Werkzeuge zur Echtzeitbewertung eines Pseudomonas aeruginosa-Infektionsmodells

Pseudomonas aeruginosa (Pa) ist ein opportunistischer Erreger, der chronische Infektionen bei immungeschwächten Personen hervorruft. Bei Menschen mit der Erbkrankheit Mukoviszidose (CF) können diese Infektionen den Verlauf eines Lebens umfassen. CF verursacht den Aufbau eines viskosen, nährstoffreichen Auswurfs in den Atemwegen, der im Laufe der Zeit von einer Vielzahl mikrobieller Krankheitserreger besiedelt wird. Pa ist einer der häufigsten CF-Erreger, der die Atemwege in der frühen Kindheit besiedelt und schwer zu behandelnde Infektionen etabliert¹. Pa bleibt ein signifikantes klinisches Problem und gilt als eine der häufigsten Todesursachen bei Menschen mit CF, trotz verbesserter Therapieschemata in den letzten Jahren^2,3. Dieser Persistenzphänotyp und die zunehmende Antibiotikatoleranz haben Pa einen Platz in einer Gruppe von Krankheitserregern eingebracht, die sowohl von den Centers for Disease Control (CDC) als auch von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) als Forschungsprioritäten für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien identifiziert wurden – die ESKAPE-Erreger⁴.

Wie bei anderen ESKAPE-Erregern ist die erworbene Antibiotikaresistenz bei Paüblich, aber es gibt auch viele intrinsische Eigenschaften, die zur antimikrobiellen Toleranz von Pa beitragen. Dazu gehört die Fähigkeit von Pa, Aggregate zu bilden – hochdichte Cluster von ~ 10-1.000 Zellen, die bei mehreren Infektionen beobachtet werden können, einschließlich CF-Patienten-Sputum^5,6. Ähnlich wie Pa, das in anderen Biofilmsystemen untersucht wurde, zeigen Pa-Aggregate klinisch relevante Phänotypen wie erhöhte Antibiotikaresistenz und Aktivierung der Zell-Zell-Kommunikation (Quorum Sensing (QS)). Zum Beispiel wurde gezeigt, dass Aggregate von Pa QS-reguliertes Verhalten verwenden, um andere Mikroben zu bekämpfen und antimikrobielle Behandlungen wie die Produktion von Pyocyanin⁷zu tolerieren. Die Fähigkeit, solche Verhaltensweisen zu untersuchen, bietet einen spannenden Einblick in bakterielle Ökosysteme in einer Umgebung, die derjenigen ähnelt, in der sie im menschlichen Körper vorkommen.

Eine der größten Herausforderungen bei der Untersuchung, wie Pa-Aggregate auf die sich verändernde Sputumumgebung reagieren, ist das Fehlen ernährungsrelevanter und robuster Systeme, die die Aggregatbildung fördern. Vieles von dem, was über Pa bekannt ist, wurde mit In-vitro-Systemen entdeckt, in denen Zellen planktonisch oder in einer charakteristischen oberflächengebundenen “Pilz”-Architektur wachsen, die in vivo⁸nicht beobachtet wurde. Während klassische Biofilm-Wachstumsmodelle wie Flusszellen oder fester Agar umfangreiches und wertvolles Wissen über bakterielles Verhalten und Mechanismen der Antibiotikatoleranz gewonnen haben, lassen sich diese Ergebnisse nicht immer in vivo übersetzen. Viele In-vitro-Modelle haben eine begrenzte Fähigkeit, die Wachstumsumgebung der menschlichen Infektionsstelle nachzuahmen, was kostspielige In-vivo-Studien erfordert. Im Gegenzug fehlt vielen In-vivo-Modellen die Flexibilität und Auflösung, die In-vitro-Techniken bieten.

Synthetischer Mukoviszidose-Sputum (SCFM2) wurde entwickelt, um eine Umgebung für das Pa-Wachstum zu schaffen, die der bei chronischen Infektionen in der CF-Lunge ähnelt. SCFM2 umfasst Nährstoffquellen, die in schleimlöserter CF-Sputa zusätzlich zu Mucin, Lipiden und DNA identifiziert wurden. Das Pa-Wachstum in SCFM2 erfordert ein nahezu identisches Gen, das für das Wachstum im tatsächlichen Sputum erforderlich ist, und unterstützt die natürliche^{Pa-Aggregatbildung 9,10}. Nach der Impfung bilden planktonische Zellen Aggregate, die durch Expansion an Größe zunehmen. Einzelne Zellen (als Migranten bezeichnet) werden aus Aggregaten freigesetzt, wandern in unbesilumisierte Gebiete und bilden neue Aggregate¹⁰. Diese Lebensgeschichte kann mittels CLSM und Bildanalyse bei der Auflösung einer einzelnen Zelle beobachtet werden. Die in SCFM2 gebildeten Pa-Aggregate sind ähnlich groß wie die in der CF-Lunge¹⁰beobachteten. Dieses Modell ermöglicht die Beobachtung mehrerer Aggregate unterschiedlicher Größe in Echtzeit und in drei Dimensionen im Mikrometerbereich. Die Zeitraffermikroskopie ermöglicht die Verfolgung von Tausenden (~ 50.000) aggregaten in einem Experiment. Die Verwendung von Bildanalysesoftware ermöglicht die Quantifizierung von aggregierten Phänotypen aus Mikroaufnahmen, einschließlich Aggregatvolumen, Oberfläche und Position in drei Dimensionen auf die nächsten 0,1 μm, sowohl auf der Ebene des einzelnen Aggregats als auch der Population. Die Fähigkeit, Aggregate nach Phänotyp und Position zu gruppieren, ermöglicht die präzise Differenzierung von Aggregaten in verschiedenen Entwicklungsstadien sowie ihre Reaktion auf eine sich verändernde Mikroumgebung^6,11.

Die Anwendung von SCFM2 zur Untersuchung von Pa-Aggregaten in Assays mit geringem Volumen und hohem Durchsatz macht es zu einem flexiblen, kostengünstigen Modell. Als definiertes Medium bietet SCFM2 Einheitlichkeit und Reproduzierbarkeit über mehrere Plattformen hinweg und bietet eine ernährungsphysiologisch und physikalisch relevante Methode zur Untersuchung von Pa-Aggregaten in vitro⁹. Zu den Anwendungen gehört die Verwendung in Kombination mit CLSM zur Beobachtung der räumlichen Organisation und antibiotikatoleranz bei hoher Auflösung (wie in diesem Methodenpapier beschrieben). Die Fähigkeit, Experimente durchzuführen, die Echtzeitdaten im Mikrometerbereich liefern, ermöglicht die Untersuchung von Interaktionen innerhalb und zwischen Spezies, wie sie in vivoauftreten können. Zum Beispiel wurde SCFM2 zuvor verwendet, um die räumliche Dynamik der Zell-Zell-Kommunikation in aggregierten Populationen über ein Netzwerk von Systemen zu untersuchen, die von Pa verwendet werden, um mehrere Gene zu regulieren, die zur Virulenz und Pathogenese beitragen⁶.

Abbildung 1: Grafische Darstellung der wichtigsten experimentellen Schritte. (A) SCFM2 wird mit Pa-Zellen geimpft und darf in einer Kulturschale mit Glasboden Aggregate bilden. (B) Aggregate werden auf das konfokale Mikroskop übertragen und Antibiotika hinzugefügt. Dargestellt sind drei technische Replikate (Kammern 1-3) und eine Kontrollbohrung (4) von geimpften SCFM2 ohne antibiotikafreie Behandlung. Aggregate werden mit CLSM im Laufe von 18 h abgebildet. (C) Nach der ersten 18-h-Bildgebung werden Aggregate mit Propidieniodid behandelt, um tote Zellen zu visualisieren, und mit CLSM abgebildet (D) Aggregate mit gewünschtem Phänotyp werden mitHILFE VON FACS von SCFM2 getrennt. Abkürzungen: SCFM2 = synthetisches Mukoviszidose-Sputummedium; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = konfokale Laserscanning-Mikroskopie; FACS = fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Hier wird der Nutzen von SCFM2 zur Untersuchung der Auswirkungen der Antibiotikabehandlung auf Pa-Aggregate in Echtzeit demonstriert, gefolgt von der Verwendung eines Zellsortierungsansatzes zur Isolierung von Populationen von Aggregaten mit unterschiedlichen Phänotypen für die nachgelagerte Analyse (Abbildung 1).