Generatie van 3D-organoïden voor de hele long uit geïnduceerde pluripotente stamcellen voor het modelleren van longontwikkelingsbiologie en -ziekte
Summary
Het artikel beschrijft stapsgewijze gerichte differentiatie van geïnduceerde pluripotente stamcellen naar driedimensionale hele longorganoïden die zowel proximale als distale epitheellongcellen bevatten, samen met mesenchym.
Abstract
De ontwikkeling en ziekte van menselijke longen is moeilijk te bestuderen vanwege het gebrek aan biologisch relevante in vitro modelsystemen. Door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC’s) kunnen stapsgewijs worden gedifferentieerd in 3D meercellige longorganoïden, gemaakt van zowel epitheliale als mesenchymale celpopulaties. We reconstrueren embryonale ontwikkelingssignalen door tijdelijk een verscheidenheid aan groeifactoren en kleine moleculen te introduceren om efficiënt definitief endoderm, anterieur voorgut endoderm en vervolgens longvoorlopercellen te genereren. Deze cellen worden vervolgens ingebed in groeifactor gereduceerd (GFR) -keldermembraanmatrixmedium, waardoor ze zich spontaan kunnen ontwikkelen tot 3D-longorganoïden als reactie op externe groeifactoren. Deze hele longorganoïden (WLO) ondergaan vroege longontwikkelingsstadia, waaronder vertakkende morfogenese en rijping na blootstelling aan dexamethason, cyclisch AMP en isobutylxanthine. WLO’s bezitten luchtwegepitheelcellen die de markers KRT5 (basaal), SCGB3A2 (club) en MUC5AC (bokaal) tot expressie brengen, evenals alveolaire epitheelcellen die HOPX (alveolair type I) en SP-C (alveolair type II) tot expressie brengen. Mesenchymale cellen zijn ook aanwezig, waaronder gladde spier actine (SMA) en van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor A (PDGFRα). iPSC-afgeleide WLO’s kunnen vele maanden in 3D-kweekomstandigheden worden gehandhaafd en kunnen worden gesorteerd op oppervlaktemarkers om een specifieke celpopulatie te zuiveren. iPSC-afgeleideWLO’s kunnen ook worden gebruikt om de ontwikkeling van menselijke longen te bestuderen, inclusief signalering tussen het longepitheel en mesenchym, om genetische mutaties op de functie en ontwikkeling van menselijke longcellen te modelleren en om de cytotoxiciteit van infectieuze agentia te bepalen.
Introduction
De long is een gecompliceerd, heterogeen, dynamisch orgaan dat zich ontwikkelt in zes verschillende stadia – embryonale, pseudoglandulaire, canalculaire, sacculaire, alveolaire en microvasculaire rijping1,2. De laatste twee fasen treden pre- en postnataal op in de menselijke ontwikkeling, terwijl de eerste vier stadia uitsluitend plaatsvinden tijdens de foetale ontwikkeling, tenzij vroeggeboorte optreedt3. De embryonale fase begint in de endodermale kiemlaag en eindigt met het ontluiken van de luchtpijp en longknoppen. Longontwikkeling vindt gedeeltelijk plaats via signalering tussen de epitheel- en mesenchymale cellen4. Deze interacties resulteren in longvertakking, proliferatie, cellulaire lotbepaling en cellulaire differentiatie van de zich ontwikkelende long. De long is verdeeld in geleidende zones (luchtpijp naar de terminale bronchiolen) en ademhalingszones (respiratoire bronchiolen naar de longblaasjes). Elke zone bevat unieke epitheelceltypen; inclusief basale, secretoire, trilhaar-, borstel-, neuro-endocriene en ionocytcellen in de geleidende luchtwegen5, gevolgd door alveolaire type I- en II-cellen in het respiratoire epitheel6. Er is nog veel onbekend over de ontwikkeling en reactie op letsel van de verschillende celtypen. iPSC-afgeleide longorganoïde modellen maken de studie mogelijk van mechanismen die de ontwikkeling van menselijke longen stimuleren, de effecten van genetische mutaties op de longfunctie en de respons van zowel het epitheel als het mesenchym op infectieuze agentia zonder de noodzaak van primair menselijk longweefsel.
Markers die overeenkomen met de verschillende stadia van embryonale differentiatie omvatten CXCR4, cKit, FOXA2 en SOX17 voor definitief endoderm (DE)7, FOXA2, TBX1 en SOX2 voor anterieur foregut endoderm (AFE)8 en NKX2-1 voor vroege longvoorlopercellen9. Bij embryonale longontwikkeling verdeelt het voorgut zich in de dorsale slokdarm en ventrale luchtpijp. De knoppen van de rechter- en linkerlong verschijnen als twee onafhankelijke uitstulpingen rond de tracheale knop10. Tijdens vertakkende morfogenese produceert het mesenchym rond het epitheel elastisch weefsel, gladde spieren, kraakbeen en vasculatuur11. De interactie tussen het epitheel en mesenchym is essentieel voor een normale longontwikkeling. Dit omvat de afscheiding van FGF1012 door het mesenchym en SHH13 geproduceerd door het epitheel.
Hier beschrijven we een protocol voor de gerichte differentiatie van hiPSC’s in driedimensionale (3D) hele longorganoïden (WLO). Hoewel er vergelijkbare benaderingen zijn die isolatie van longvoorlopercellen omvatten via sortering in het LPC-stadium om alveolaire-achtige 14,15 (distale) organoïden of airway16 (proximale) organoïden te maken, of ventraal-anterieure foregut-sferoïden te genereren om menselijke longorganoïden te maken die alveolaire cel- en mesenchymale markers tot expressie brengen en knoptipvoorloperorganoïden17 , is de kracht van deze methode de opname van zowel longepitheel- als mesenchymale celtypen om longvertakkingsmorfogenese, rijping en expansie in vitro te patroon en te orkestreren.
Dit protocol maakt gebruik van kleine moleculen en groeifactoren om de differentiatie van pluripotente stamcellen te sturen door middel van definitief endoderm, anterieur voorgut endoderm en longvoorlopercellen. Deze cellen worden vervolgens geïnduceerd in 3D-organoïden voor de hele long door middel van belangrijke ontwikkelingsstappen, waaronder vertakking en rijping. De samenvatting van het differentiatieprotocol is weergegeven in figuur 1a met representatieve brightfieldbeelden van endodermale en organoïde differentiatie in figuur 1b. Figuur 1c,d toont de genexpressiedetails van endodermale differentiatie en de genexpressie van zowel de proximale als distale populaties van longepitheelcellen na voltooiing van de differentiatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De succesvolle differentiatie van 3D-organoïden voor de hele long (WLO) is gebaseerd op een meerstapsprotocol van 6 weken met aandacht voor detail, inclusief tijd van blootstelling aan groeifactoren en kleine moleculen, cellulaire dichtheid na passaging en de kwaliteit van hiPSC’s. Zie tabel 2 voor probleemoplossing. hiPSC’s moeten ongeveer 70% -80% confluent zijn, met minder dan 5% spontane differentiatie voorafgaand aan dissociatie. Dit protocol vraagt om “mTeSR plus” medium; gewoon “mTeSR” medium is …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door het California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
Materials
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
References
- Ten Have-Opbroek, A. A. Lung development in the mouse embryo. Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).
- Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
- Leibel, S., Post, M. Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease. Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).
- Hines, E. A., Sun, X. Tissue crosstalk in lung development. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- D’Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Green, M. D., et al. Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).
- Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells. Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).
- Schittny, J. C. Development of the lung. Cell and Tissue Research. 367 (3), 427-444 (2017).
- Mecham, R. P. Elastin in lung development and disease pathogenesis. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).
- Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung. Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).
- Bellusci, S., et al. Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis. Development. 124 (1), 53-63 (1997).
- Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
- Hawkins, F., et al. Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).
- McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
- Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Endale, M., et al. Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development. Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. Lung organoids and their use to study cell-cell interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. Application of iPSC to modelling of respiratory diseases. Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).
- McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. The pulmonary mesenchyme directs lung development. Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).
- Blume, C., et al. Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA. Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).
- Leibel, S. L., et al. Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).
- McCauley, K. B., et al. Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium. Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).
- Sekine, K., et al. Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells. Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).
- Jacquet, L., et al. Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population. EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).
- Mattapally, S., et al. Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy. Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).
