돼지 장 점막 상피에서 아미노펩티다아제 N을 표적으로 하는 단클론 항체 생산
Summary
pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO 세포에서 발현되는 재조합 항체 단백질과 전통적인 하이브리도마 기술을 사용하여 생산된 단클론 항체는 돼지 아미노펩티다아제 N(APN) 단백질을 인식하고 결합할 수 있습니다.
Abstract
소장 점막에 풍부하게 존재하는 막 결합 메탈로펩티다아제인 돼지 아미노펩티다아제 N(APN)은 낮은 단백질 발현, 효소 비활성 또는 구조적 변화와 같은 간섭 없이 점막 면역 반응을 시작할 수 있습니다. 따라서 APN은 점막 상피를 선택적으로 표적으로 하는 백신 개발에서 매력적인 후보가 됩니다. 이전 연구에서는 APN이 장독소성 대장균 (E. coli) F4와 전염성 위장염 바이러스 모두에 대한 수용체 단백질임을 보여주었습니다. 따라서 APN은 APN 특이적 항체를 기반으로 하는 항체-약물 접합체 또는 새로운 백신 개발에 대한 가능성을 보여줍니다. 본 연구에서는 전통적인 하이브리도마 기술과 재조합 항체 발현 방법을 이용한 APN 특이적 단일클론항체(mAb)의 생산을 비교하였다. 우리는 또한 pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN 및 pET28a(+)-rAbs-APN 벡터를 보유하는 대장균 발현 BL21(DE3) 균 주를 사용하여 안정적으로 형질감염된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포주를 확립했습니다. 상기 결과는 하이브리도마를 사용하여 생산된 pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO 세포 및 mAbs에서 발현된 항체가 APN 단백질을 인식하고 결합할 수 있음을 보여줍니다. 이는 다양한 APN 특이적 에피토프를 표적으로 하는 치료제 개발을 위한 APN 수용체 기능의 추가 설명의 기초를 제공합니다.
Introduction
메탈로프로테이나제 M1 계열에 속하는 달빛 효소인 아미노펩티다아제 N(APN)은 효소 의존성 및 효소 비의존성 경로를 통해 종양 표지자, 수용체 및 신호 분자로 작용합니다 1,2. APN은 생물학적 활성을 조절하기 위해 다양한 생리활성 펩타이드의 N-말단 아미노산 잔기를 절단하는 것 외에도 다양한 염증성 질환의 발병기전에 중요한 역할을 합니다. APN은 주요 조직 적합성 복합체 클래스 II 분자 2,3에 밀접하게 결합하는 절제된 펩타이드에 의한 항원 처리 및 제시에 참여합니다. APN은 또한 다중 신호 전달에 참여하는 G 단백질 결합 수용체와 결합하여 사이토카인 분비를 조절하고 면역 반응에서 Fc 감마 수용체 매개 식균 작용에 기여함으로써 항염증 효과를 발휘합니다 4,5,6,7.
널리 분포된 막 결합 엑소펩티다아제로서, APN은 돼지 소장 점막에 풍부하며 수용체 매개 엔도사이토시스(endocytosis)와 밀접한 관련이 있다 1,5,8. APN은 세포 진입을 위해 전염성 위장염 바이러스의 스파이크 단백질을 인식하고 결합하며, 장독소성 대장균 F4 섬유질의 FaeG 서브유닛과 직접 상호작용하여 숙주 세포에 대한 박테리아 부착에 영향을 미칩니다 9,10,11. 따라서, APN은 바이러스 및 세균성 감염성 질환의 치료에서 잠재적인 치료 표적이다.
1975년 하이브리도마 기술 및 단일클론항체(mAb) 생산을 위한 다른 전략의 개발 이후, mAbs는 면역요법, 약물 전달 및 진단에 널리 사용되어 왔다12,13,14. 현재, mAbs는 암, 염증성 장 질환 및 다발성 경화증과 같은 질병을 치료하는데 성공적으로 사용되고 있다12,15. 강한 친화력과 특이성으로 인해, mAbs는 항체-약물 접합체(ADC) 또는 새로운 백신의 개발에서 이상적인 표적이 될 수 있다16,17. APN 단백질은 항원을 특정 세포에 선택적으로 전달하는 데 중요하며 낮은 단백질 발현, 효소 불활성 또는 구조적 변화를 포함한 간섭 없이 병원체에 대한 특이적이고 강력한 점막 면역 반응을 유도할 수 있습니다 5,8,18. 따라서 APN 특이적 mAb를 기반으로 하는 치료제는 박테리아 및 바이러스 감염에 대한 가능성을 보여줍니다. 이 연구에서는 하이브리도마 기술을 사용한 APN 특이적 mAb의 생산과 원핵 및 진핵 벡터를 사용한 항-APN 재조합 항체(rAb)의 발현에 대해 설명합니다. 상기 결과는 APN 단백질이 pIRES2-ZSGreen1-rAbs-APN-CHO 세포에서 발현된 rAb 및 하이브리도마 유래 mAb 모두에 의해 인식되었음을 나타낸다.
Protocol
Representative Results
Discussion
점막 면역의 유도는 병원체에 대항하고 다양한 질병의 예방 및 치료에 가장 효과적인 접근법 중 하나입니다. 장 점막에서 고도로 발현되는 막 결합 단백질인 APN은 적응 면역 반응의 유도와 수용체 매개 바이러스 및 박테리아 엔도사이토시스에 관여한다 1,5,8. APN은 다양한 형태의 항원 로딩 및 백신 전달에서 항원 미립자로 사?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 과학 재단 보조금 (No. 32072820, 31702242), 장쑤 정부 해외 연구 장학금 (JS20190246) 및 Yangzhou University Scientific Research Foundation의 고급 인재, 개발 Jiangsu High Education Institution의 우선 학업 프로그램이 설립 한 프로젝트.
Materials
| Complete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Animal immunization |
| DAPI | Beyotime Biotechnology | C1002 | Nuclear counterstain |
| DMEM | Gibco | 11965092 | Cell culture |
| DMEM-F12 | Gibco | 12634010 | Cell culture |
| Dylight 549-conjugated goat anti-mouse IgG secondary antibody | Abbkine | A23310 | Indirect immunofluorescence analysis |
| Enhanced Cell Counting Kit-8 | Beyotime Biotechnology | C0042 | Measurement of cell viability and vitality |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10091 | Cell culture |
| Geneticin™ Selective Antibiotic | Gibco | 11811098 | Selective antibiotic |
| HAT Supplement (50X) | Gibco | 21060017 | Cell selection |
| HT Supplement (100X) | Gibco | 11067030 | Cell selection |
| Incomplete Freund’s adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | Animal immunization |
| isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside | Sigma-Aldrich | I5502 | Protein expression |
| kanamycin | Beyotime Biotechnology | ST102 | Bactericidal antibiotic |
| Leica TCS SP8 STED confocal microscope | Leica Microsystems | SP8 STED | Fluorescence imaging |
| Lipofectamine® 2000 Reagent | Thermofisher | 11668019 | Transfection |
| LSRFortessa™ fluorescence-activated cell sorting | BD | FACS LSRFortessa | Flow cytometry |
| Microplate reader | BioTek | BOX 998 | ELISA analysis |
| Micro spectrophotometer | Thermo Fisher | Nano Drop one | Nucleic acid concentration detection |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | Culture broth |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | Culture broth |
| Opti-MEM | Gibco | 31985088 | Cell culture |
| Polyethylene glycol 1500 | Roche Diagnostics | 10783641001 | Cell fusion |
| PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit | Takara Bio | RR047 | qPCR |
| protein A agarose | Beyotime Biotechnology | P2006 | Antibody protein purification |
| Protino® Ni+-TED 2000 Packed Columns | MACHEREY-NAGEL | 745120.5 | Protein purification |
| SBA Clonotyping System-HRP | Southern Biotech | May-00 | Isotyping of mouse monoclonal antibodies |
| Seamless Cloning Kit | Beyotime Biotechnology | D7010S | Construction of plasmids |
| Shake flasks | Beyotime Biotechnology | E3285 | Cell culture |
| Sodium carbonate-sodium bicarbonate buffer | Beyotime Biotechnology | C0221A | Cell culture |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-rad | 170-3940 | Western blot |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | Culture broth |
| Ultrasonic Homogenizer | Ningbo Xinzhi Biotechnology | JY92-IIN | Sample homogenization |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | Culture broth |
| 96-well microplate | Corning | 3599 | Cell culture |
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