قياس فلوري المسح الضوئي النانوي للفحص في اكتشاف الرصاص القائم على الشظايا
Summary
رصد التغيرات في درجة حرارة ذوبان البروتين المستهدف(أي،المقايسة التحول الحراري، TSA) هو وسيلة فعالة لفحص مكتبات جزء من بضع مئات من المركبات. نحن نقدم بروتوكول TSA تنفيذ الروبوتات بمساعدة نانو التفاضلية المسح الفلوري (نانو DSF) لرصد التربتوفان المفلورة الجوهرية والضوء التشتت الخلفي لفحص جزء.
Abstract
تفحص مقايسات التحول الحراري (TSAs) كيفية تغير درجة حرارة ذوبان البروتين المستهدف (Tm)استجابة للتغيرات في بيئته(على سبيل المثال،تكوين العازلة). وقد أنشئت فائدة TSA، وتحديدا من نانو التفاضلية المسح الفلوري (نانو DSF)، على مر السنين، سواء لإيجاد الظروف التي تساعد على استقرار بروتين معين والنظر في الربط ليغاند من خلال رصد التغيرات في Tمواضح . تقدم هذه الورقة فحصا فعالا لمكتبة شظايا Diamond-SGC-iNEXT Poised (DSi-Poised) (768 مركبا) باستخدام نانو-DSF، ورصد Tm لتحديد الربط المحتمل للشظايا. وترد المتطلبات الأساسية فيما يتعلق بجودة البروتين وتركيزه لإجراء تجارب نانو-DSF بإيجاز متبوعا ببروتوكول خطوة بخطوة يستخدم موزع روبوتي سعة نانو لتر يستخدم عادة في مختبرات البيولوجيا الهيكلية لإعداد العينات المطلوبة في لوحات 96 بئرا. يصف البروتوكول كيفية نقل الخلائط الكاشفة إلى الشعيرات الدموية اللازمة لقياسات نانو DSF. وبالإضافة إلى ذلك، توفر هذه الورقة بروتوكولات لقياس التشبع الحراري (رصد تفلور التربتوفان الجوهري) والتجميع (رصد تشتت الضوء الخلفي) والخطوات اللاحقة لنقل البيانات وتحليلها. وأخيرا، تناقش تجارب الفحص مع ثلاثة أهداف بروتين مختلفة لتوضيح استخدام هذا الإجراء في سياق حملات اكتشاف الرصاص. ويمكن نقل المبدأ العام للطريقة الموصوفة بسهولة إلى مكتبات أجزاء أخرى أو تكييفه مع صكوك أخرى.
Introduction
غالبا ما تبدأ برامج اكتشاف الأدوية بفحص المركبات الكيميائية لقدرتها على التفاعل مع و / أو تعديل وظيفة أهداف الأدوية ، في معظم الأحيان البروتينات. ما يسمى “الزيارات” الموجودة في مثل هذه الشاشات ، تضع الأساس لاكتشاف خيوط جديدة والمرشحين للتنمية ، وبالنسبة لمعظم الأدوية الجديدة التي يتم ترخيصها في هذه الأيام. ولذلك، فإن توافر أساليب عالية الإنتاجية أمر لا غنى عنه لفحص عدد هائل من الأهداف المتاحة بعدد كبير من المركبات المختلفة لتحديد ربطها الضيق بسرعة أو قدرتها على تعديل وظيفة محددة للهدف. وبعد تحديد الزيارات، تدفع المجموعات الواعدة من الأهداف المستهدفة إلى خط أنابيب واسع النطاق لتطوير العقاقير باستخدام تكنولوجيات أخرى، غالبا ما تكون مكلفة وتستغرق وقتا طويلا، لفهم “العلاقات بين الهيكل والنشاط”.
غالبا ما تستخدم نهج البيولوجيا الهيكلية ، مثل تلك التي تقدمها برامج الوصول الممولة من الاتحاد الأوروبي “البنية التحتية ل NMR و EM والأشعة السينية للأبحاث التحويلية” (iNEXT) وخليفتها الحالي iNEXT-Discovery ، لدراسة تفاعلات العديد من المركبات بالتفصيل الشديد مع تحسين التقارب والخصائص الدوائية للزيارات الأولية من خلال عدة جولات من الكيمياء الاصطناعية1. وتصبح مركبات الرصاص التي تنشأ عن هذه الحملات “من الضرب إلى القيادة” مرشحة للتنمية وتدخل في دراسات ما قبل السريرية. ويمكن تصنيف منهجية الفحص الجزيئي المتطورة إلى نهجين تقريبا، هما اكتشاف الرصاص القائم على الليغند (LBLD) واكتشاف الرصاص القائم على الشظايا (FBLD). في حملات LBLD ، يتم فحص مستقبلات البروتين إما ببضعة آلاف من الليغندات الملقاة يدويا (استنادا إلى بنية الليغند الطبيعي أو بنية الهدف) ، أو مع عشرات الآلاف من المركبات في مكتبات ligand الشبيهة بالمخدرات التي تغطي جزءا كبيرا من المساحة الكيميائية.
عادة، يتم اختبار المركبات لنشاطها المثبطة في مقايسة النشاط، ورصد عادة وظيفة الأنزيمية. في حملات FBLD2،3،4،5، ومع ذلك ، يتم اختبار بعض مئات المركبات التي عادة ما تكون أصغر من المخدرات (100-200 دالتون) لقدرتها على ربط الهدف مباشرة ، دون استخدام فحص النشاط. يمكن أن تتداخل هذه الربطة مع النشاط المستهدف ويمكن قياسها بالعديد من الأساليب الفيزيائية الحيوية التي تقدم تقارير مباشرة عن قدرة الشظايا على الارتباط بالهدف ، أو بالطرق الهيكلية مثل التصوير البلوري بالأشعة السينية6 ومطياف الرنين المغناطيسي النووي7، ومؤخرا ، أيضا المجهر الإلكتروني المبرد. عندما ترتبط الشظايا في مواقع مختلفة قريبة من بعضها البعض على البروتين ، يمكن الجمع بين الأجزاء المختلفة ، وعادة ما تكون منخفضة التقارب ملزمة كيميائيا لإنشاء مجموعة صغيرة من الخيوط التي يمكن دراستها بمزيد من التفصيل. وهذا يؤدي في كثير من الأحيان إلى مركبات أعلى تقاربا وأكثر فعالية ، وقد بدأت هذه المنهجية في إنتاج جزيئات مهمة ذات إمكانات سريرية. اختيار “مثالية” مكتبة جزء يستغل المجموعات الكيميائية بكفاءة كان مجالا نشطا للبحث لسنوات عديدة8،9،10.
وفي حين كان التركيز الأولي على تغطية الحيز الكيميائي الكامل، تركز الاهتمام اللاحق على تمكين التركيبة الكيميائية في المصب من ضربات الشظايا من إنتاج مركبات الرصاص. وقد أدت هذه البحوث إلى ما يسمى بالمكتبات “المتأهبة”. تحتوي هذه الشظايا على أجزاء مع مجموعة وظيفية واحدة على الأقل تسمح بالمتابعة السريعة ورخيصة للكيمياء الاصطناعية لتحقيق تقدم فعال في دراسة البحث والإنقاذ. وكان أحد الأنشطة التي حفزتها iNEXT هو تحديث المكتبة التي يستعد لها الباحثون في مصدر الضوء الماسي واتحاد الجينوم الهيكلي. هذا الجهد المشترك أدى إلى مكتبة DSi-Poised11، والتي تم التحقق من صحتها أيضا داخل iNEXT12. وفي وقت لاحق، تمت مواءمة هذه المكتبة مع توافر المركبات في قاعدة بيانات REAL من Enamine Ltd.، وهي منظمة أبحاث كيميائية ومنتجة لمجموعات كبيرة من لبنات البناء والمكتبات المركبة للفحص. DSi-Poised متاح الآن لأي شخص للشراء ، ولكنه متاح أيضا في العديد من مختبرات شريك iNEXT-Discovery لمشاريع فحص الأجزاء المدعومة.
إن تقنيات علم البلورات بالأشعة السينية المتطورة وتقنيات البيولوجيا الهيكلية NMR لها مزاياها وعيوبها بالنسبة ل FBLD. وكلاهما يتطلب عينات هدف معزولة ويسفر عن التفاصيل الذرية عالية الدقة المطلوبة ل FBLD. ومع ذلك ، فإن البلورات ضرورية لتصوير البلورات بالأشعة السينية ، وترتبط الشظايا بتجاويف في مناطق البروتين مرتبة جيدا والتي لا تشارك في بناء شعرية الكريستال ثلاثية الأبعاد. الحل NMR غالبا ما تسفر عن ضربات مختلفة من التصوير البلوري بالأشعة السينية، كما أنها لا تتأثر بالبيئة البلورية وجيدة في الكشف عن ملزمة أيضا في مناطق البروتين أمرت جزئيا. ومع ذلك ، في حين أن تجارب NMR المستندة إلى ligand سريعة نسبيا ، إلا أنها لا تزال تتطلب قدرا كبيرا من الوقت والمواد ويمكن القيام بها بشكل روتيني فقط لأهداف أو مجالات البروتين الصغيرة نسبيا. لغرض إعطاء الأولوية للمركبات لتجارب كريستالية أو NMR ، تم استخدام النهج الفيزيائية الحيوية13،14،15.
وبما أن الأجهزة الحديثة والبروتوكولات الحسابية تسمح بالفحص البلوري الفعال ل FBLD من خلال تحديد الهياكل وتحليل ~ 1000 جزء بكفاءة عالية ، فقد أصبح ترتيب الأولويات هذا أقل أهمية في الأبحاث القائمة على الأشعة السينية. غير أنه بالنسبة ل NMR، لا يزال من المستصوب استخدام تجارب أرخص وأسرع لتحديد أولويات فحص المكتبات وتوفير وقت الأجهزة على المعدات الراقية. وفي الوقت نفسه، يمكن أن يوفر استخدام مزيج من التكنولوجيات المختلفة أساسا تأكيدا مستقلا للأحداث الملزمة، أو حتى ضربات إضافية لا يتم التقاطها باستخدام طريقة علم البلورات أو NMR فقط. تتطلب تقنيات كريستالوغرافية وNMR معدات باهظة الثمن ولا يمكن القيام بها في كثير من الأحيان إلا في مرافق خارجية مخصصة بمساعدة خبراء محليين ذوي مهارات عالية. وبالإضافة إلى ذلك، يتطلب التحليل السليم للنتائج أيضا خبرة عالية. في حين أن برامج مثل iNEXT و iNEXT-Discovery تعمل على إضفاء الطابع الديمقراطي على الوصول إلى مثل هذه المرافق16، فقد تم الاعتراف بأن فحص FBLD الرخيص والسريع وعالي الإنتاجية بطرق أخرى يمكن أن يشجع برامج فحص الأدوية في مجموعة أوسع بكثير من المختبرات. ويمكن بعد ذلك استخدام هذه النتائج كمؤشر لبناء تعاون مع الكيميائيين الطبيين، وإعطاء الأولوية لتجارب الفحص الأكثر تكلفة للمركبات الواعدة إذا فرضت مرافق الرنين المغناطيسي والبلورات قيودا على عدد المركبات التي يمكن فحصها.
تشكل TSA طريقة17 الحيوية سريعة وفعالة ورخيصة نسبيا ويمكن الوصول إليها ويمكن استخدامها لفحص FBLD. وقد تم استخدامه في إعدادات متعددة, من المساعدة على إيجاد ظروف البروتين مستقرة لتجاربتبلور 18, إلى العثور على المركبات التي تربط إلى أهداف محددة في الخلايا19. كما تم استخدام TSAs لقياس ثوابت الانفصال عن البروتينات المستهدفة الملزمة ليغاندس ، حيث أن الربط الرابط غالبا ما يؤدي إلى تغييرات في الاستقرار الحراري. في جميع TSAs ، يتم قياس التغير في درجة حرارة التشبع للبروتين (استقراره) كدالة لزيادة درجة الحرارة البطيئة. وهناك طريقة فعالة لمتابعة تشبع البروتين عند التدفئة عن طريق DSF أو Thermofluor، الذي يحدد كميا إخماد الفلورية من صبغة مسعورة (عادة سيبرو أورانج) عند التفاعل مع المناطق المعرضة للماء من البروتين الذي يتكشف بسبب زيادة درجة الحرارة.
يشير Nano-DSF عادة إلى قياس الاستقرار الحراري للبروتين في غياب الأصباغ الخارجية. وكان من أولى الأدوات التي عرضت هذا الاحتمال OPTIM1000 الذي يقيس طيفا واسعا من كثافة الضوء وكذلك تشتت الضوء لعينة. سمحت هذه الآلة للقياس المتزامن للبروتين تتكشف (عادة بعد التربتوفان مضان) وتجميع البروتين (كما شكلت الجسيمات النانوية يؤدي إلى زيادة في ضوء التناثر في ~ 400 نانومتر). في وقت لاحق، أدخلت بروميثيوس استخدام انعكاس الظهر لقياس التجميع والكشف الحساس عن إشارة مضان، مما يسمح بفحص تركيزات البروتين منخفضة مع حساسية جيدة20. يصف القسم التالي كيفية استخدام بروميثيوس لإظهار بروتوكول فحص جزء للكشف عن الزيارات لأهداف البروتين المختلفة. ويتبع مقدمة موجزة عن نوعية البروتين المتوقعة وكميتها بروتوكول خطوة بخطوة لإعداد وأداء وتحليل تجارب فحص الأجزاء. وقد تم عرض نتائج الفحص لثلاثة بروتينات على سبيل المثال البيانات التي تم الحصول عليها كجزء من التعاون بين iNEXT و Discovery.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا البروتوكول طريقة متوسطة إلى عالية الإنتاجية لفحص مكتبات الأجزاء باستخدام بعض الروبوتات الشائعة وأدوات القياس. شاشات مثل تلك الموصوفة في هذا البروتوكول يمكن أن يؤديها بشكل روتيني مرفق البروتين NKI في أمستردام، على سبيل المثال كخدمة iNEXT-ديسكفري، في كثير من الأحيان حتى مجانا للمستخدمين بعد تطبيق الاقتراح ومراجعة الأقران. وفي مثل هذه الحالات، يمكن للمرفق توفير مكتبة DSi-Poised، ولكن يمكن أيضا مناقشة استخدام المكتبات الأخرى في سياق كل تطبيق مستخدم مختلف واتفاق خدمة مختلف. ويمثل اختيار الصكوك في هذا البروتوكول حلولا عملية للعديد من المختبرات، ولكن لا ينبغي اعتباره معيارا ذهبيا. يوصى باستخدام طرق خالية من الملصقات لقياس الاستقرار الحراري للبروتين المستهدف لفحص الشظايا ، بدلا من الطرق التي تستخدم الملصقات الحساسة بيئيا للكشف عن التكشف في تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي.
أساليب خالية من التسمية، مثل تلك المعروضة هنا باستخدام أداة بروميثيوس، لها بعض المزايا: أنها تستخدم كميات منخفضة من البروتين، وغالبا ما بضعة أوامر من حجم أقل؛ ويمكن استخدامها لقياس تشتت العينة في وقت واحد وبالتالي التجميع؛ والتسميات المستخدمة للكشف تتكشف في نهج أخرى يمكن أن تتفاعل بشكل مختلف مع كل جزء، مما أدى إلى قياس القطع الأثرية. وقد وصف هذا البروتوكول في سياق الروبوت البعوض، والذي يسمح الأنابيب من حجم صغير جدا من العينة (0.3 ميكرولتر) التي لا يمكن القيام به يدويا. البعوض هو الروبوت شعبية، موجودة في العديد من المختبرات التي تعمل على البيولوجيا الهيكلية ومشاريع اكتشاف المخدرات. ومع ذلك، يمكن استخدام البروتوكول بوضوح نهج بديلة ل pipetting وحدة تخزين منخفضة.
تحتوي مكتبات الأجزاء على مركبات مذابة في DMSO. أحد التحديات الأولية هو العثور على تركيز DMSO الأمثل الذي يبقى فيه البروتين مستقرا ، وتظل المركبات قابلة للذوبان. وهذا ينطوي على إجراء القياسات بتركيزات DMSO المختلفة لتحديد الظروف المثلى للفحص. البروتين لتجزئة التخفيف المستخدمة هنا يؤدي إلى تركيزات DMSO من 0.2٪؛ معظم البروتينات مستقرة إلى حد ما في هذه الظروف. كمية البروتين المطلوبة لإجراء الفحص للمكتبة 768 مركب ~ 2-3 ملغ في المجموع، كما يتم إجراء القياسات عادة بتركيزات البروتين منخفضة (0.2 مل ملغ-1). العمل مع مثل هذه التركيزات البروتين منخفضة نسبيا ليس فقط يقلل من تكاليف إنتاج البروتين، ولكن أيضا يقلل من فرص هطول الأمطار البروتين. لا يؤثر تركيز البروتين المنخفض على اكتشاف ربط الشظايا ، حيث أن تركيز الشظايا في التجربة هو ~ 2 mM ، مما يسمح أيضا بتحديد الموثقات الضعيفة.
وبما أن الكشف عن انتقال الذوبان في هذه التجارب يستند إلى كثافة الفلورسينس، فإن الجانب الحاسم هو تحديد قوة الإثارة لليزر الذي يمكن من خلاله إجراء القياسات. التفاعل بين المركبات مع البروتين يمكن أن (1) ليس لها أي تأثير على مضانها الجوهري، (2) يؤدي إلى إخماد، أو (3) زيادة مضانها الجوهري. بالإضافة إلى ذلك، فإن العمل مع تركيزات البروتين المنخفض يعني أن عدد الفلورية للبروتين الأصلي سيكون منخفضا. وبالتالي يجب تعديل قوة الإثارة بطريقة يمكن قياس معظم العينات. يوفر ملف تعريف التشتت لكل تشغيل معلومات هامة حول تأثيرات التجميع التي قد يتم تشغيلها بواسطة إضافة أي جزء. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن أيضا رؤية تأثير درجة الحرارة على قابلية الذوبان المركبة على ملف التشتت.
بشكل غير متوقع ، بالنسبة للعديد من المركبات لوحظ أن التشتت انخفض بالفعل مع ارتفاع درجة الحرارة(الشكل 6). ولذلك من المهم النظر في كل من منحنى الانتقال الذائب وملف التشتت المصاحب لاتخاذ قرار بشأن موثوقية كل تجربة ، خاصة بالنسبة لتلك الشظايا التي تعتبر مرشحة لقياسات أكثر تطلبا عن طريق التصوير البلوري بالأشعة السينية أو التحليل الطيفي NMR ، أو حتى تعتبر بمثابة ضربات لكيمياء المتابعة. أحد القيود المحددة للطريقة لأغراض فحص الشظايا هو أن العديد من الشظايا في مكتبة DSi-Poised لها مضان جوهري كبير ، في بعض الأحيان حتى خارج حد التشبع للكاشف ، وبالتالي لا يمكن فحصها بشكل صحيح لربط الهدف حتى في قوة الإثارة المنخفضة. نقطة أخرى أن نلاحظ لهذه الطريقة هو أنه لا يمكن إلا أن تستخدم مع البروتينات التي تحتوي على بقايا التربتوفان.
الشكل 6: تأثير درجة الحرارة على قابلية الذوبان المركب. ذوبان منحنى الانتقال وتشتت الملف الشخصي من Hec1 مع اثنين من مركبات مختلفة. (أ)يظهر ملف تعريف التشتت أنه بالنسبة لهذه العينة ، لا تتأثر الذوبان بدرجة الحرارة. (ب)يظهر ملف التشتت أن قابلية الذوبان في هذه العينة تزداد مع ارتفاع درجة الحرارة. وبالتالي فإن منحنى الانتقال الذائب في هذه الحالة غير موثوق به. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
والسؤال المفتوح هو ما الذي ينبغي اعتباره تغييرا كبيرا في Tm، ليس من منظور رياضي ، ولكن من وجهة النظر العملية: ما هو التغيير في Tm المهم اعتباره مؤشرا على ربط الليغند بالبروتين؟ في هذه الأمثلة ، وينظر إلى التحولات أقل من 1 درجة مئوية ل74 ٪ من شظايا ملزمة Hec1 ، 66 ٪ لMps1 ، و 53 ٪ لNsp5. النظر في 1 درجة مئوية باعتبارها “تغيير كبير” من شأنه أن يوفر بالكاد الزيارات التي تستحق متابعة الكيمياء المتابعة. في الرسوم البيانية نظرة عامة (الشكل 5)، صناديق من 1، 2، 5، أو أكثر من 5 درجات من التحول Tم، إما إيجابية أو سلبية، والنظر فيها. وهذا يتطلب تعديلا وفقا لكل حالة محددة لإعطاء نظرة عامة جيدة والسماح بصنع القرار المستنير، وتحديد الخطوة التالية. وتجدر الإشارة إلى أنه بالنسبة لبعض البروتينات، لوحظ استقرار الهدف وإزالة استقراره على حد سواء تبعا للشظايا التي تم النظر فيها. كلا الحدثين مثيرة للاهتمام، كما يمكن أن يكون كل من نتيجة لربط جزء، وكلاهما يمكن أن يؤدي إلى جزيء متابعة جيدة للتلاعب سلوك البروتين.
ويبقى السؤال الأخير، وهو “ما الذي يعرف الضربة المفيدة؟”. في الواقع، الجواب يعتمد على الوضع المحدد. على سبيل المثال ، بالنسبة ل Hec1 ، تم إبلاغ جميع الشظايا التي تعمل على استقرار البروتين بأكثر من درجتين أو تزعزع استقراره بأكثر من 5 إلى المتعاونين مع الكيمياء لدينا ، الذين صمموا جزيئات جديدة استنادا إلى هذه الزيارات. بالنسبة ل Nsp5 ، ومع ذلك ، تم إبلاغ معظم الزيارات التي تعمل على إزالة الاستقرار إلى المتعاونين مع NMR لدينا لتأكيد الضربات المشتقة من nanoDSF مع تجارب NMR. وبعبارة أخرى، ينبغي تحليل نتائج الفرز التي تم الحصول عليها من هذا البروتوكول بحذر وبطريقة تعتمد على السياق، واتخاذ قرارات مستنيرة على أساس المسألة المحددة والمنهجية المحيطة بها. على أي حال، فإن الطريقة الموصوفة هنا هي نهج تكميلي للمنهجيات القائمة مثل الأشعة السينية والفحص القائم على NMR، والتي يمكن أن تهدف إلى تأكيد أو إعطاء الأولوية أو إعطاء أفكار جديدة لحملات الكيمياء.
الجدول التكميلي S1: قائمة المخازن المؤقتة المستخدمة لفحص البروتينات. الاختصارات: HEPES = 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-حمض بيبرازينيثانسولفونيك; DTT = ديثيوثيريتول; MOBS = 4-(N-مورفولينو)حمض البوتانسولفونيك. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
الجدول التكميلي S2: خصائص لوحة MRC 2-well للاستخدام مع الروبوت nanodispenser. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الجدول.
الجدول التكميلي S3: خصائص لوحة V-bottom 96-well للاستخدام مع الروبوت nanodispenser. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
الجدول التكميلي S4: العازلة, تركيز البروتين, و Tم من البروتينات التي نوقشت في النتائج التمثيلية. الاختصارات: DTT = ديثيوثيريتول; Hec1 = أعرب للغاية في بروتين السرطان 1; Mps1 = الاحتكار المغزل كيناز 1؛ Nsp5 = السارس-CoV-2 3C مثل بروتياز. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
الملف التكميلي 1: معلمات نظرة عامة–بيانات المثال. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.
الملف التكميلي 2: قيم Tm و ΔTm ل 406 بيانات على سبيل المثال الأجزاء. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
“استفاد هذا العمل من الوصول إلى مرفق البروتين NKI، وهو مركز Instruct-ERIC. وقد تم تقديم الدعم المالي من قبل iNEXT، رقم المشروع 653706، و iNEXT-Discovery، رقم المشروع 871037، بتمويل من برنامج أفق 2020 للمفوضية الأوروبية”.
Materials
| ClearVue Sheets | Molecular Dimensions | adhesive sealing film for protein plate | |
| CORNING 6570 Aluminium Sealing Tape | CORNING | adhesive sealing film for fragment plate | |
| DSi poised library | Enamine | Fragment library containing 768 compounds used in this study | |
| Elisa Reagent Reservior | ThermoFisher Scientific | 15075 | Reagent reservior used for pipetting the protein |
| Greiner round (U) bottom plates | Cat. No. 650201 | Fragments supplied in these plates | |
| Mosquito type X1 | sptlabtech | Part nr- 3019-0003 | Nanolitre dispenser |
| MRC 2-well crystallization plate | MRC96T-PS | ||
| Pierce ELISA Reagent Reservoirs | Pierce | ||
| Prometheus High Sensitivity capillaries | Catalog PR-C006 | ||
| Prometheus NT.48 nanoDSF | Nanotemper | Catalog nr PR001 (+ Aggregation Detection Optics, catalog nr PR-AGO) | nanoDSF and light back scattering |
| Prometheus Standard capillary type | Catalog PR-C002 | ||
| TX-1000 | Thermoscientific | Centrifuge for plates | |
References
- Hoffer, L., Muller, C., Roche, P., Morelli, X. Chemistry-driven hit-to-lead optimization guided by structure-based approaches. Molecular Informatics. 37 (9-10), 1800059 (2018).
- Lamoree, B., Hubbard, R. E. Current perspectives in fragment-based lead discovery (FBLD). Essays in Biochemistry. 61 (5), 453-464 (2017).
- Ress, D. C., Congreve, M., Murray, C. W., Carr, R. Fragment-based lead discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 3 (8), 660-672 (2004).
- Carr, R. A. E., Congreve, M., Murray, C. W., Rees, D. C. Fragment-based lead discovery: Leads by design. Drug Discovery Today. 10 (14), 987-992 (2005).
- Bradley, A. R., et al. The SGC beyond structural genomics: Redefining the role of 3D structures by coupling genomic stratification with fragment-based discovery. Essays in Biochemistry. 61 (5), 495-503 (2017).
- Davies, T. G., Tickle, I. J. Fragment screening using X-ray crystallography. Topics in Current Chemistry. 317, 33-59 (2012).
- Ma, R., Wang, P., Wu, J., Ruan, K. Process of fragment-based lead discovery – A perspective from NMR. Molecules. 21 (7), 854 (2016).
- Troelsen, N. S., Clausen, M. H. Library design strategies to accelerate fragment-based drug discovery. Chemistry. 26 (50), 11391-11403 (2020).
- Shi, Y., von Itzstein, M. How size matters: Diversity for fragment library design. Molecules. 24 (15), 2838 (2019).
- Taylor, A., Doak, B. C., Scanlon, M. J. Design of a fragment-screening library. Methods in Enzymology. 610, 97-115 (2018).
- Cox, O. B., et al. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7, 2322-2330 (2016).
- Sreeramulu, S., et al. NMR quality control of fragment libraries for screening. Journal of Biomolecular NMR. 74 (10-11), 555-563 (2020).
- Pfaff, S. J., Chimenti, M. S., Kelly, M. J. S., Arkin, M. R. Biophysical methods for identifying fragment-based inhibitors of protein-protein interactions. Methods in Molecular Biology. 1278, 587-613 (2015).
- Fattori, D., Squarcia, A., Bartoli, S. Fragment-based approach to drug lead discovery: Overview and advances in various techniques. Drugs in R & D. 9 (4), 217-227 (2008).
- Winter, A., et al. Biophysical and computational fragment-based approaches to targeting protein-protein interactions: Applications in structure-guided drug discovery. Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (4), 383-426 (2012).
- Boelens, R., et al. iNEXT: a European facility network to stimulate translational structural biology. FEBS Letters. 592 (12), 1909-1917 (2018).
- Zhang, R., Monsma, F. Fluorescence-based thermal shift assays. Current Opinion in Drug Discovery and Development. 13 (4), 389-402 (2010).
- Boivin, S., Kozak, S., Meijers, R. Optimization of protein purification and characterization using Thermofluor screens. Protein Expression and Purification. 91 (2), 192-206 (2013).
- Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
- Bruce, D., Cardew, E., Freitag-Pohl, S., Pohl, E. How to stabilize protein: stability screens for thermal shift assays and nano differential scanning fluorimetry in the Virus-X Project. Journal of Visualized Experiments JoVE. (144), e58666 (2019).
