Fluorimetría de barrido nanodes diferencial para el cribado en el descubrimiento de plomo basado en fragmentos
Summary
El monitoreo de los cambios en la temperatura de fusión de una proteína objetivo(es decir,el ensayo de cambio térmico, TSA) es un método eficiente para examinar bibliotecas de fragmentos de unos pocos cientos de compuestos. Presentamos un protocolo TSA que implementa la fluorimetría de escaneo nano-diferencial asistida por robótica (nano-DSF) para monitorear la fluorescencia intrínseca de triptófano y la retrodisparión de luz para la detección de fragmentos.
Abstract
Los ensayos de cambio térmico (ECA) examinan cómo cambia la temperatura de fusión (Tm)de una proteína objetivo en respuesta a los cambios en su entorno(por ejemplo,la composición del tampón). La utilidad de la TSA, y específicamente de la fluorimetría de barrido nano-diferencial (nano-DSF), se ha establecido a lo largo de los años, tanto para encontrar condiciones que ayuden a estabilizar una proteína específica como para observar la unión al ligando mediante el monitoreo de los cambios en el aparente Tm. Este artículo presenta un cribado eficiente de la biblioteca de fragmentos Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) (768 compuestos) mediante el uso de nano-DSF, monitoreando Tm para identificar la posible unión de fragmentos. Los requisitos previos con respecto a la calidad y concentración de proteínas para realizar experimentos nano-DSF se describen brevemente seguidos de un protocolo paso a paso que utiliza un dispensador robótico de nano litros comúnmente utilizado en los laboratorios de biología estructural para preparar las muestras requeridas en placas de 96 pozos. El protocolo describe cómo las mezclas de reactivos se transfieren a los capilares necesarios para las mediciones de nano-DSF. Además, este documento proporciona protocolos para medir la desnaturalización térmica (monitoreo de la fluorescencia intrínseca de triptófano) y la agregación (monitoreo de la retro-dispersión de la luz) y los pasos posteriores para la transferencia y el análisis de datos. Finalmente, se discuten experimentos de detección con tres objetivos de proteínas diferentes para ilustrar el uso de este procedimiento en el contexto de las campañas de descubrimiento de plomo. El principio general del método descrito puede transferirse fácilmente a otras bibliotecas de fragmentos o adaptarse a otros instrumentos.
Introduction
Los programas de descubrimiento de fármacos a menudo comienzan examinando compuestos químicos por su capacidad para interactuar y / o modificar la función de los objetivos de los medicamentos, la mayoría de las veces proteínas. Los llamados “hits” que se encuentran en tales pantallas, establecen las bases para el descubrimiento de nuevas pistas y candidatos de desarrollo, y para la mayoría de los nuevos medicamentos que se están licenciando en estos días. Por lo tanto, la disponibilidad de métodos de alto rendimiento es indispensable para examinar un enorme número de objetivos disponibles con un gran número de compuestos diferentes para identificar rápidamente su unión estricta o su capacidad para modular una función específica del objetivo. Después de que se identifican los aciertos, las combinaciones de objetivos de acierto más prometedoras se introducen en una extensa cartera de desarrollo de fármacos utilizando otras tecnologías, a menudo costosas y que consumen mucho tiempo, para comprender las “relaciones estructura-actividad” (SAR).
Los enfoques de biología estructural, como los ofrecidos por los programas de acceso financiados con fondos de la UE “Infrastructure for NMR, EM, and X-rays for Translational Research” (iNEXT) y su sucesor actual iNEXT-Discovery, se utilizan a menudo para estudiar las interacciones de numerosos compuestos con extremo detalle al tiempo que mejoran la afinidad y las propiedades farmacológicas de los golpes iniciales mediante varias rondas de química sintética1. Los compuestos de plomo que surgen de estas campañas “de golpe a plomo” se convierten en candidatos de desarrollo y entran en estudios preclínicos. La metodología de detección molecular bien desarrollada se puede clasificar aproximadamente en dos enfoques, a saber, el descubrimiento de plomo basado en ligandos (LBLD) y el descubrimiento de plomo basado en fragmentos (FBLD). En las campañas de LBLD, los receptores de proteínas se examinan con unos pocos miles de ligandos seleccionados a mano (basados en la estructura de los ligandos naturales o la estructura del objetivo), o con muchas decenas de miles de compuestos en bibliotecas de ligandos similares a medicamentos que cubren una gran parte del espacio químico.
Por lo general, los compuestos se prueban para su actividad inhibitoria en un ensayo de actividad, generalmente monitoreando una función enzimática. En las campañas FBLD2,3,4,5,sin embargo, algunos cientos de compuestos que suelen ser más pequeños que los medicamentos (100-200 Dalton) se prueban por su capacidad para unirse al objetivo directamente, sin el uso de un ensayo de actividad. Esta unión podría interferir con la actividad objetivo y puede medirse mediante muchos métodos biofísicos que informan directamente sobre la capacidad de los fragmentos para unirse al objetivo, o por métodos estructurales como la cristalografía de rayos X6 y la espectroscopia de resonancia magnética nuclear7,y más recientemente, también la microscopía crioeónica. Cuando los fragmentos se unen en diferentes lugares que están cerca uno del otro en la proteína, los diferentes fragmentos de unión, generalmente de baja afinidad, se pueden combinar racionalmente químicamente para crear un pequeño conjunto de pistas que se pueden estudiar con más detalle. Esto con frecuencia resulta en compuestos de mayor afinidad y más potentes, y esta metodología ha comenzado a producir moléculas importantes con potencial clínico. La elección de una biblioteca de fragmentos “ideal” que explote los grupos químicos de manera eficiente ha sido un área activa de investigación durante muchos años8,9,10.
Si bien el énfasis inicial se centró en cubrir todo el espacio químico, la atención posterior se centró en permitir que la combinación química aguas abajo de los impactos de fragmentos produjera compuestos de plomo. Tal investigación ha llevado a las llamadas bibliotecas “preparadas”. Estos contienen fragmentos con al menos un grupo funcional que permiten un seguimiento rápido y barato de la química sintética para un progreso eficiente en el estudio de SAR. Una de las actividades catalizadas por iNEXT fue actualizar la biblioteca preparada desarrollada por investigadores del Diamond Light Source and Structural Genomics Consortium. Este esfuerzo combinado dio como resultado la biblioteca DSi-Poised11,que también ha sido validada dentro de iNEXT12. Más tarde, esta biblioteca se alineó con la disponibilidad de compuestos en la base de datos REAL de Enamine Ltd., una organización de investigación química y productora de grandes colecciones de bloques de construcción y bibliotecas de compuestos para la detección. DSi-Poised ahora está disponible para cualquier persona para su compra, pero también está disponible en muchos laboratorios asociados de iNEXT-Discovery para proyectos de detección de fragmentos compatibles.
Las tecnologías de cristalografía de rayos X de alta gama y biología estructural de RMN tienen sus ventajas y desventajas para FBLD. Ambos requieren muestras de objetivos aisladas y producen los detalles atómicos de alta resolución que se requieren para FBLD. Sin embargo, los cristales son necesarios para la cristalografía de rayos X, y los fragmentos se unen a cavidades en las regiones de proteínas bien ordenadas que no están involucradas en la construcción de la red cristalina tridimensional. La RMN en solución a menudo produce diferentes impactos de la cristalografía de rayos X, ya que no se ve afectada por el entorno cristalino y es buena para detectar la unión también en regiones proteicas parcialmente ordenadas. Sin embargo, aunque los experimentos de RMN basados en ligandos son relativamente rápidos, todavía requieren una cantidad sustancial de tiempo y material y se pueden hacer rutinariamente solo para objetivos o dominios de proteínas relativamente pequeños. Con el propósito de priorizar compuestos para experimentos cristalográficos o de RMN, se han utilizado enfoques biofísicos13,14,15.
A medida que la instrumentación reciente y los protocolos computacionales permiten una detección cristalográfica eficiente para FBLD al determinar estructuras y analizar ~ 1,000 fragmentos de manera muy eficiente, esta priorización se ha vuelto menos esencial en la investigación basada en rayos X. Sin embargo, para la RMN, sigue siendo deseable utilizar experimentos más baratos y rápidos para priorizar la detección de la biblioteca y ahorrar tiempo del instrumento en los equipos de gama más alta. Al mismo tiempo, el uso de una combinación de tecnologías esencialmente diferentes puede proporcionar una confirmación independiente de eventos vinculantes, o incluso golpes adicionales que no se recogen empleando solo el método de cristalografía o RMN. Las técnicas cristalográficas y de RMN requieren equipos muy costosos y, a menudo, solo se pueden realizar en instalaciones externas dedicadas con la ayuda de expertos locales altamente calificados. Además, el análisis adecuado de los resultados también exige una gran experiencia. Si bien programas como iNEXT e iNEXT-Discovery están democratizando el acceso a tales instalaciones16, se ha reconocido que la detección de FBLD barata, rápida y de alto rendimiento por otros métodos puede alentar los programas de detección de drogas en una gama mucho más amplia de laboratorios. Tales resultados se pueden usar como una indicación para construir colaboraciones con químicos medicinales y priorizar los experimentos de detección más costosos a los compuestos más prometedores si las instalaciones de RMN y cristalografía imponen restricciones en el número de compuestos que se pueden examinar.
La TSA forma un método biofísico rápido, eficiente y relativamente barato y accesible17 que se puede utilizar para la detección de FBLD. Se ha utilizado en múltiples entornos, desde ayudar a encontrar condiciones proteicas estables para ensayos de cristalización18,hasta encontrar compuestos que se unen a objetivos específicos en las células19. Los AAST también se han utilizado para medir las constantes de disociación de las proteínas diana de unión a ligandos, ya que la unión a ligandos a menudo conduce a alteraciones en la estabilidad térmica. En todos los ATS, el cambio en la temperatura de desnaturalización de una proteína (su estabilidad) se mide en función de un aumento lento de la temperatura. Una forma eficiente de seguir la desnaturalización de proteínas al calentarse es mediante DSF o Thermofluor, que cuantifica el enfriamiento por fluorescencia de un colorante hidrófobo (típicamente naranja Sypro) tras la interacción con regiones hidrofóbicas expuestas de proteína que se despliega debido al aumento de la temperatura.
Nano-DSF se refiere típicamente a la medición de la estabilidad térmica de la proteína en ausencia de colorantes externos. Uno de los primeros instrumentos que ofreció esta posibilidad fue el OPTIM1000 que mide un amplio espectro de intensidad de luz, así como la dispersión de la luz de una muestra. Esta máquina permitió la medición simultánea del despliegue de proteínas (típicamente después de la fluorescencia de triptófano) y la agregación de proteínas (ya que las nanopartículas formadas resultan en un aumento de la dispersión de la luz a ~ 400 nm). Más tarde, el Prometheus introdujo el uso de la retrorreflectación para medir la agregación y la detección sensible de la señal de fluorescencia, permitiendo el cribado de bajas concentraciones de proteínas con buena sensibilidad20. En la siguiente sección se describe cómo se utilizó Prometheus para demostrar un protocolo de detección de fragmentos para detectar impactos para diferentes objetivos de proteínas. Una breve introducción sobre la calidad y cantidad de proteína esperada es seguida por un protocolo paso a paso para preparar, realizar y analizar los experimentos de detección de fragmentos. Los resultados de cribado de tres proteínas se han mostrado como datos de ejemplo obtenidos como parte de las colaboraciones iNEXT-Discovery.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe un método de rendimiento medio a alto para examinar bibliotecas de fragmentos utilizando algunos instrumentos comunes de robótica y medición. Las pantallas como las descritas en este protocolo pueden ser realizadas rutinariamente por la Instalación de Proteínas NKI en Ámsterdam, por ejemplo, como un servicio iNEXT-Discovery, a menudo incluso de forma gratuita para los usuarios después de la solicitud de propuesta y la revisión por pares. En tales casos, la biblioteca DSi-Poised puede ser proporcionada por la instalación, pero el uso de otras bibliotecas también se puede discutir en el contexto de cada aplicación de usuario diferente y acuerdo de servicio. La elección de los instrumentos en este protocolo representa soluciones prácticas para muchos laboratorios, pero no debe considerarse como un estándar de oro. Se recomiendan métodos sin etiquetas para medir la estabilidad térmica de la proteína objetivo para el cribado de fragmentos, en lugar de métodos que utilizan etiquetas ambientalmente sensibles para detectar el despliegue en un termociclador de reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa.
Los métodos sin etiquetas, como el que se presenta aquí utilizando el instrumento Prometheus, tienen algunas ventajas: utilizan bajas cantidades de proteína, a menudo un par de órdenes de magnitud menos; pueden utilizarse para medir simultáneamente la dispersión de la muestra y, por lo tanto, la agregación; y las etiquetas utilizadas para detectar el despliegue en otros enfoques pueden interactuar de manera diferente con cada fragmento, lo que resulta en artefactos de medición. Este protocolo se ha descrito en el contexto del robot Mosquito, que permite el pipeteo de un volumen muy pequeño de muestra (0,3 μL) que no se puede hacer manualmente. El Mosquito es un robot popular, presente en muchos laboratorios que trabajan en biología estructural y proyectos de descubrimiento de fármacos; sin embargo, el protocolo puede utilizar claramente enfoques alternativos para el pipeteo de bajo volumen.
Las bibliotecas de fragmentos contienen compuestos disueltos en DMSO. Uno de los desafíos iniciales es encontrar la concentración óptima de DMSO en la que la proteína permanezca estable y los compuestos permanezcan solubles. Esto implica realizar las mediciones a varias concentraciones de DMSO para determinar las condiciones óptimas para la detección. La dilución de proteína a fragmento utilizada aquí da como resultado concentraciones de DMSO de 0.2%; la mayoría de las proteínas son bastante estables en estas condiciones. La cantidad de proteína requerida para llevar a cabo el cribado para la biblioteca de 768 compuestos es de ~ 2-3 mg en total, ya que las mediciones se llevan a cabo típicamente a bajas concentraciones de proteínas (0.2 mg mL-1). Trabajar con concentraciones de proteínas relativamente bajas no solo reduce los costos de producción de proteínas, sino que también reduce las posibilidades de precipitación de proteínas. La baja concentración de proteínas no afecta la detección de la unión a fragmentos, ya que la concentración de los fragmentos en el experimento es de ~ 2 mM, lo que permite identificar también aglutinantes débiles.
Como la detección de transición de fusión en estos experimentos se basa en la intensidad de la fluorescencia, un aspecto crítico es determinar el poder de excitación del láser al que llevar a cabo las mediciones. La interacción de los compuestos con la proteína puede (i) no tener ningún efecto sobre su fluorescencia intrínseca, (ii) resultar en enfriamiento, o (iii) aumentar su fluorescencia intrínseca. Además de esto, trabajar con bajas concentraciones de proteínas significa que el recuento de fluorescencia para la proteína nativa sería bajo. Por lo tanto, la potencia de excitación debe ajustarse de tal manera que se puedan medir la mayoría de las muestras. El perfil de dispersión de cada ejecución proporciona información importante sobre los efectos de agregación que podrían desencadenarse por la adición de cualquier fragmento. Además, el efecto de la temperatura sobre la solubilidad del compuesto también se puede ver en el perfil de dispersión.
Inesperadamente, para muchos compuestos se observó que la dispersión en realidad disminuyó con el aumento de la temperatura(Figura 6). Por lo tanto, es importante observar tanto la curva de transición de fusión como el perfil de dispersión que lo acompaña para decidir sobre la confiabilidad de cada experimento, especialmente para aquellos fragmentos que se consideran candidatos para mediciones más exigentes por cristalografía de rayos X o espectroscopia de RMN, o incluso considerados como éxitos para la química de seguimiento. Una limitación específica del método para fines de detección de fragmentos es que muchos fragmentos en la biblioteca DSi-Poised tienen una fluorescencia intrínseca significativa, a veces incluso más allá del límite de saturación del detector, y por lo tanto estos no pueden ser examinados adecuadamente para la unión al objetivo incluso a baja potencia de excitación. Otro punto a tener en cuenta para este método es que solo se puede usar con proteínas que contienen residuos de triptófano.
Figura 6: Efecto de la temperatura sobre la solubilidad del compuesto. Curva de transición de fusión y perfil de dispersión de Hec1 con dos compuestos diferentes. (A) El perfil de dispersión muestra que para esta muestra, la solubilidad no se ve afectada por la temperatura. (B) El perfil de dispersión muestra que la solubilidad de esta muestra aumenta con el aumento de la temperatura. Por lo tanto, la curva de transición de fusión en este caso no es confiable. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Una pregunta abierta es qué debe considerarse como un cambio significativo en Tm,no desde una perspectiva matemática, sino desde el punto de vista práctico: ¿qué cambio en Tm es importante considerar como indicativo de la unión de un ligando a una proteína? En estos ejemplos, se observan desplazamientos de menos de 1 °C para el 74% de los fragmentos para la unión de Hec1, el 66% para Mps1 y el 53% para Nsp5. Considerar 1 °C como “cambio significativo” difícilmente proporcionaría golpes que sean dignos de perseguir mediante la química de seguimiento. En los gráficos generales(Figura 5),se consideraron contenedores de 1, 2, 5 o más de 5 grados de desplazamiento de Tm, ya sea positivo o negativo. Esto requiere modificación de acuerdo a cada caso específico para dar una buena visión general y permitir una toma de decisiones informada, determinando el siguiente paso. En particular, para algunas proteínas, se observaron tanto la estabilización como la deseses estabilización del objetivo dependiendo de los fragmentos considerados. Ambos eventos son interesantes, ya que ambos pueden ser el resultado de la unión de fragmentos, y ambos pueden conducir a una buena molécula de seguimiento para manipular el comportamiento de la proteína.
Queda una última pregunta, a saber, “¿qué define un éxito útil?”. De hecho, la respuesta depende de la situación específica. Por ejemplo, para Hec1, todos los fragmentos que estabilizan la proteína en más de 2 grados o la desestabilizan en más de 5 fueron comunicados a nuestros colaboradores de química, quienes diseñaron nuevas moléculas basadas en estos golpes. Para Nsp5, sin embargo, los golpes más desestabilizadores se comunicaron a nuestros colaboradores de RMN para confirmar los golpes derivados de nanoDSF con experimentos de RMN. En otras palabras, los resultados de cribado obtenidos de este protocolo deben analizarse con precaución y de manera dependiente del contexto, tomando decisiones informadas basadas en la pregunta específica y la metodología circundante. En cualquier caso, el método descrito aquí es un enfoque complementario a las metodologías existentes, como la detección basada en rayos X y RMN, que puede tener como objetivo confirmar, priorizar o dar nuevas ideas para las campañas de química.
Tabla suplementaria S1: Lista de tampones utilizados para el cribado de proteínas. Abreviaturas: HEPES = ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinatanosulfónico; TDT = ditiothreitol; MOBS = ácido 4-(N-morfolino)butanosulfónico. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla suplementaria S2: Propiedades de la placa MRC de 2 pomos para su uso con el robot nanodispensador. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla suplementaria S3: Propiedades de la placa de fondo en V de 96 podos para su uso con el robot nanodispensador. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Tabla suplementaria S4: El tampón, la concentración de proteínas y Tm de las proteínas discutidas en resultados representativos. Abreviaturas: TDT = ditiothreitol; Hec1 = Proteína altamente expresada en cáncer 1; Mps1 = quinasa monopolar del huso 1; Nsp5 = proteasa similar al SARS-CoV-2 3C. Haga clic aquí para descargar esta tabla.
Archivo suplementario 1: Parámetros generales-datos de ejemplo. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Archivo suplementario 2: valores Tm y ΔTm para 406 fragmentos-datos de ejemplo. Haga clic aquí para descargar este archivo.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
“Este trabajo se benefició del acceso a NKI Protein Facility, un centro Instruct-ERIC. El apoyo financiero ha sido proporcionado por iNEXT, proyecto número 653706, e iNEXT-Discovery, proyecto número 871037, financiado por el programa Horizonte 2020 de la Comisión Europea”.
Materials
| ClearVue Sheets | Molecular Dimensions | adhesive sealing film for protein plate | |
| CORNING 6570 Aluminium Sealing Tape | CORNING | adhesive sealing film for fragment plate | |
| DSi poised library | Enamine | Fragment library containing 768 compounds used in this study | |
| Elisa Reagent Reservior | ThermoFisher Scientific | 15075 | Reagent reservior used for pipetting the protein |
| Greiner round (U) bottom plates | Cat. No. 650201 | Fragments supplied in these plates | |
| Mosquito type X1 | sptlabtech | Part nr- 3019-0003 | Nanolitre dispenser |
| MRC 2-well crystallization plate | MRC96T-PS | ||
| Pierce ELISA Reagent Reservoirs | Pierce | ||
| Prometheus High Sensitivity capillaries | Catalog PR-C006 | ||
| Prometheus NT.48 nanoDSF | Nanotemper | Catalog nr PR001 (+ Aggregation Detection Optics, catalog nr PR-AGO) | nanoDSF and light back scattering |
| Prometheus Standard capillary type | Catalog PR-C002 | ||
| TX-1000 | Thermoscientific | Centrifuge for plates | |
References
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