Fluorimétrie à balayage nano-différentiel pour le criblage dans la découverte de plomb à base de fragments
Summary
La surveillance des changements dans la température de fusion d’une protéine cible(c.-à-d.essai de décalage thermique, TSA) est une méthode efficace pour filtrer les bibliothèques de fragments de quelques centaines de composés. Nous présentons un protocole TSA mettant en œuvre la fluorimétrie à balayage nano-différentiel assistée par robotique (nano-DSF) pour surveiller la fluorescence intrinsèque du tryptophane et la rétrodiffusion de la lumière pour le criblage des fragments.
Abstract
Les essais de décalage thermique (TSA) examinent comment la température de fusion (Tm)d’une protéine cible change en réponse aux changements de son environnement(par exemple,la composition tampon). L’utilité de la TSA, et en particulier de la nano-fluorimétrie différentielle à balayage (nano-DSF), a été établie au fil des ans, à la fois pour trouver des conditions qui aident à stabiliser une protéine spécifique et pour examiner la liaison au ligand en surveillant les changements dans le Tmapparent. Cet article présente un criblage efficace de la bibliothèque de fragments Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) (768 composés) par l’utilisation de nano-DSF, en surveillant Tm pour identifier la liaison potentielle des fragments. Les conditions préalables concernant la qualité et la concentration des protéines pour effectuer des expériences nano-DSF sont brièvement décrites, suivies d’un protocole étape par étape qui utilise un distributeur robotique de nano litres couramment utilisé dans les laboratoires de biologie structurale pour préparer les échantillons requis dans des plaques de 96 puits. Le protocole décrit comment les mélanges de réactifs sont transférés aux capillaires nécessaires aux mesures nano-DSF. En outre, cet article fournit des protocoles pour mesurer la dénaturation thermique (surveillance de la fluorescence intrinsèque du tryptophane) et l’agrégation (surveillance de la rétrodiffusion de la lumière) et les étapes ultérieures pour le transfert et l’analyse des données. Enfin, des expériences de criblage avec trois cibles protéiques différentes sont discutées pour illustrer l’utilisation de cette procédure dans le contexte de campagnes de découverte de plombs. Le principe général de la méthode décrite peut être facilement transféré à d’autres bibliothèques de fragments ou adapté à d’autres instruments.
Introduction
Les programmes de découverte de médicaments commencent souvent par le dépistage des composés chimiques pour leur capacité à interagir avec et/ou à modifier la fonction des cibles médicamenteuses, le plus souvent des protéines. Les soi-disant « hits » que l’on trouve dans ces écrans jettent les bases de la découverte de nouvelles pistes et de nouveaux candidats au développement, ainsi que de la plupart des nouveaux médicaments qui sont autorisés ces jours-ci. La disponibilité de méthodes à haut débit est donc indispensable pour filtrer un nombre énorme de cibles disponibles avec un grand nombre de composés différents afin d’identifier rapidement leur liaison étroite ou leur capacité à moduler une fonction spécifique de la cible. Une fois les résultats identifiés, les combinaisons hit-cible les plus prometteuses sont poussées dans un vaste pipeline de développement de médicaments à l’aide d’autres technologies, souvent coûteuses et chronophages, pour comprendre les « relations structure-activité » (SAR).
Les approches de biologie structurale, telles que celles proposées par les programmes d’accès financés par l’UE « Infrastructure for NMR, EM, and X-rays for Translational Research » (iNEXT) et son successeur actuel iNEXT-Discovery, sont souvent utilisées pour étudier les interactions de nombreux composés dans les moindres détails tout en améliorant l’affinité et les propriétés pharmacologiques des premiers coups par généralement plusieurs cycles de chimie synthétique1. Les composés de plomb qui émergent de ces campagnes « de coup en plomb » deviennent des candidats au développement et entrent dans des études précliniques. La méthodologie de criblage moléculaire bien développée peut être grossièrement classée en deux approches, à savoir la découverte de plomb basée sur des ligands (LBLD) et la découverte de plomb basée sur des fragments (FBLD). Dans les campagnes LBLD, les récepteurs protéiques sont criblés soit avec quelques milliers de ligands triés sur le main (en fonction de la structure des ligands naturels ou de la structure de la cible), soit avec plusieurs dizaines de milliers de composés dans des bibliothèques de ligands de type médicament qui couvrent une grande partie de l’espace chimique.
Habituellement, les composés sont testés pour leur activité inhibitrice dans un test d’activité, généralement la surveillance d’une fonction enzymatique. Dans les campagnes FBLD2,3,4,5, cependant, quelques centaines de composés qui sont généralement plus petits que les médicaments (100-200 Dalton) sont testés pour leur capacité à lier la cible directement, sans l’utilisation d’un test d’activité. Cette liaison pourrait interférer avec l’activité de la cible et peut être mesurée par de nombreuses méthodes biophysiques qui rendent compte directement de la capacité des fragments à se lier à la cible, ou par des méthodes structurelles telles que la cristallographie aux rayons X6 et la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire7, et plus récemment, aussi la cryo-microscopie électronique. Lorsque des fragments se lient à différents endroits proches les uns des autres sur la protéine, les différents fragments de liaison, généralement de faible affinité, peuvent être combinés chimiquement rationnellement pour créer un petit ensemble de pistes qui peuvent être étudiées plus en détail. Il en résulte souvent des composés plus puissants et à plus grande affinité, et cette méthodologie a commencé à produire des molécules importantes ayant un potentiel clinique. Le choix d’une bibliothèque de fragments « idéale » qui exploite efficacement les groupes chimiques est un domaine de recherche actif depuis de nombreuses années8,9,10.
Alors que l’accent initial était mis sur la couverture de l’espace chimique complet, l’attention s’est ensuite concentrée sur la possibilité pour la combinaison chimique en aval de fragments de produire des composés de plomb. De telles recherches ont conduit aux bibliothèques dites « posées ». Ceux-ci contiennent des fragments avec au moins un groupe fonctionnel qui permettent un suivi rapide et peu coûteux de la chimie synthétique pour des progrès efficaces dans l’étude du SAR. L’une des activités catalysées par iNEXT consistait à mettre à jour la bibliothèque développée par les chercheurs du Diamond Light Source and Structural Genomics Consortium. Cet effort combiné a abouti à la bibliothèque DSi-Poised11, qui a également été validée dans iNEXT12. Plus tard, cette bibliothèque a été alignée sur la disponibilité des composés dans la base de données REAL d’Enamine Ltd., un organisme de recherche chimique et producteur de grandes collections de blocs de construction et de bibliothèques de composés pour le criblage. DSi-Poised est désormais disponible à l’achat pour tous, mais également dans de nombreux laboratoires partenaires d’iNEXT-Discovery pour des projets de criblage de fragments soutenus.
Les technologies haut de gamme de cristallographie aux rayons X et de biologie structurale RMN ont toutes deux leurs avantages et leurs inconvénients pour FBLD. Les deux nécessitent des échantillons cibles isolés et fournissent les détails atomiques à haute résolution requis pour FBLD. Cependant, les cristaux sont nécessaires à la cristallographie aux rayons X, et les fragments se lient aux cavités dans les régions protéiques bien ordonnées qui ne sont pas impliquées dans la construction du réseau cristallin tridimensionnel. La RMN en solution donne souvent des résultats différents de la cristallographie aux rayons X, car elle n’est pas affectée par l’environnement cristallin et est bonne pour détecter la liaison également dans les régions protéiques partiellement ordonnées. Cependant, bien que les expériences de RMN à base de ligands soient relativement rapides, elles nécessitent encore beaucoup de temps et de matériel et ne peuvent être effectuées que pour des cibles ou des domaines protéiques relativement petits. Dans le but de hiérarchiser les composés pour les expériences cristallographiques ou RMN, des approches biophysiques ont été utilisées13,14,15.
Comme l’instrumentation récente et les protocoles de calcul permettent un criblage cristallographique efficace pour FBLD en déterminant les structures et en analysant ~ 1 000 fragments très efficacement, cette priorisation est devenue moins essentielle dans la recherche basée sur les rayons X. Pour la RMN, cependant, il reste souhaitable d’utiliser des expériences moins chères et plus rapides pour prioriser le criblage des bibliothèques et faire gagner du temps sur les instruments sur les équipements haut de gamme. Dans le même temps, l’utilisation d’une combinaison de technologies essentiellement différentes peut fournir une confirmation indépendante des événements de liaison, ou même des résultats supplémentaires qui ne sont pas captés en utilisant uniquement la méthode de cristallographie ou de RMN. Les techniques cristallographiques et RMN nécessitent toutes deux un équipement très coûteux et ne peuvent souvent être effectuées que dans des installations externes dédiées avec l’aide d’experts locaux hautement qualifiés. En outre, l’analyse correcte des résultats exige également une grande expertise. Alors que des programmes tels que iNEXT et iNEXT-Discovery démocratisent l’accès à de telles installations16, il a été reconnu que le dépistage des FBLD bon marché, rapide et à haut débit par d’autres méthodes peut encourager les programmes de dépistage des drogues dans un éventail beaucoup plus large de laboratoires. De tels résultats peuvent ensuite être utilisés comme indication pour établir des collaborations avec des chimistes médicinaux et pour donner la priorité aux expériences de dépistage les plus coûteuses aux composés les plus prometteurs si les installations de RMN et de cristallographie imposent des restrictions sur le nombre de composés pouvant être criblages.
La TSA forme une méthode biophysique rapide, efficace et relativement bon marché et accessible17 qui peut être utilisée pour le dépistage des FBLD. Il a été utilisé dans de multiples contextes, de l’aide à la recherche de conditions protéiques stables pour les essais de cristallisation18, à la recherche de composés qui se lient à des cibles spécifiques dans les cellules19. Les TSA ont également été utilisés pour mesurer les constantes de dissociation des ligands liant les protéines cibles, car la liaison aux ligands entraîne souvent des altérations de la stabilité thermique. Dans tous les TSA, le changement de température de dénaturation d’une protéine (sa stabilité) est mesuré en fonction d’une augmentation lente de la température. Un moyen efficace de suivre la dénaturation des protéines lors du chauffage est le DSF ou le Thermofluor, qui quantifie la trempe par fluorescence d’un colorant hydrophobe (typiquement Sypro Orange) lors de l’interaction avec les régions hydrophobes exposées de la protéine qui se déploie en raison de l’augmentation de la température.
Nano-DSF fait généralement référence à la mesure de la stabilité thermique des protéines en l’absence de colorants externes. L’un des premiers instruments qui offrait cette possibilité était l’OPTIM1000 qui mesure un large spectre d’intensité lumineuse ainsi que la diffusion de la lumière d’un échantillon. Cette machine a permis la mesure simultanée du déploiement des protéines (généralement après la fluorescence du tryptophane) et de l’agrégation des protéines (car les nanoparticules formées entraînent une augmentation de la diffusion de la lumière à ~ 400 nm). Plus tard, le Prometheus a introduit l’utilisation de la rétroréflexion pour mesurer l’agrégation et la détection sensible du signal de fluorescence, permettant le criblage de faibles concentrations de protéines avec une bonne sensibilité20. La section suivante décrit comment Prometheus a été utilisé pour démontrer un protocole de criblage de fragments pour détecter les résultats pour différentes cibles protéiques. Une brève introduction sur la qualité et la quantité attendues des protéines est suivie d’un protocole étape par étape pour la préparation, l’exécution et l’analyse des expériences de criblage de fragments. Les résultats du dépistage de trois protéines ont été présentés comme des exemples de données obtenues dans le cadre des collaborations iNEXT-Discovery.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole décrit une méthode de débit moyen à élevé pour le criblage des bibliothèques de fragments à l’aide de certains instruments robotiques et de mesure courants. Des écrans comme ceux décrits dans ce protocole peuvent être effectués régulièrement par le NKI Protein Facility à Amsterdam, par exemple en tant que service iNEXT-Discovery, souvent même gratuitement pour les utilisateurs après la demande de proposition et l’examen par les pairs. Dans de tels cas, la bibliothèque DSi-Poised peut être fournie par l’installation, mais l’utilisation d’autres bibliothèques peut également être discutée dans le contexte de chaque application utilisateur et contrat de service différent. Le choix des instruments dans ce protocole représente des solutions pratiques pour de nombreux laboratoires, mais ne doit pas être considéré comme un étalon-or. Des méthodes sans étiquette sont recommandées pour mesurer la stabilité thermique de la protéine cible pour le criblage des fragments, plutôt que des méthodes qui utilisent des étiquettes sensibles à l’environnement pour détecter le déploiement dans un thermocycleur à réaction en chaîne par polymérase à transcription inverse.
Les méthodes sans étiquette, telles que celle présentée ici à l’aide de l’instrument Prometheus, présentent certains avantages: elles utilisent de faibles quantités de protéines, souvent quelques ordres de grandeur de moins; ils peuvent être utilisés pour mesurer simultanément la diffusion de l’échantillon et donc l’agrégation; et les étiquettes utilisées pour détecter le déroulement dans d’autres approches peuvent interagir différemment avec chaque fragment, ce qui donne des artefacts de mesure. Ce protocole a été décrit dans le contexte du robot Mosquito, qui permet le pipetage d’un très petit volume d’échantillon (0,3 μL) qui ne peut pas être fait manuellement. Le Mosquito est un robot populaire, présent dans de nombreux laboratoires travaillant sur des projets de biologie structurale et de découverte de médicaments; cependant, le protocole peut clairement utiliser d’autres approches pour le pipetage à faible volume.
Les bibliothèques de fragments contiennent des composés dissous dans le DMSO. L’un des défis initiaux est de trouver la concentration optimale de DMSO à laquelle la protéine reste stable et les composés restent solubles. Cela implique d’effectuer les mesures à différentes concentrations de DMSO afin de déterminer les conditions optimales pour le dépistage. La dilution protéine-fragment utilisée ici donne des concentrations de DMSO de 0,2%; la plupart des protéines sont assez stables dans ces conditions. La quantité de protéines nécessaire pour effectuer le criblage de la bibliothèque de composés 768 est d’environ 2-3 mg au total, car les mesures sont généralement effectuées à de faibles concentrations de protéines (0,2 mg mL-1). Travailler avec de telles concentrations de protéines relativement faibles réduit non seulement les coûts de production de protéines, mais réduit également les chances de précipitation des protéines. La faible concentration en protéines n’affecte pas la détection de la liaison des fragments, car la concentration des fragments dans l’expérience est d’environ 2 mM, ce qui permet également d’identifier les liants faibles.
Comme la détection de la transition de fusion dans ces expériences est basée sur l’intensité de la fluorescence, un aspect critique est de déterminer la puissance d’excitation du laser à laquelle effectuer les mesures. L’interaction des composés avec la protéine peut (i) n’avoir aucun effet sur sa fluorescence intrinsèque, (ii) entraîner une trempe, ou (iii) augmenter sa fluorescence intrinsèque. En plus de cela, travailler avec de faibles concentrations de protéines signifie que le nombre de fluorescence pour la protéine native serait faible. La puissance d’excitation doit donc être ajustée de manière à ce que la plupart des échantillons puissent être mesurés. Le profil de diffusion de chaque exécution fournit des informations importantes sur les effets d’agrégation qui peuvent être déclenchés par l’ajout d’un fragment. En outre, l’effet de la température sur la solubilité des composés peut également être observé sur le profil de diffusion.
De manière inattendue, pour de nombreux composés, il a été observé que la diffusion diminuait en fait avec l’augmentation de la température(Figure 6). Il est donc important d’examiner à la fois la courbe de transition de fusion et le profil de diffusion qui l’accompagne pour décider de la fiabilité de chaque expérience, en particulier pour les fragments considérés comme candidats à des mesures plus exigeantes par cristallographie aux rayons X ou spectroscopie RMN, ou même considérés comme des succès pour la chimie de suivi. Une limitation spécifique de la méthode à des fins de criblage de fragments est que de nombreux fragments de la bibliothèque DSi-Poised ont une fluorescence intrinsèque importante, parfois même au-delà de la limite de saturation du détecteur, et ne peuvent donc pas être correctement filtrés pour la liaison de la cible, même à faible puissance d’excitation. Un autre point à noter pour cette méthode est qu’elle ne peut être utilisée qu’avec des protéines contenant des résidus de tryptophane.
Figure 6: Effet de la température sur la solubilité des composés. Courbe de transition de fusion et profil de diffusion de Hec1 avec deux composés différents. (A) Le profil de diffusion montre que pour cet échantillon, la solubilité n’est pas affectée par la température. (B) Le profil de diffusion montre que la solubilité de cet échantillon augmente avec l’augmentation de la température. La courbe de transition de fusion dans ce cas n’est donc pas fiable. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Une question ouverte est de savoir ce qui devrait être considéré comme un changement significatif dans Tm,non pas d’un point de vue mathématique, mais du point de vue pratique: quel changement dans Tm est important à considérer comme indicatif de la liaison d’un ligand à une protéine? Dans ces exemples, des décalages inférieurs à 1 °C sont observés pour 74 % des fragments pour la liaison Hec1, 66 % pour Mps1 et 53 % pour Nsp5. Considérer 1 °C comme un « changement significatif » ne fournirait guère de résultats dignes d’être poursuivis par la chimie de suivi. Dans les graphiques d’ensemble(figure 5),des bacs de 1, 2, 5 ou plus de 5 degrés de décalage Tm, positifs ou négatifs, ont été pris en compte. Cela nécessite des modifications en fonction de chaque cas spécifique pour donner une bonne vue d’ensemble et permettre une prise de décision éclairée, déterminant l’étape suivante. Notamment, pour certaines protéines, la stabilisation et la déstraitaissation de la cible ont été observées en fonction des fragments considérés. Les deux événements sont intéressants, car les deux peuvent être le résultat de la liaison de fragments, et les deux peuvent conduire à une bonne molécule de suivi pour manipuler le comportement des protéines.
Une dernière question demeure, à savoir, « qu’est-ce qui définit un hit utile? ». En fait, la réponse dépend de la situation spécifique. Par exemple, pour Hec1, tous les fragments qui stabilisent la protéine de plus de 2 degrés ou la déstabilisent de plus de 5 ont été communiqués à nos collaborateurs de chimie, qui ont conçu de nouvelles molécules à base de ces hits. Pour Nsp5, cependant, les résultats les plus déstabilisateurs ont été communiqués à nos collaborateurs RMN pour confirmer les résultats dérivés de nanoDSF avec des expériences rmnatives. En d’autres termes, les résultats de dépistage obtenus à partir de ce protocole doivent être analysés avec prudence et d’une manière dépendante du contexte, en prenant des décisions éclairées en fonction de la question spécifique et de la méthodologie environnante. Dans tous les cas, la méthode décrite ici est une approche complémentaire aux méthodologies existantes telles que le dépistage par rayons X et RMN, qui peut viser à confirmer, hiérarchiser ou donner de nouvelles idées pour des campagnes de chimie.
Tableau supplémentaire S1 : Liste des tampons utilisés pour le criblage des protéines. Abréviations : HEPES = acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique; TNT = dithiothréitol; MOBS = acide 4-(N-morpholino)butanesulfonique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau supplémentaire S2: Propriétés de la plaque MRC à 2 puits à utiliser avec un robot nanodispenseur. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau supplémentaire S3: Propriétés de la plaque à fond en V à 96 puits pour une utilisation avec un robot nanodispenseur. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Tableau supplémentaire S4 : Le tampon,la concentration en protéines et le Tm des protéines discutés dans les résultats représentatifs. Abréviations : TNT = dithiothréitol; Hec1 = Hautement exprimé dans la protéine Cancer 1; Mps1 = kinase monopolaire du fuseau 1; Nsp5 = PROTÉASE DE TYPE 3C du SRAS-CoV-2. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Fichier supplémentaire 1: Paramètres de présentation–exemples de données. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 2 : valeurs Tm et ΔTm pour 406 fragments – exemples de données. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
« Ce travail a bénéficié de l’accès à l’installation de protéines NKI, un centre Instruct-ERIC. Le soutien financier a été fourni par iNEXT, numéro de projet 653706, et iNEXT-Discovery, numéro de projet 871037, financé par le programme Horizon 2020 de la Commission européenne ».
Materials
| ClearVue Sheets | Molecular Dimensions | adhesive sealing film for protein plate | |
| CORNING 6570 Aluminium Sealing Tape | CORNING | adhesive sealing film for fragment plate | |
| DSi poised library | Enamine | Fragment library containing 768 compounds used in this study | |
| Elisa Reagent Reservior | ThermoFisher Scientific | 15075 | Reagent reservior used for pipetting the protein |
| Greiner round (U) bottom plates | Cat. No. 650201 | Fragments supplied in these plates | |
| Mosquito type X1 | sptlabtech | Part nr- 3019-0003 | Nanolitre dispenser |
| MRC 2-well crystallization plate | MRC96T-PS | ||
| Pierce ELISA Reagent Reservoirs | Pierce | ||
| Prometheus High Sensitivity capillaries | Catalog PR-C006 | ||
| Prometheus NT.48 nanoDSF | Nanotemper | Catalog nr PR001 (+ Aggregation Detection Optics, catalog nr PR-AGO) | nanoDSF and light back scattering |
| Prometheus Standard capillary type | Catalog PR-C002 | ||
| TX-1000 | Thermoscientific | Centrifuge for plates | |
References
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