Генерация 3D-органоидов цельных легких из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для моделирования биологии и болезней развития легких
Summary
В статье описана пошаговая направленная дифференцировка индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в трехмерные цельные органоиды легких, содержащие как проксимальные, так и дистальные эпителиальные клетки легких вместе с мезенхимой.
Abstract
Развитие и заболевания легких человека было трудно изучать из-за отсутствия биологически значимых модельных систем in vitro . Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSCs) могут быть дифференцированы поэтапно в 3D-многоклеточные органоиды легких, состоящие как из эпителиальных, так и из мезенхимальных клеточных популяций. Мы резюмируем эмбриональные сигналы развития, временно вводя различные факторы роста и небольшие молекулы для эффективной генерации окончательной энтодермы, передней передней энтодермы передней части и впоследствии клеток-предшественников легких. Эти клетки затем внедряются в матричную среду с пониженным фактором роста (СКФ), что позволяет им спонтанно развиваться в 3D-органоиды легких в ответ на внешние факторы роста. Эти целые легкие органоиды (WLO) проходят ранние стадии развития легких, включая ветвящийся морфогенез и созревание после воздействия дексаметазона, циклического AMP и изобутилксантина. VLO обладают эпителиальными клетками дыхательных путей, экспрессирующими маркеры KRT5 (базальный), SCGB3A2 (клубный) и MUC5AC (кубок), а также альвеолярными эпителиальными клетками, экспрессирующими HOPX (альвеолярный тип I) и SP-C (альвеолярный тип II). Мезенхимальные клетки также присутствуют, включая актин гладких мышц (СМА) и рецептор фактора роста А,, полученный из тромбоцитов (PDGFRα). Полученные из iPSC VLO могут поддерживаться в условиях 3D-культуры в течение многих месяцев и могут быть отсортированы для поверхностных маркеров для очистки определенной клеточной популяции. Полученные из iPSC WLO также могут быть использованы для изучения развития легких человека, включая передачу сигналов между эпителием легких и мезенхимой, для моделирования генетических мутаций функции и развития клеток легких человека и для определения цитотоксичности инфекционных агентов.
Introduction
Легкое является сложным, гетерогенным, динамическим органом, который развивается в шесть различных стадий – эмбриональное, псевдогландулярное, канальцевое, мешковидное, альвеолярное и микрососудистое созревание1,2. Последние две фазы происходят до и послеродово в развитии человека, в то время как первые четыре стадии происходят исключительно во время развития плода, если не происходят преждевременные роды3. Эмбриональная фаза начинается в эндодермальном зародышевом слое и завершается бутонизацией трахеи и почек легких. Развитие легких происходит частично через передачу сигналов между эпителиальными и мезенхимальными клетками4. Эти взаимодействия приводят к ветвлению легких, пролиферации, определению клеточной судьбы и клеточной дифференцировке развивающегося легкого. Легкое делится на проводящие зоны (трахея к терминальным бронхиолам) и дыхательные зоны (дыхательные бронхиолы к альвеолам). Каждая зона содержит уникальные типы эпителиальных клеток; включая базальные, секреторные, реснитчатые, щеточные, нейроэндокринные и ионоцитарные клетки в проводящих дыхательных путях5, за которыми следуют альвеолярные клетки I и II типа в респираторном эпителии6. Многое до сих пор неизвестно о развитии и реакции на повреждение различных типов клеток. Производные от iPSC модели органоидов легких позволяют изучать механизмы, которые управляют развитием легких человека, влияние генетических мутаций на легочную функцию и реакцию эпителия и мезенхимы на инфекционные агенты без необходимости первичной легочной ткани человека.
Маркеры, соответствующие различным стадиям эмбриональной дифференцировки, включают CXCR4, cKit, FOXA2 и SOX17 для окончательной энтодермы (DE)7, FOXA2, TBX1 и SOX2 для передней эндодермы передней части (AFE)8 и NKX2-1 для ранних клеток-предшественников легких9. При эмбриональном развитии легких передняя кишка делится на дорсальный пищевод и вентральную трахею. Почки правого и левого легких выглядят как два независимых выхода вокруг почка трахеи10. Во время ветвящегося морфогенеза мезенхима, окружающая эпителий, производит эластичную ткань, гладкую мускулатуру, хрящи и сосудистую систему11. Взаимодействие между эпителием и мезенхимой имеет важное значение для нормального развития легких. Это включает в себя секрецию FGF1012 мезенхимой и SHH13 , производимую эпителием.
Здесь мы описываем протокол направленной дифференциации hiPSCs в трехмерные (3D) целые органоиды легких (WLO). Хотя существуют аналогичные подходы, которые включают выделение клеток-предшественников легких путем сортировки на стадии LPC для получения альвеолярных органоидов14,15 (дистальных) органоидов или органоидов дыхательных путей16 (проксимальных) или генерируют вентрально-передние сфероиды передней скаты, чтобы сделать органоиды легких человека, экспрессирующие альвеолярные клетки и мезенхимальные маркеры и органоиды предшественников почек17 , сила этого метода заключается в включении как эпителиальных, так и мезенхимальных типов клеток легких для моделирования и оркестрации морфогенеза, созревания и расширения легких in vitro.
Этот протокол использует малые молекулы и факторы роста для направления дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток через окончательную энтодерму, переднюю эндодерму передней части и клетки-предшественники легких. Эти клетки затем индуцируются в 3D-органоиды целых легких через важные этапы развития, включая ветвление и созревание. Резюме протокола дифференцировки показано на рисунке 1а с репрезентативными изображениями яркого поля эндодермальной и органоидной дифференцировки, показанными на рисунке 1b. На рисунке 1c,d показаны детали экспрессии генов эндодермальной дифференцировки, а также экспрессия генов как проксимальной, так и дистальной популяций эпителиальных клеток легких после завершения дифференцировки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Успешная дифференциация 3D-органоидов целых легких (WLO) опирается на многоступенчатый 6-недельный протокол с вниманием к деталям, включая время воздействия факторов роста и малых молекул, клеточную плотность после прохождения и качество hiPSCs. Сведения об устранении неполадок см. в та…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Калифорнийским институтом регенеративной медицины (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
Materials
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
References
- Ten Have-Opbroek, A. A. Lung development in the mouse embryo. Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).
- Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
- Leibel, S., Post, M. Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease. Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).
- Hines, E. A., Sun, X. Tissue crosstalk in lung development. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- D’Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Green, M. D., et al. Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).
- Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells. Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).
- Schittny, J. C. Development of the lung. Cell and Tissue Research. 367 (3), 427-444 (2017).
- Mecham, R. P. Elastin in lung development and disease pathogenesis. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).
- Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung. Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).
- Bellusci, S., et al. Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis. Development. 124 (1), 53-63 (1997).
- Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
- Hawkins, F., et al. Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).
- McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
- Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Endale, M., et al. Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development. Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. Lung organoids and their use to study cell-cell interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. Application of iPSC to modelling of respiratory diseases. Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).
- McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. The pulmonary mesenchyme directs lung development. Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).
- Blume, C., et al. Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA. Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).
- Leibel, S. L., et al. Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).
- McCauley, K. B., et al. Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium. Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).
- Sekine, K., et al. Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells. Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).
- Jacquet, L., et al. Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population. EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).
- Mattapally, S., et al. Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy. Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).
