan hedefi doğrudan bağlama yetenekleri için test edilir. Bu bağlama hedef aktiviteyi engelleyebilir ve parçaların hedefe bağlanma yeteneğini doğrudan rapor eden birçok biyofiziksel yöntemle veya X-ışını kristalografisi6 ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi7ve daha yakın zamanda kriyo-elektron mikroskopisi gibi yapısal yöntemlerle ölçülebilir. Parçalar protein üzerinde birbirine yakın olan farklı konumlarda bağlandığında, farklı, genellikle düşük benzeşimli bağlayıcı parçalar, daha ayrıntılı olarak çalışılabilen küçük bir müşteri adayı kümesi oluşturmak için rasyonel olarak kimyasal olarak birleştirilebilir. Bu sıklıkla daha yüksek benzeşim, daha güçlü bileşikler ile sonuçlanır ve bu metodoloji klinik potansiyele sahip önemli moleküller vermeye başlamıştır. Kimyasal grupları verimli bir şekilde sömüren “ideal” bir parça kütüphanesi seçimi uzun yıllardır aktif bir araştırma alanı olmuştur8,9,10.
İlk vurgu tam kimyasal alanı kaplamak iken, daha sonra dikkat, kurşun bileşikleri üretmek için parça isabetlerinin aşağı akış kimyasal kombinasyonunu sağlamaya odaklandı. Bu tür araştırmalar sözde “hazır” kütüphanelere yol açmıştır. Bunlar, SAR’ı çalışmada verimli ilerleme için hızlı, ucuz takip sentetik kimyaya izin veren en az bir fonksiyonel gruba sahip parçalar içerir. iNEXT tarafından katalİze edilen faaliyetlerden biri, Diamond Light Source ve Structural Genomics Consortium’daki araştırmacılar tarafından geliştirilen hazır kütüphaneyi güncellemekti. Bu birleşik çaba, iNEXT12içinde de doğrulanmış olan DSi-Poised kütüphanesi11ile sonuçlandı. Daha sonra, bu kütüphane, kimyasal bir araştırma kuruluşu ve tarama için büyük yapı taşları ve bileşik kütüphane koleksiyonlarının üreticisi olan Real Database of Enamine Ltd.’deki bileşiklerin mevcudiyeti ile uyumlu hale geldi. DSi-Poised artık satın almak için herkes tarafından kullanılabilir, ancak desteklenen parça tarama projeleri için birçok iNEXT-Discovery ortak laboratuvarında da mevcuttur.
Üst düzey X-ışını kristalografisi ve NMR yapısal biyoloji teknolojilerinin FBLD için avantajları ve dezavantajları vardır. Her ikisi de yalıtılmış hedef örnekleri gerektirir ve FBLD için gereken yüksek çözünürlüklü atomik ayrıntıları verir. Bununla birlikte, kristaller X-ışını kristalografisi için gereklidir ve parçalar, üç boyutlu kristal kafesin yapımında yer almayan iyi sıralanmış protein bölgelerindeki boşluklara bağlanır. Çözüm NMR genellikle X-ışını kristalografisinden farklı darbeler verir, çünkü kristal ortamından etkilenmez ve kısmen sıralanmış protein bölgelerinde de bağlamayı tespit etmede iyidir. Bununla birlikte, ligand tabanlı NMR deneyleri nispeten hızlı olsa da, yine de önemli miktarda zaman ve malzeme gerektirir ve rutin olarak yalnızca nispeten küçük protein hedefleri veya etki alanları için yapılabilir. Kristalografik veya NMR deneyleri için bileşiklere öncelik vermek amacıyla biyofiziksel yaklaşımlarkullanılmıştır 13,14,15.
Son enstrümantasyon ve hesaplama protokolleri, yapıları belirleyerek ve ~1.000 parçayı çok verimli bir şekilde analiz ederek FBLD için verimli kristalografik taramaya izin verdiğinden, bu önceliklendirme X-ışını tabanlı araştırmalarda daha az gerekli hale gelmiştir. Bununla birlikte, NMR için kütüphane taramasına öncelik vermek ve en üst düzey ekipmanlarda enstrüman zamanından tasarruf etmek için daha ucuz ve daha hızlı deneyler kullanmak arzu edilir. Aynı zamanda, temelde farklı teknolojilerin bir kombinasyonunu kullanmak, bağlama olaylarının bağımsız onayını veya hatta yalnızca kristalografi veya NMR yöntemini kullanarak alınmayan ek isabetleri sağlayabilir. Kristalografik ve NMR teknikleri hem çok pahalı ekipmanlar gerektirir hem de genellikle sadece yerel, yüksek vasıflı uzmanların yardımıyla özel harici tesislerde yapılabilir. Buna ek olarak, sonuçların doğru analizi de yüksek uzmanlık talep eder. iNEXT ve iNEXT-Discovery gibi programlar bu tür tesislere erişimi demokratikleştirirken16, ucuz, hızlı ve yüksek verimli FBLD taramanın diğer yöntemlerle çok daha geniş bir laboratuvar yelpazesinde ilaç tarama programlarını teşvik edebileceği kabul edilmiştir. Bu sonuçlar daha sonra tıbbi kimyagerlerle işbirlikleri kurmak ve NMR ve kristalografi tesisleri taranabilecek bileşiklerin sayısına kısıtlamalar getiriyorsa, en pahalı tarama deneylerini en umut verici bileşiklere öncelik vermek için bir gösterge olarak kullanılabilir.
TSA, FBLD taraması için kullanılabilecek hızlı, verimli ve nispeten ucuz ve erişilebilir bir biyofizik yöntem17 oluşturur. Kristalizasyon denemeleri için kararlı protein koşullarının bulunmasına yardımcı olmaktan18, hücrelerde belirli hedeflere bağlanan bileşiklerin bulunmasına kadar birçok ortamda kullanılmıştır19. TSA’lar, ligand bağlama hedef proteinleri için ayrışma sabitlerini ölçmek için de kullanılmıştır, çünkü ligand bağlama genellikle termal stabilitede değişikliklere yol açar. Tüm TSA’larda, bir proteinin denatürasyon sıcaklığındaki değişim (stabilitesi) yavaş bir sıcaklık artışının bir işlevi olarak ölçülür. Isıtma sırasında protein denatürasyonunu izlemenin etkili bir yolu, sıcaklık artışı nedeniyle ortaya çıkan proteinin maruz kalan hidrofobik bölgeleriyle etkileşim üzerine bir hidrofobik boyanın (tipik olarak Sypro Orange) floresan söndürülmesini ölçen DSF veya Thermofluor tarafından yapılır.
Nano-DSF tipik olarak dış boyaların yokluğunda proteinin termal kararlılığının ölçülmesi anlamına gelir. Bu olasılığı sunan ilk araçlardan biri, bir numunenin ışık saçılmasının yanı sıra geniş bir ışık yoğunluğu yelpazesini ölçen OPTIM1000 idi. Bu makine, proteinin açılma (tipik olarak triptofan floresanını takiben) ve protein toplamanın eşzamanlı ölçümüne izin verdi (oluşan nanopartiküller ~400 nm’de ışık saçılımının artmasına neden oldu). Daha sonra Prometheus, floresan sinyalinin toplanması ve hassas algılanması için geri yansıma kullanımını tanıttı ve düşük protein konsantrasyonlarının iyi hassasiyetle taranmasını sağladı20. Aşağıdaki bölümde Prometheus’un farklı protein hedefleri için isabetleri tespit etmek için bir parça tarama protokolünü göstermek için nasıl kullanıldığı açıklanmaktadır. Beklenen protein kalitesi ve miktarı hakkında kısa bir giriş, parça tarama deneylerinin hazırlanması, gerçekleştirilmesi ve analiz için adım adım bir protokol ile takip edilir. Üç protein için tarama sonuçları, iNEXT-Discovery işbirliklerinin bir parçası olarak elde edilen örnek veriler olarak gösterilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, bazı yaygın robotik ve ölçüm araçlarını kullanarak parça kitaplıklarını taramak için orta ila yüksek aktarım hızı yöntemini açıklar. Bu protokolde açıklananlar gibi ekranlar, amsterdam’daki NKI Protein Tesisi tarafından rutin olarak gerçekleştirilebilir, örneğin bir iNEXT-Discovery hizmeti olarak, genellikle teklif başvurusu ve akran incelemesinden sonra kullanıcılar için ücretsiz olarak bile. Bu gibi durumlarda, DSi-Poised kütüphanesi tesis tarafından sağlanabilir, ancak diğer kütüphanelerin kullanımı da her farklı kullanıcı uygulaması ve hizmet sözleşmesi bağlamında tartışılabilir. Bu protokoldeki aletlerin seçimi birçok laboratuvar için pratik çözümleri temsil eder, ancak altın bir standart olarak düşünülmemelidir. Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyon termositlerinde açılmayı tespit etmek için çevreye duyarlı etiketler kullanan yöntemler yerine, parça taraması için hedef proteinin termal kararlılığını ölçmek için etiketsiz yöntemler önerilir.
Prometheus enstrümanı kullanılarak burada sunulan gibi etiketsiz yöntemlerin bazı avantajları vardır: düşük miktarda protein kullanırlar, genellikle birkaç büyüklük sırasını daha az kullanırlar; numunenin saçılmasını ve dolayısıyla toplamayı aynı anda ölçmek için kullanılabilirler; ve diğer yaklaşımlarda açılmayı tespit etmek için kullanılan etiketler her parçayla farklı etkileşime girebilir ve bu da ölçüm yapıtlarına neden olabilir. Bu protokol, manuel olarak yapılamayan çok küçük bir numune hacminin (0,3 μL) pipetlemesine izin veren Sivrisinek robotu bağlamında tanımlanmıştır. Sivrisinek, yapısal biyoloji ve ilaç keşif projeleri üzerinde çalışan birçok laboratuvarda bulunan popüler bir robottur; ancak, protokol açıkça düşük hacimli pipetleme için alternatif yaklaşımlar kullanabilirsiniz.
Parça kitaplıkları DMSO’da çözünmüş bileşikler içerir. İlk zorluklardan biri, proteinin stabil kaldığı ve bileşiklerin çözünür kaldığı en uygun DMSO konsantrasyonu bulmaktır. Bu, tarama için en uygun koşulları belirlemek için ölçümlerin çeşitli DMSO konsantrasyonlarında gerçekleştirilmesini içerir. Burada kullanılan proteinden parça seyreltmeye kadar olan protein, %0,2’lik DMSO konsantrasyonlarıyla sonuçlanır; çoğu protein bu koşullarda oldukça kararlıdır. Ölçümler tipik olarak düşük protein konsantrasyonlarında (0,2 mg mL-1)gerçekleştirildiği için, 768 bileşik kütüphane için taramanın yapılması için gereken protein miktarı toplamda ~2-3 mg’dır. Bu kadar düşük protein konsantrasyonlarıyla çalışmak sadece protein üretim maliyetlerini azaltmakla kalmaz, aynı zamanda protein çökeltme şansını da azaltır. Deneydeki parçaların konsantrasyonu ~2 mM olduğundan, düşük protein konsantrasyonu parça bağlamanın algılanmasını etkilemez ve zayıf bağlayıcıların tanımlanmasına izin verir.
Bu deneylerdeki erime geçiş tespiti floresan yoğunluğuna dayandığından, kritik bir husus ölçümlerin gerçekleştirildiği lazerin uyarlama gücünü belirlemektir. Bileşiklerin proteinle etkileşimi (i) iç floresan üzerinde hiçbir etkisi yoktur, (ii) söndürme ile sonuçlanır veya (iii) iç floresanını arttırır. Buna ek olarak, düşük protein konsantrasyonları ile çalışmak, yerel protein için floresan sayısının düşük olacağı anlamına gelir. Bu nedenle, ekscitasyon gücü, numunelerin çoğu ölçülebilecek şekilde ayarlanmalıdır. Her çalıştırmanın saçılma profili, herhangi bir parçanın eklenmesiyle tetiklenebilecek toplama efektleri hakkında önemli bilgiler sağlar. Ek olarak, sıcaklığın bileşik çözünürlük üzerindeki etkisi saçılma profilinde de görülebilir.
Beklenmedik bir şekilde, birçok bileşik için saçılmanın aslında artan sıcaklıkla azaldığı gözlenmiştir (Şekil 6). Bu nedenle, özellikle X-ışını kristalografisi veya NMR spektroskopisi tarafından daha zorlu ölçümler için aday olarak kabul edilen veya hatta takip kimyası için isabet olarak kabul edilen parçalar için, her deneyin güvenilirliği hakkında karar vermek için hem erime geçiş eğrisine hem de beraberindeki saçılma profiline bakmak önemlidir. Parça tarama amacıyla yöntemin belirli bir sınırlaması, DSi-Poised kütüphanesindeki birçok parçanın, bazen dedektörün doygunluk sınırının ötesinde, önemli içsel floresanlara sahip olmasıdır ve bu nedenle bunlar düşük heyecan gücünde bile hedef bağlama için uygun şekilde taranamaz. Bu yöntem için dikkat edilmesi gereken bir diğer nokta, sadece triptofan kalıntıları içeren proteinlerle kullanılabilmesidir.
Şekil 6: Sıcaklığın bileşik çözünürlük üzerindeki etkisi. Hec1’in eriyen geçiş eğrisi ve saçılma profili iki farklı bileşikle. (A) Saçılma profili, bu örnek için çözünürlüğün sıcaklık tarafından etkilenmediğini gösterir. (B) Saçılma profili, bu numunenin çözünürlüğü artan sıcaklıkla birlikte arttığını göstermektedir. Bu durumda erime geçiş eğrisi bu nedenle güvenilir değildir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Açık bir soru, Tm’deönemli bir değişiklik olarak düşünülmesi gereken şey matematiksel açıdan değil, pratik açıdan: Tm’deki hangi değişikliğin bir ligandın bir proteine bağlanmasının göstergesi olarak düşünülmesi önemlidir? Bu örneklerde, Hec1’i bağlamak için parçaların% 74’ü, Mps1 için% 66’sı ve Nsp5 için% 53’ü için 1 °C’den daha az kaymalar görülür. Genel bakış grafiklerinde (Şekil 5), pozitif veya negatif olarak 1, 2, 5 veya 5 dereceden fazla Tm kayması depo gözleri dikkate alındı. Bu, iyi bir genel bakış sağlamak ve bir sonraki adımı belirleyerek bilinçli karar vermeye izin vermek için her özel duruma göre değişiklik gerektirir. Özellikle, bazı proteinler için, düşünülen parçalara bağlı olarak hedefin hem stabilizasyonu hem de stabilizasyonu gözlenmiştir. Her iki olay da ilginçtir, çünkü her ikisi de parça bağlamanın sonucu olabilir ve her ikisi de protein davranışını manipüle etmek için iyi bir takip molekülüne yol açabilir.
Son bir soru kalır, yani, “yararlı bir vuruşu tanımlayan nedir?”. Aslında, cevap belirli bir duruma bağlıdır. Örneğin, Hec1 için, proteini 2 dereceden fazla stabilize eden veya 5’ten fazla istikrarsızlaştıran tüm parçalar, bu isabetlere dayanarak yeni moleküller tasarlayan kimya işbirlikçilerimize iletildi. Bununla birlikte, Nsp5 için, nanoDSF türevi isabetleri NMR deneyleriyle doğrulamak için en dengeleyici isabetler NMR işbirlikçilerimize iletildi. Yani bu protokolden elde edilen tarama sonuçları dikkatle ve bağlama bağlı bir şekilde analiz edilmeli, özel soru ve çevresindeki metodolojiye dayalı bilinçli kararlar verilmelidir. Her durumda, burada açıklanan yöntem, kimya kampanyaları için doğrulamayı, önceliklendirmeyi veya yeni fikirler vermeyi amaçlayan X-ray ve NMR tabanlı tarama gibi mevcut metodolojilere tamamlayıcı bir yaklaşımdır.
Ek Tablo S1: Proteinlerin taranmasında kullanılan tamponların listesi. Kısaltmalar: HEPES = 4-(2-hidroksyetil)-1-piperazineethanesülonik asit; DTT = dithiothreitol; MOBS = 4-(N-morfoolino)butanesülfonic asit. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo S2: Nanodispenser robot ile kullanım için MRC 2 kuyu plakası özellikleri.
Ek Tablo S3: Nanodispenser robot ile kullanım için 96 kuyulu V-alt plaka özellikleri. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Tablo S4: Temsilisonuçlarda tartışılan proteinlerin tamponu, protein konsantrasyonu ve T m.’si. Kısaltmalar: DTT = dithiothreitol; Hec1 = Kanser 1 proteininde Yüksek Oranda İfade Edilir; Mps1 = monopolar mil kinaz 1; Nsp5 = SARS-CoV-2 3C benzeri proteaz. Bu Tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 1: Genel bakış parametreleri–örnek veriler. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 2: 406 parça örnek veri için T m ve ΔTm değerleri. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
“Bu çalışma, bir Instruct-ERIC merkezi olan NKI Protein Tesisi’ne erişimden yararlandı. Finansal destek, avrupa komisyonunun Horizon 2020 programı tarafından finanse edilen iNEXT, proje numarası 653706 ve 871037 proje numarası iNEXT-Discovery tarafından sağlanmıştır”.
Materials
| ClearVue Sheets | Molecular Dimensions | adhesive sealing film for protein plate | |
| CORNING 6570 Aluminium Sealing Tape | CORNING | adhesive sealing film for fragment plate | |
| DSi poised library | Enamine | Fragment library containing 768 compounds used in this study | |
| Elisa Reagent Reservior | ThermoFisher Scientific | 15075 | Reagent reservior used for pipetting the protein |
| Greiner round (U) bottom plates | Cat. No. 650201 | Fragments supplied in these plates | |
| Mosquito type X1 | sptlabtech | Part nr- 3019-0003 | Nanolitre dispenser |
| MRC 2-well crystallization plate | MRC96T-PS | ||
| Pierce ELISA Reagent Reservoirs | Pierce | ||
| Prometheus High Sensitivity capillaries | Catalog PR-C006 | ||
| Prometheus NT.48 nanoDSF | Nanotemper | Catalog nr PR001 (+ Aggregation Detection Optics, catalog nr PR-AGO) | nanoDSF and light back scattering |
| Prometheus Standard capillary type | Catalog PR-C002 | ||
| TX-1000 | Thermoscientific | Centrifuge for plates | |
References
- Hoffer, L., Muller, C., Roche, P., Morelli, X. Chemistry-driven hit-to-lead optimization guided by structure-based approaches. Molecular Informatics. 37 (9-10), 1800059 (2018).
- Lamoree, B., Hubbard, R. E. Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD). Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).
- Ress, D. C., Congreve, M., Murray, C. W., Carr, R. Fragment-based lead discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (8), 660-672 (2004).
- Carr, R. A. E., Congreve, M., Murray, C. W., Rees, D. C. Fragment-based lead discovery: Leads by design. Drug Discovery Today. 10 (14), 987-992 (2005).
- Bradley, A. R., et al. The SGC beyond structural genomics: Redefining the role of 3D structures by coupling genomic stratification with fragment-based discovery. Essays in Biochemistry. 61 (5), 495-503 (2017).
- Davies, T. G., Tickle, I. J. Fragment screening using X-ray crystallography. Topics in Current Chemistry. 317, 33-59 (2012).
- Ma, R., Wang, P., Wu, J., Ruan, K. Process of fragment-based lead discovery – A perspective from NMR. Molecules. 21 (7), 854 (2016).
- Troelsen, N. S., Clausen, M. H. Library design strategies to accelerate fragment-based drug discovery. Chemistry. 26 (50), 11391-11403 (2020).
- Shi, Y., von Itzstein, M. How size matters: Diversity for fragment library design. Molecules. 24 (15), 2838 (2019).
- Taylor, A., Doak, B. C., Scanlon, M. J. Design of a fragment-screening library. Methods in Enzymology. 610, 97-115 (2018).
- Cox, O. B., et al. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7, 2322-2330 (2016).
- Sreeramulu, S., et al. NMR quality control of fragment libraries for screening. Journal of Biomolecular NMR. 74 (10-11), 555-563 (2020).
- Pfaff, S. J., Chimenti, M. S., Kelly, M. J. S., Arkin, M. R. Biophysical methods for identifying fragment-based inhibitors of protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1278, 587-613 (2015).
- Fattori, D., Squarcia, A., Bartoli, S. Fragment-based approach to drug lead discovery: Overview and advances in various techniques. Drugs in R & D. 9 (4), 217-227 (2008).
- Winter, A., et al. Biophysical and computational fragment-based approaches to targeting protein-protein interactions: Applications in structure-guided drug discovery. Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (4), 383-426 (2012).
- Boelens, R., et al. iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology. FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).
- Zhang, R., Monsma, F. Fluorescence-based thermal shift assays. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 13 (4), 389-402 (2010).
- Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens. Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).
- Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
- Bruce, D., Cardew, E., Freitag-Pohl, S., Pohl, E. How to stabilize protein: stability screens for thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry in the Virus-X Project. Journal of Visualized Experiments JoVE. (144), e58666 (2019).
