Инструменты для оценки в режиме реального времени модели инфекции Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (Pa) является оппортунистическим патогеном, который устанавливает хронические инфекции у людей с ослабленным иммунитетом. Для людей с генетическим заболеванием муковисцидоз (МВ) эти инфекции могут охватывать всю жизнь. Муковисцидоз вызывает накопление вязкой, богатой питательными веществами мокроты в дыхательных путях, которая со временем колонизируется различными микробными патогенами. Па является одним из наиболее распространенных патогенов муковисцидоза, колонизируя дыхательные пути в раннем детстве и устанавливая трудноизуемые инфекции¹. Па остается значительной клинической проблемой и считается ведущей причиной смертности у лиц с муковисцидозом, несмотря на улучшение схем терапии в последние^годы2,3. Этот фенотип персистенции и повышение толерантности к антибиотикам принесли Па место в группе патогенов, идентифицированных как Центрами по контролю и профилактике заболеваний (CDC), так и Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в качестве исследовательских приоритетов для разработки новых терапевтических стратегий – патогенов ESKAPE^4.

Как и другие патогены ESKAPE, приобретенная устойчивость к антибиотикам распространена в Pa,но есть также много внутренних свойств, которые способствуют антимикробной толерантности Pa. Среди них способность Па образовывать агрегаты — высокоплотные кластеры из ~10-1000 клеток, которые могут наблюдаться при множественных инфекциях, в том числе при МВ мокроте больного^5,6. Подобно Pa, изученным в других системах биопленки, агрегаты Pa демонстрируют клинически значимые фенотипы, такие как повышенная устойчивость к антибиотикам и активация клеточно-клеточной коммуникации (кворум-зондирование (QS)). Например, было показано, что агрегаты Па используют QS-регулируемое поведение для борьбы с другими микробами, а также переносят антимикробные методы лечения, такие как производство пиоцианина^7. Способность изучать такое поведение дает захватывающее представление о бактериальных экосистемах в среде, подобной той, в которой они существуют в организме человека.

Одной из самых больших проблем при изучении того, как агрегаты Pa реагируют на изменение среды мокроты, является отсутствие питательных и надежных систем, которые способствуют образованию агрегатов. Многое из того, что известно о Па, было обнаружено с использованием систем in vitro, в которых клетки растут планктонально или в характерной поверхностно-прикрепленной, «грибной» архитектуре, которая не наблюдалась in vivo^8. В то время как классические модели роста биопленки, такие как прототочные клетки или твердый агар, дали обширные и ценные знания о поведении бактерий и механизмах толерантности к антибиотикам, эти результаты не всегда переводятся in vivo. Многие модели in vitro имеют ограниченную способность имитировать среду роста места инфекции человека, что требует дорогостоящих исследований in vivo. В свою очередь, многим моделям in vivo не хватает гибкости и разрешения, предоставляемых методами in vitro.

Синтетический муковисцидоз мокроты (SCFM2) предназначен для обеспечения среды для роста Па, аналогичной той, которая наблюдается во время хронической инфекции в легких муковисцидоза. SCFM2 включает источники питания, идентифицированные в отхаркиваемой смуте CF в дополнение к муцину, липидам и ДНК. Рост Pa в SCFM2 требует почти идентичного набора генов, необходимых для роста фактической мокроты, и поддерживает естественное образование агрегата Pa ^9,10. После инокуляции планктонные клетки образуют агрегаты, которые увеличиваются в размерах за счет расширения. Отдельные клетки (называемые мигрантами) высвобождаются из агрегатов, мигрируют в неколонизированные районы и образуют новые агрегаты^10. Эту историю жизни можно наблюдать с помощью CLSM и анализа изображений с разрешением одной клетки. Агрегаты Па, образующиеся в SCFM2, имеют размеры, аналогичные тем, которые наблюдаются в легком^{CF 10.} Эта модель позволяет наблюдать несколько агрегатов различного размера в режиме реального времени и в трех измерениях в микроновом масштабе. Покадровая микроскопия позволяет отслеживать тысячи (~50 000) агрегатов в одном эксперименте. Использование программного обеспечения для анализа изображений позволяет количественно оценить совокупные фенотипы по микроснимкам, включая совокупный объем, площадь поверхности и положение в трех измерениях до ближайших 0,1 мкм, как на индивидуальном агрегированном, так и на популяционном уровнях. Наличие способности группировать агрегаты по фенотипу и положению позволяет с точностью дифференцировать агрегаты на разных стадиях развития, а также их реакцию на изменение^{микросреды 6,11.}

Применение SCFM2 для изучения агрегатов Pa в анализах с низким объемом и высокой пропускной способностью делает его гибкой и экономически эффективной моделью. В качестве определенной среды SCFM2 обеспечивает однородность и воспроизводимость на нескольких платформах, обеспечивая питательную и физически релевантную методику изучения агрегатов Pa in vitro^9. Приложения включают его использование в сочетании с CLSM для наблюдения пространственной организации и толерантности к антибиотикам при высоком разрешении (как описано в этой статье о методах). Возможность проводить эксперименты, которые предоставляют данные в микроновом масштабе в режиме реального времени, позволяет изучать внутривидовые и межвидовые взаимодействия, поскольку они могут происходить in vivo. Например, SCFM2 ранее использовался для изучения пространственной динамики клеточно-клеточной коммуникации в совокупных популяциях через сеть систем, используемых Pa для регулирования нескольких генов, которые способствуют вирулентности и патогенезу^6.

Рисунок 1:Графическое изображение основных экспериментальных этапов. (A)SCFM2 инокулируют Па-клетками и позволяют формировать агрегаты в чашке со стеклянным дном. (B) Агрегаты переносятся в конфокальный микроскоп и добавляют антибиотик. Изображены три технические реплики (камеры 1-3) и контрольная скважина (4) инокулированного SCFM2 без лечения антибиотиками. Агрегаты визуализируются с использованием CLSM в течение 18 ч. (C) После первоначальной 18-ч визуализации агрегаты обрабатывают йодидом пропидия для визуализации мертвых клеток и визуализируют с помощью CLSM (D) Агрегаты с желаемым фенотипом отделяют от SCFM2 с помощью FACS. Сокращения: SCFM2 = синтетический муковисцидоз мокроты; Pa = Синегнойная палочка; CLSM = конфокальная лазерная сканирующая микроскопия; FACS = флуоресцентная сортировка клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Здесь демонстрируется полезность SCFM2 для изучения влияния лечения антибиотиками на агрегаты Pa в режиме реального времени, за которым следует использование клеточного подхода для выделения популяций агрегатов с различными фенотипами для последующего анализа(рисунок 1).