Akciğer Gelişim Biyolojisi ve Hastalığının Modellenerek İndüklenen Pluripotent Kök Hücrelerden 3D Bütün Akciğer Organoidlerinin Üretimi
Summary
Makalede, indüklenen pluripotent kök hücrelerin mezenkim ile birlikte hem proksimal hem de distal epitel akciğer hücrelerini içeren üç boyutlu tüm akciğer organoidlerine yönlendirilmiş adım bilgeliği açıklanmaktadır.
Abstract
Biyolojik olarak ilgili in vitro model sistemlerin eksikliği nedeniyle insan akciğer gelişimi ve hastalığının incelenmesi zor olmuştur. İnsan indüklenen pluripotent kök hücreler (hiPSC’ler) adım adım hem epitel hem de mezenkimal hücre popülasyonlarından oluşan 3D çok hücreli akciğer organoidlerine ayırt edilebilir. Embriyonik gelişimsel ipuçlarını, kesin endoderm, ön ön endoderm ve daha sonra akciğer progenitör hücreleri verimli bir şekilde üretmek için çeşitli büyüme faktörleri ve küçük moleküller sunarak yeniden kapsülleriz. Bu hücreler daha sonra büyüme faktörü azaltılmış (GFR)-bodrum membran matris ortamına gömülür ve dış büyüme faktörlerine yanıt olarak kendiliğinden 3D akciğer organoidlerine dönüşmelerini sağlar. Tüm bu akciğer organoidleri (WLO) deksametazon, siklik AMP ve izobutilksantin maruziyeti sonrası dallanma morfogenez ve olgunlaşma dahil olmak üzere erken akciğer gelişim evrelerinden geçer. WLO’lar KRT5 (bazal), SCGB3A2 (club) ve MUC5AC (goblet) belirteçlerini ifade eden hava yolu epitel hücrelerinin yanı sıra HOPX (alveolar tip I) ve SP-C’yi (alveolar tip II) ifade eden alveolar epitel hücrelerine sahiptir. Düz kas aksin (SMA) ve trombosit türevi büyüme faktörü reseptörü A (PDGFRα) dahil olmak üzere mezenkimal hücreler de mevcuttur. iPSC türevi WLO’lar aylarca 3D kültür koşullarında tutulabilir ve belirli bir hücre popülasyonunun saflaştırılması için yüzey belirteçleri için sıralanabilir. iPSC türevi WLO’lar, akciğer epitel ve mezenkim arasındaki sinyaller de dahil olmak üzere insan akciğer gelişimini incelemek, insan akciğer hücresi fonksiyonu ve gelişimi üzerinde genetik mutasyonları modellemek ve enfektif ajanların sitotoksikliğini belirlemek için de kullanılabilir.
Introduction
Akciğer, embriyonik, psödooglandular, kanaliküler, sakküler, alveolar ve mikrovasküler olgunlaşma1,2 olmak üzere altı farklı aşamada gelişen karmaşık, heterojen, dinamik bir organdır. İkinci iki evre insan gelişiminde prenatal olarak gerçekleşirken, ilk dört aşama sadece fetal gelişim sırasında meydana gelir, tabii preterm doğum gerçekleşmediği sürece3. Embriyonik faz endodermal mikrop tabakasında başlar ve trakea ve akciğer tomurcuklarının tomurcuklanmasıyla sonuçlanır. Akciğer gelişimi kısmen epitel ve mezenkimal hücreler arasında sinyal yoluyla gerçekleşir4. Bu etkileşimler akciğer dallanması, çoğalması, hücresel kader tespiti ve gelişmekte olan akciğerin hücresel farklılaşması ile sonuçlanır. Akciğer iletken bölgelere (terminal bronşiollere trakea) ve solunum bölgelerine (alveollere solunum bronşiolleri) ayrılmıştır. Her bölge benzersiz epitel hücre tipleri içerir; hava yolunda bazal, salgı, siliated, fırça, nöroendokrin ve iyonosit hücreleri5, ardından solunum epitelinde alveolar tip I ve II hücreleri dahil olmak üzere6. Çeşitli hücre tiplerinin gelişimi ve yaralanmasına yanıt hakkında hala çok şey bilinmemektedir. iPSC türevi akciğer organoid modelleri, insan akciğer gelişimini yönlendiren mekanizmaların incelenmesini, genetik mutasyonların pulmoner fonksiyon üzerindeki etkilerini ve hem epitel hem de mezenkimlerin primer insan akciğer dokusuna ihtiyaç duymadan enfeksiyöz ajanlara yanıtlanmasını sağlar.
Embriyonik farklılaşmanın çeşitli aşamalarına karşılık gelen belirteçler arasında kesin endoderm (DE)7 için CXCR4, cKit, FOXA2 ve SOX17, ön ön endoderm (AFE)8 için FOXA2, TBX1 ve erken akciğer progenitor hücreleri için NKX2-1 bulunur9. Embriyonik akciğer gelişiminde, foregut dorsal yemek borusu ve ventral trakeaya bölünür. Sağ ve sol akciğerlerin tomurcukları, trakeal tomurcuk10 etrafında iki bağımsız çıkıntı olarak görünür. Dallanma morfogenez sırasında, epitel çevreleyen mezenkim elastik doku, düz kas, kıkırdak ve vaskülür üretir11. Epitel ve mezenkim arasındaki etkileşim normal akciğer gelişimi için gereklidir. Bu, FGF1012’nin epitel tarafından üretilen mezenkim ve SHH13 tarafından salgılanmasıdır.
Burada, hiPSC’lerin üç boyutlu (3D) tüm akciğer organoidlerine (WLO) yönlendirilmiş farklılaşması için bir protokol açıklıyoruz. Alveolar benzeri 14,15 (distal) organoid veya hava yolu16 (proksimal) organoid yapmak için LPC aşamasında tasnif yoluyla akciğer progenitör hücrelerinin izolasyonunu içeren benzer yaklaşımlar olsa da, veya insan akciğer organoidlerini alveolar hücre ve mezenkimal belirteçleri ve tomurcuk ucu progenitor organoidlerini ifade eden hale getirmek için ventral-ön sferoidler üretin17 , bu yöntemin gücü, akciğer dallanma morfogenez, olgunlaşma ve genişleme in vitro için hem akciğer epitel hem de mezenkimal hücre tiplerinin örüntülenmesi ve düzenlenmesidir.
Bu protokol, pluripotent kök hücrelerin ayırt ediciliğini kesin endoderm, ön ön ön endoderm ve akciğer progenitör hücreleri yoluyla yönlendirmek için küçük moleküller ve büyüme faktörleri kullanır. Bu hücreler daha sonra dallanma ve olgunlaşma da dahil olmak üzere önemli gelişimsel adımlarla 3D tüm akciğer organoidlerine indüklenir. Farklılaşma protokolünün özeti Şekil 1a’da, Şekil 1b’de gösterilen endodermal ve organoid farklılaşmanın temsili parlak alan görüntüleriyle gösterilmiştir. Şekil 1c, endodermal farklılaşmanın gen ekspresyon detaylarının yanı sıra farklılaşmayı tamamladıktan sonra akciğer epitel hücrelerinin hem proksimal hem de distal popülasyonlarının gen ekspresyonunu gösterir.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D tüm akciğer organoidlerinin (WLO) başarılı farklılaşması, büyüme faktörlerine ve küçük moleküllere maruz kalma süresi, geçtikten sonra hücresel yoğunluk ve hiPSC’lerin kalitesi de dahil olmak üzere detaylara dikkat edilen çok adımlı, 6 haftalık bir protokole dayanır. Sorun giderme için tablo 2’ye bakın. hiPSC’ler yaklaşık%70-%80 bir arada olmalı, ayrışma öncesinde %5’ten az spontan farklılaşma olmalıdır. Bu protokol “mTeSR artı” ortamını gerektirir; ancak, düz …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma Kaliforniya Rejeneratif Tıp Enstitüsü (CIRM) (DISC2-COVID19-12022) tarafından desteklendi.
Materials
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
References
- Ten Have-Opbroek, A. A. Lung development in the mouse embryo. Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).
- Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
- Leibel, S., Post, M. Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease. Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).
- Hines, E. A., Sun, X. Tissue crosstalk in lung development. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- D’Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Green, M. D., et al. Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).
- Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells. Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).
- Schittny, J. C. Development of the lung. Cell and Tissue Research. 367 (3), 427-444 (2017).
- Mecham, R. P. Elastin in lung development and disease pathogenesis. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).
- Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung. Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).
- Bellusci, S., et al. Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis. Development. 124 (1), 53-63 (1997).
- Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
- Hawkins, F., et al. Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).
- McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
- Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Endale, M., et al. Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development. Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. Lung organoids and their use to study cell-cell interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. Application of iPSC to modelling of respiratory diseases. Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).
- McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. The pulmonary mesenchyme directs lung development. Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).
- Blume, C., et al. Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA. Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).
- Leibel, S. L., et al. Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).
- McCauley, K. B., et al. Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium. Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).
- Sekine, K., et al. Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells. Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).
- Jacquet, L., et al. Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population. EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).
- Mattapally, S., et al. Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy. Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).
