Pseudomonas aeruginosa Enfeksiyon Modelinin Gerçek Zamanlı Değerlendirilmesi için Araçlar

Pseudomonas aeruginosa (Pa), bağışıklık sistemi zayıf bireylerde kronik enfeksiyonlar oluşturan fırsatçı bir patojendir. Genetik hastalığı kistik fibrozis (CF) olanlar için, bu enfeksiyonlar ömür boyu sürebilir. CF, zaman içinde çeşitli mikrobiyal patojenler tarafından kolonize edilen hava yollarında viskoz, besin bakımından zengin bir balganın birikmesine neden olur. Pa, erken çocukluk döneminde hava yollarını kolonlaştıran ve tedavisi zor enfeksiyonlar kuran en yaygın CF patojenlerinden biridir¹. Pa önemli bir klinik sorun olmaya devam ediyor ve son yıllarda iyileştirilmiş tedavi rejimlerine rağmen CF’lilerde önde gelen bir ölüm nedeni olarak kabul ediliyor^2,3. Bu kalıcılık fenotipi ve artan antibiyotik toleransı, Pa’ya hem Hastalık Kontrol Merkezleri (CDC) hem de Dünya Sağlık Örgütü (WHO) tarafından yeni terapötik stratejilerin geliştirilmesi için araştırma öncelikleri olarak tanımlanan bir grup patojende yer kazandırdı-ESKAPE patojenleri⁴.

Diğer ESKAPE patojenleri gibi, edinilmiş antibiyotik direnci Pa‘da yaygındır, ancak Pa antimikrobiyal toleransa katkıda bulunan birçok içsel özellik de vardır. Bunlar arasında Pa’nın CF hasta balgam 5^,6dahil olmak üzere birden fazla enfeksiyonda gözlemlenebilen ~ 10-1.000 hücreden oluşan agregalar-son derece yoğun kümeler oluşturma yeteneği vardır. Diğer biyofilm sistemlerinde çalışılan Pa’ya benzer şekilde, Pa agregaları antibiyotiklere karşı direncin artması ve hücre-hücre iletişiminin aktivasyonu (çekirdek algılama (QS)) gibi klinik olarak ilgili fenotipler gösterir. Örneğin, Pa agregalarının diğer mikroplarla mücadele etmek ve piocyanin üretimi gibi antimikrobiyal tedavileri tolere etmek için QS tarafından düzenlenmiş davranışları kullandığı gösterilmiştir⁷. Bu tür davranışları inceleme yeteneği, insan vücudunda var olduklarına benzer bir ortamda bakteri ekosistemleri hakkında heyecan verici bir içgörü sunar.

Pa agregalarının değişen balgam ortamına nasıl tepki verdiğini incelemenin en büyük zorluklarından biri, agrega oluşumunu destekleyen besinsel olarak alakalı ve sağlam sistemlerin olmamasıdır. Pa hakkında bilinenlerin çoğu, hücrelerin planktonik olarak büyüdüğü in vitro sistemler kullanılarak veya in vivo^8’degözlemlenmeyen karakteristik bir yüzeye bağlı “mantar” mimarisi kullanılarak keşfedilmiştir. Akış hücreleri veya katı agar gibi klasik biyofilm büyüme modelleri bakteriyel davranışlar ve antibiyotik tolerans mekanizmaları hakkında kapsamlı ve değerli bilgiler vermiş olsa da, bu bulgular her zaman in vivo olarak çevrilmez. Birçok in vitro model, insan enfeksiyon bölgesinin büyüme ortamını taklit etme yeteneğine sahiptir ve pahalı in vivo çalışmalar gerektirir. Buna karşılık, birçok in vivo model in vitro tekniklerin sağladığı esneklik ve çözünürlükten yoksundur.

Sentetik kistik fibrozis balgam (SCFM2), CF akciğerinde kronik enfeksiyon sırasında yaşananlara benzer pa büyümesi için bir ortam sağlamak üzere tasarlanmıştır. SCFM2, müsin, lipitler ve DNA’ya ek olarak balgam sputasında tanımlanan besin kaynaklarını içerir. SCFM2’deki pa büyümesi, gerçek balgamda büyüme için gerekene ayarlanmış neredeyse aynı geni gerektirir ve doğal Pa agrega oluşumunu^{destekler 9,10}. Aşılamadan sonra, planktonik hücreler genişleme yoluyla boyutu artan agregalar oluşturur. Tek tek hücreler (göçmenler olarak adlandırılır) agregalardan serbest bırakılır, kavunlanmamış alanlara geçirilir ve yeni agregalar^{oluşturur 10}. Bu yaşam öyküsü, tek bir hücrenin çözünürlüğünde CLSM ve görüntü analizi kullanılarak gözlemlenebilir. SCFM2’de oluşan Pa agregaları CF akciğer^10’dagözlenenlere benzer boyutlardadır. Bu model, mikron ölçeğinde gerçek zamanlı ve üç boyutta değişen boyutta birden fazla agreganın gözlemlenmesine izin verir. Zaman atlamalı mikroskopi, bir deneyde binlerce (~50.000) agreganın izlenmesini sağlar. Görüntü analizi yazılımının kullanımı, toplam hacim, yüzey alanı ve konum dahil olmak üzere mikrograflardan agrega fenotiplerinin hem bireysel toplam hem de popülasyon seviyelerinde en yakın 0,1 μm’ye kadar üç boyutta ölçülmesine olanak tanır. Agregaları fenotip ve konuma göre gruplandırma yeteneğine sahip olmak, farklı gelişim aşamalarındaki agregaların hassasiyetle farklılaştırılmasına ve değişen bir mikroçevreme^6,11’eyanıt vermelerine izin verir.

SCFM2’nin Pa agregalarını düşük hacimli ve yüksek verimli testlerde incelemek için uygulanması, onu esnek, uygun maliyetli bir model haline getirir. Tanımlanmış bir ortam olarak SCFM2, birden fazla platformda homojenlik ve tekrarlanabilirlik sunarak Pa agregalarını in vitro^9’daincelemek için besinsel ve fiziksel olarak alakalı bir yöntem sağlar. Uygulamalar, mekansal organizasyonu ve antibiyotik toleransını yüksek çözünürlükte gözlemlemek için CLSM ile birlikte kullanılmasını içerir (bu yöntem makalesinde açıklandığı gibi). Gerçek zamanlı, mikron ölçeğinde veriler sağlayan deneyler yapabilme yeteneği, tür içi ve türler arası etkileşimlerin vivo olarak ortaya çıkabileceği şekilde incelenmesineizin verir. Örneğin, SCFM2 daha önce virülans ve patogenez^6’yakatkıda bulunan birden fazla geni düzenlemek için Pa tarafından kullanılan bir sistem ağı aracılığıyla hücre-hücre iletişiminin toplam popülasyonlardaki mekansal dinamiklerini incelemek için kullanılmıştır.

Şekil 1: Ana deneysel adımların grafiksel tasviri. (A) SCFM2 Pa hücreleri ile aşılanır ve cam tabanlı bir kültür çanağı içinde agrega oluşturmasına izin verilir. (B) Agregalar konfokal mikroskopa aktarılır ve antibiyotik eklenir. Antibiyotik tedavisi olmadan üç teknik kopya (oda 1-3) ve aşılanmış SCFM2 kontrol kuyusu (4) tasvir edilir. Toplamlar 18 saat boyunca CLSM kullanılarak görüntülenir. Kısaltmalar: SCFM2 = sentetik kistik fibrozis balgam ortamı; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = konfokal lazer tarama mikroskopisi; FACS = floresanla etkinleştirilen hücre sıralama. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Burada, SCFM2’nin antibiyotik tedavisinin Pa agregaları üzerindeki etkisini gerçek zamanlı olarak incelemek için faydası gösterilmiştir, ardından aşağı akış analizi için farklı fenotiplere sahip agrega popülasyonlarını izole etmek için bir hücre sıralama yaklaşımının kullanılması (Şekil 1).