جيل من 3D الجهازيات الرئة الكاملة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لنمذجة البيولوجيا التنموية الرئة والمرض
Summary
ويصف المقال خطوة الحكمة الموجهة التمايز من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى الأجهزة الرئوية الكاملة ثلاثية الأبعاد التي تحتوي على كل من خلايا الرئة الظهارية القريبة والقاصية جنبا إلى جنب مع mesenchyme.
Abstract
كان من الصعب دراسة نمو الرئة البشرية والمرض بسبب عدم وجود نظم نموذجية ذات صلة بيولوجيا في المختبر . يمكن تمييز الخلايا الجذعية المتعددة القدرات المستحثة بشريا (hiPSCs) بشكل تدريجي إلى أعضاء رئوية متعددة الخلايا ثلاثية الأبعاد ، مصنوعة من مجموعات خلايا ظهارية ونسينشيمالية. نحن تلخيص الإشارات التنموية الجنينية من خلال إدخال زمنيا مجموعة متنوعة من عوامل النمو والجزيئات الصغيرة لتوليد بكفاءة endoderm نهائي، الأمامية الأمامية الاندوديرم، وبعد ذلك خلايا السلف الرئة. ثم يتم تضمين هذه الخلايا في عامل النمو خفضت (GFR) الطابق السفلي مصفوفة الغشاء المتوسط، مما يسمح لهم لتطوير عفويا إلى organoids الرئة 3D استجابة لعوامل النمو الخارجية. تخضع هذه الأعضاء الرئوية الكاملة (WLO) لمراحل نمو الرئة المبكرة بما في ذلك مورفوجينيسيس المتفرع والنضج بعد التعرض للديكساميثازون والتضخيم الدوري والإيزوبوتيلكانثين. تمتلك WLOs خلايا ظهارية مجرى الهواء تعبر عن علامات KRT5 (القاعدية) وSCGB3A2 (النادي) وMUC5AC (الكؤوس) وكذلك الخلايا الظهارية السنفية التي تعبر عن HOPX (النوع السنفي الأول) وSP-C (النوع الثاني من السنفية). الخلايا الميسينشيمالية موجودة أيضا، بما في ذلك أكتين العضلات الملساء (SMA)، ومستقبلات عامل النمو المشتقة من الصفائح الدموية A (PDGFRα). يمكن الحفاظ على WLOs المشتقة من iPSC في ظروف الثقافة ثلاثية الأبعاد لعدة أشهر ويمكن فرزها لعلامات السطح لتنقية مجموعة خلايا محددة. ويمكن أيضا استخدام WLOs iPSC المستمدة لدراسة نمو الرئة البشرية، بما في ذلك الإشارات بين ظهارة الرئة وmesenchyme، لنموذج الطفرات الوراثية على وظيفة خلايا الرئة البشرية والتنمية، وتحديد السمية الخلوية للعوامل المعدية.
Introduction
الرئة هي معقدة، غير متجانسة، الجهاز الديناميكي الذي يتطور في ست مراحل متميزة – الجنينية، الزائفة، القناني، saccular، الحويصلات، والنضج الأوعية الدموية الدقيقة1،2. تحدث المرحلتان الأخيرتان قبل الولادة وبعدها في النمو البشري بينما تحدث المراحل الأربع الأولى حصريا أثناء نمو الجنين ما لم تحدث الولادة المبتسرة3. تبدأ المرحلة الجنينية في طبقة جرثومة الجلد وتنتهي ببراعم القصبة الهوائية والرئة الناشئة. يحدث تطور الرئة جزئيا عن طريق الإشارة بين الخلايا الظهارية والخلايا الظهارية4. هذه التفاعلات تؤدي إلى تفريع الرئة، والانتشار، وتحديد المصير الخلوي والتمايز الخلوي للرئة النامية. تنقسم الرئة إلى مناطق إجراء (القصبة الهوائية إلى الشعب الهوائية الطرفية) ومناطق الجهاز التنفسي (القصبات الهوائية التنفسية إلى الحويصلات الهوائية). كل منطقة تحتوي على أنواع فريدة من الخلايا الظهارية; بما في ذلك القاعدية، إفراز، ciliated، فرشاة، الغدد الصماء العصبية، والخلايا الأيونية في مجرى الهواء إجراء5، تليها الخلايا السنفية النوع الأول والثاني في ظهارة الجهاز التنفسي6. الكثير لا يزال غير معروف حول تطوير والاستجابة لإصابة أنواع الخلايا المختلفة. تمكن نماذج الأعضاء الرئوية المشتقة من iPSC من دراسة الآليات التي تدفع نمو الرئة البشرية ، وآثار الطفرات الوراثية على الوظيفة الرئوية ، واستجابة كل من الظهارة والميسينشيم للعوامل المعدية دون الحاجة إلى أنسجة الرئة البشرية الأولية.
علامات المقابلة لمختلف مراحل التمايز الجنيني وتشمل CXCR4، cKit، FOXA2، وS SOX17 لاندوديرم نهائي (DE)7، FOXA2، TBX1، وS SOX2 لاندوديرم الأمامية (AFE)8، وNKX2-1 لخلايا السلف الرئة في وقت مبكر9. في تطور الرئة الجنينية ، يقسم الرغوت إلى المريء الظهري والرغامى البطنية. براعم الرئتين اليمنى واليسارية تظهر كما اثنين من النعومات المستقلة حول bud10 القصبة الهوائية. أثناء المورفوجين المتفرع ، ينتج الميسنشيم المحيط بالظهارة أنسجة مرنة وعضلات ناعمة وغضاريف وvasculature11. التفاعل بين الظهارة والميسينشيم ضروري لتطور الرئة الطبيعي. وهذا يشمل إفراز FGF1012 من قبل mesenchyme وSHH13 التي تنتجها ظهارة.
هنا، ونحن نصف بروتوكول للتمايز الموجه من hiPSCs إلى ثلاثي الأبعاد (3D) الأجهزة الرئوية كلها (WLO). في حين أن هناك نهج مماثلة التي تتضمن عزل خلايا السلف الرئة عن طريق الفرز في مرحلة LPC لجعل الأجهزة العضوية مثل السنفية 14,15 (البعيدة) أو organoids airway16 (قريبة) ، أو توليد الفيرويدات الأمامية البطنية لجعل أعضاء الرئة البشرية التي تعبر عن الخلايا الحويصلة الهوائية وعلامات الميسنشيمال وبراعم تلميح ، قوة هذه الطريقة هي إدراج كل من أنواع الخلايا الظهارية الرئوية والخلية الظهارية mesenchymal لنمط وتنسيق مورفوجينيسيس متفرعة الرئة، والنضج، والتوسع في المختبر.
يستخدم هذا البروتوكول جزيئات صغيرة وعوامل نمو لتوجيه تمايز الخلايا الجذعية متعددة القدرات من خلال بطانة الرحم النهائية ، واندوديرم الأمامي ، وخلايا سلف الرئة. ثم يتم حث هذه الخلايا في 3D الأجهزة الرئوية الكاملة من خلال خطوات النمو الهامة، بما في ذلك المتفرعة والنضج. 10- يرد موجز بروتوكول التمايز في الشكل 1 أ مع صور تمثيلية من التمايز بين الاندوديرمال والأعضاء تظهر في الشكل 1ب. الشكل 1c،d تظهر تفاصيل التعبير الجيني للتمايز إندوديرمال، فضلا عن التعبير الجيني لكل من المجموعات القريبة والبعدية من الخلايا الظهارية الرئة بعد الانتهاء من التمايز.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعتمد التمايز الناجح لأجهزة الرئة الكاملة ثلاثية الأبعاد (WLO) على بروتوكول متعدد الخطوات لمدة 6 أسابيع مع الاهتمام بالتفاصيل ، بما في ذلك وقت التعرض لعوامل النمو والجزيئات الصغيرة ، والكثافة الخلوية بعد التمرير ، ونوعية hiPSCs. لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها، راجع الجدول 2. يجب أن تكون hiPS…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا البحث من قبل معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) (DISC2-COVID19-12022).
Materials
| Cell Culture | |||
| 12 well plates | Corning | 3512 | |
| 12-well inserts, 0.4um, translucent | VWR | 10769-208 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | AT104 | |
| ascorbic acid | Sigma | A4544 | |
| B27 without retinoic acid | ThermoFisher | 12587010 | |
| Bovine serum albumin (BSA) Fraction V, 7.5% solution | Gibco | 15260-037 | |
| Dispase | StemCellTech | 7913 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10565042 | |
| FBS | Gibco | 10082139 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050061 | |
| Ham’s F12 | Invitrogen | 11765-054 | |
| HEPES | Gibco | 15630-080 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM) + Glutamax | Invitrogen | 31980030 | |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Life Technologies | 10828028 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Monothioglycerol | Sigma | M6145 | |
| mTeSR plus Kit (10/case) | Stem Cell Tech | 5825 | |
| N2 | ThermoFisher | 17502048 | |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| Pen/strep | Lonza | 17-602F | |
| ReleSR | Stem Cell Tech | 5872 | |
| RPMI1640 + Glutamax | Life Technologies | 12633012 | |
| TrypLE | Gibco | 12605-028 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | R&D Systems | 1254/1 | |
| Growth Factors/Small Molecules | |||
| Activin A | R&D Systems | 338-AC | |
| All-trans retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| BMP4 | R&D Systems | 314-BP/CF | |
| Br-cAMP | Sigma-Aldrich | B5386 | |
| CHIR99021 | Abcam | ab120890 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | |
| Dorsomorphin | R&D Systems | 3093 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF10 | R&D Systems | 345-FG/CF | |
| FGF7 | R&D Systems | 251-KG/CF | |
| IBMX (3-Isobtyl-1-methylxanthine) | Sigma-Aldrich | I5879 | |
| SB431542 | R&D Systems | 1614 | |
| VEGF/PIGF | R&D Systems | 297-VP/CF | |
| Primary antibodies | Dilution rate | ||
| CXCR4-PE | R&D Systems | FAB170P | 1:200 (F) |
| HOPX | Santa Cruz Biotech | sc-398703 | 0.180555556 |
| HTII-280 | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | 0.145833333 |
| KRT5 | Abcam | ab52635 | 0.180555556 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | 0.25 |
| NKX2-1-APC | LS-BIO | LS-C264437 | 1:1000 (F) |
| proSPC | Abcam | ab40871 | 0.215277778 |
| SCGB3A2 | Abcam | ab181853 | 0.25 |
| SOX2 | Invitrogen | MA1-014 | 0.180555556 |
| SOX9 | R&D Systems | AF3075 | 0.180555556 |
| SPB (mature) | 7 Hills | 48604 | 1: 1500 (F) 1:500 (W)a |
| SPC (mature) | LS Bio | LS-B9161 | 1:100 (F); 1:500 (W) a |
References
- Ten Have-Opbroek, A. A. Lung development in the mouse embryo. Experimental Lung Research. 17 (2), 111-130 (1991).
- Perl, A. K., Whitsett, J. A. Molecular mechanisms controlling lung morphogenesis. Clinical Genetics. 56 (1), 14-27 (1999).
- Leibel, S., Post, M. Endogenous and exogenous stem/progenitor cells in the lung and their role in the pathogenesis and treatment of pediatric lung disease. Frontiers in Pediatrics. 4, 36 (2016).
- Hines, E. A., Sun, X. Tissue crosstalk in lung development. Journal of Cellular Biochemistry. 115 (9), 1469-1477 (2014).
- Montoro, D. T., et al. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes. Nature. 560 (7718), 319-324 (2018).
- Barkauskas, C. E., et al. Type 2 alveolar cells are stem cells in adult lung. The Journal of Clinical Investigation. 123 (7), 3025-3036 (2013).
- D’Amour, K. A., et al. Efficient differentiation of human embryonic stem cells to definitive endoderm. Nature Biotechnology. 23 (12), 1534-1541 (2005).
- Green, M. D., et al. Generation of anterior foregut endoderm from human embryonic and induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (3), 267-272 (2011).
- Ikeda, K., Shaw-White, J. R., Wert, S. E., Whitsett, J. A. Hepatocyte nuclear factor 3 activates transcription of thyroid transcription factor 1 in respiratory epithelial cells. Molecular Cell Biology. 16 (7), 3626-3636 (1996).
- Schittny, J. C. Development of the lung. Cell and Tissue Research. 367 (3), 427-444 (2017).
- Mecham, R. P. Elastin in lung development and disease pathogenesis. Matrix Biology: Journal of the International Society for Matrix Biology. 73, 6-20 (2018).
- Bellusci, S., Grindley, J., Emoto, H., Itoh, N., Hogan, B. L. Fibroblast growth factor 10 (FGF10) and branching morphogenesis in the embryonic mouse lung. Development. 124 (23), 4867-4878 (1997).
- Bellusci, S., et al. Involvement of Sonic hedgehog (Shh) in mouse embryonic lung growth and morphogenesis. Development. 124 (1), 53-63 (1997).
- Yamamoto, Y., et al. Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids. Nature Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).
- Hawkins, F., et al. Prospective isolation of NKX2-1-expressing human lung progenitors derived from pluripotent stem cells. The Journal of Clinical Investigation. 127 (6), 2277-2294 (2017).
- McCauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 45 (1), 51 (2018).
- Miller, A. J., et al. Generation of lung organoids from human pluripotent stem cells in vitro. Nature Protocols. 14 (2), 518-540 (2019).
- Gotoh, S., et al. Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 3 (3), 394-403 (2014).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
- Endale, M., et al. Temporal, spatial, and phenotypical changes of PDGFRα expressing fibroblasts during late lung development. Developmental Biology. 425 (2), 161-175 (2017).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Nikolić, M. Z., Rawlins, E. L. Lung organoids and their use to study cell-cell interaction. Current Pathobiology Reports. 5 (2), 223-231 (2017).
- Calvert, B. A., Ryan Firth, A. L. Application of iPSC to modelling of respiratory diseases. Advances on Experimental Medicine and Biology. 1237, 1-16 (2020).
- McCulley, D., Wienhold, M., Sun, X. The pulmonary mesenchyme directs lung development. Current Opinion in Genetics and Development. 32, 98-105 (2015).
- Blume, C., et al. Cellular crosstalk between airway epithelial and endothelial cells regulates barrier functions during exposure to double-stranded RNA. Immunity, Inflammation and Disease. 5 (1), 45-56 (2017).
- Leibel, S. L., et al. Reversal of surfactant protein B deficiency in patient specific human induced pluripotent stem cell derived lung organoids by gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 13450 (2019).
- Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
- Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry: Official Journal of the Histochemistry Society. 58 (10), 891-901 (2010).
- McCauley, K. B., et al. Single-cell transcriptomic profiling of pluripotent stem cell-derived SCGB3A2+ airway epithelium. Stem Cell Reports. 10 (5), 1579-1595 (2018).
- Sekine, K., et al. Robust detection of undifferentiated iPSC among differentiated cells. Scientific Reports. 10 (1), 10293 (2020).
- Jacquet, L., et al. Strategy for the creation of clinical grade hESC line banks that HLA-match a target population. EMBO Molecular Medicine. 5 (1), 10-17 (2013).
- Mattapally, S., et al. Human leukocyte antigen class I and II knockout human induced pluripotent stem cell-derived cells: universal donor for cell therapy. Journal of the American Heart Association. 7 (23), 010239 (2018).
