Geração de organoides pulmonares 3D inteiros de células-tronco pluripotentes induzidas para modelagem da biologia e doença do desenvolvimento pulmonar

O pulmão é um órgão complicado, heterogêneo e dinâmico que se desenvolve em seis estágios distintos – embrionário, pseudoglandular, canalicular, saccular, alveolar e maturação microvascular1,2. As duas últimas fases ocorrem pré e pós-natal no desenvolvimento humano, enquanto os quatro primeiros estágios ocorrem exclusivamente durante o desenvolvimento fetal, a menos que ocorram nascimentos ^prematuros3. A fase embrionária começa na camada de germes endodérmicos e termina com o brotamento da traqueia e dos botões pulmonares. O desenvolvimento pulmonar ocorre em parte através da sinalização entre as células epiteliais e mesenquimais4. Essas interações resultam em ramificação pulmonar, proliferação, determinação do destino celular e diferenciação celular do pulmão em desenvolvimento. O pulmão é dividido em zonas de condução (traqueia para os brônquios terminais) e zonas respiratórias (brônquios respiratórios aos alvéolos). Cada região contém tipos únicos de células epiteliais; incluindo células basais, secretas, ciliadas, escovas, neuroendócrinas e ionócitos nas vias aéreas ^condutoras5, seguidas por células alveolares tipo I e II no epitélio ^{respiratório6}. Ainda não se sabe muito sobre o desenvolvimento e a resposta à lesão dos vários tipos de células. Modelos organoides fundidas derivadas do iPSC permitem o estudo de mecanismos que impulsionam o desenvolvimento pulmonar humano, os efeitos das mutações genéticas na função pulmonar e a resposta tanto do epitélio quanto do mesenquime a agentes infecciosos sem a necessidade de tecido pulmonar humano primário.

Os marcadores correspondentes aos vários estágios de diferenciação embrionária incluem CXCR4, cKit, FOXA2 e SOX17 para endoderme definitivo (DE)⁷, FOXA2, TBX1 e SOX2 para endoderme anterior (AFE)⁸, e NKX2-1 para células progenitoras pulmonares ^precoces9. No desenvolvimento pulmonar embrionário, o foregut se divide no esôfago dorsal e na traqueia ventral. Os botões dos pulmões direito e esquerdo aparecem como dois outpouchings independentes ao redor do broto ^traqueal10. Durante a morfogênese ramificada, o mesenquima em torno do epitélio produz tecido elástico, músculo liso, cartilagem e ^{vasculatura11}. A interação entre o epitélio e o mesenquime é essencial para o desenvolvimento pulmonar normal. Isso inclui a secreção de ^FGF1012 pelo mesenchyme e ^SHH13 produzidos pelo epitélio.

Aqui, descrevemos um protocolo para a diferenciação direcionada de hiPSCs em organoides pulmonares tridimensionais (3D) inteiros (WLO). Embora existam abordagens semelhantes que incorporem o isolamento de células progenitoras pulmonares através da triagem no estágio LPC para fazer organoides allveolares ^14,15 (distal) ou organoides das vias ^aéreas16 (proximal), ou gerar esferoides ventral-anteriores para fazer organoides pulmonares humanos expressando marcadores alveolares e mesenquimais e ^organoides progenitores de bud , a força deste método é a inclusão de ambos os tipos de células epiteliais pulmonares e mesenquimais para padronizar e orquestrar morfogênese de ramificação pulmonar, maturação e expansão in vitro.

Este protocolo utiliza pequenas moléculas e fatores de crescimento para direcionar a diferenciação de células-tronco pluripotentes através de endoderme definitivo, endoderme anterior de foregut e células progenitoras pulmonares. Essas células são então induzidas em organoides pulmonares 3D inteiros através de importantes etapas de desenvolvimento, incluindo ramificação e maturação. O resumo do protocolo de diferenciação é mostrado na Figura 1a com imagens representativas de brightfield de diferenciação endodérmica e organoide mostrada na Figura 1b. A Figura 1c,d mostra os detalhes da expressão genética da diferenciação endodérmica, bem como a expressão genética das populações proximais e distais das células epiteliais pulmonares após completar a diferenciação.