Outils pour l’évaluation en temps réel d’un modèle d’infection à Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa (Pa) est un agent pathogène opportuniste qui établit des infections chroniques chez les personnes immunodéprimées. Pour les personnes atteintes de la maladie génétique de la fibrose kystique (FK), ces infections peuvent s’étendre sur toute une vie. La mucoviscidose provoque l’accumulation d’expectorations visqueuses et riches en nutriments dans les voies respiratoires, qui deviennent colonisées par une variété d’agents pathogènes microbiens au fil du temps. Le Pa est l’un des agents pathogènes les plus répandus de la FK, colonisant les voies respiratoires dans la petite enfance et établissant des infections difficiles à traiter¹. L’AP demeure un problème clinique important et est considérée comme l’une des principales causes de mortalité chez les personnes atteintes de mucoviscidose, malgré l’amélioration des schémas thérapeutiques au cours des dernières années^2,3. Ce phénotype persistance et l’augmentation de la tolérance aux antibiotiques ont valu à Pa une place dans un groupe d’agents pathogènes identifiés par les Centers for Disease Control (CDC) et l’Organisation mondiale de la santé (OMS) comme des priorités de recherche pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques – les agents pathogènes ESKAPE⁴.

Comme d’autres agents pathogènes ESKAPE, la résistance aux antibiotiques acquise est courante dans le Pa,mais il existe également de nombreuses propriétés intrinsèques qui contribuent à la tolérance aux antimicrobiens du Pa. Parmi ceux-ci se trouve la capacité de Pa à former des agrégats-grappes très denses d’environ 10 à 1 000 cellules, qui peuvent être observées dans de multiples infections, y compris les expectorations des patients atteints de mucoviscidose^5,6. Semblables à Pa étudiés dans d’autres systèmes de biofilm, les agrégats de Pa présentent des phénotypes cliniquement pertinents tels qu’une résistance accrue aux antibiotiques et l’activation de la communication cellule-cellule (quorum sensing (QS)). Par exemple, il a été démontré que les agrégats de Pa utilisent des comportements régulés par QS pour lutter contre d’autres microbes et tolèrent des traitements antimicrobiens tels que la production de pyocyanine^7. La capacité d’étudier de tels comportements offre un aperçu passionnant des écosystèmes bactériens dans un environnement similaire à celui dans lequel ils existent dans le corps humain.

L’un des plus grands défis de l’étude de la façon dont les agrégats de Pa réagissent à l’environnement changeant des expectorations est le manque de systèmes pertinents et robustes sur le plan nutritionnel qui favorisent la formation d’agrégats. Une grande partie de ce que l’on sait sur le Pa a été découverte à l’aide de systèmes in vitro dans lesquels les cellules se développent planctoniquement ou dans une architecture caractéristique de « champignon » attachée à la surface qui n’a pas été observée in vivo⁸. Alors que les modèles classiques de croissance du biofilm, tels que les cellules d’écoulement ou la gélose solide, ont fourni des connaissances approfondies et précieuses sur les comportements bactériens et les mécanismes de tolérance aux antibiotiques, ces résultats ne se traduisent pas toujours in vivo. De nombreux modèles in vitro ont une capacité limitée à imiter l’environnement de croissance du site d’infection humaine, ce qui nécessite des études in vivo coûteuses. À leur tour, de nombreux modèles in vivo n’ont pas la flexibilité et la résolution offertes par les techniques in vitro.

Les expectorations synthétiques de fibrose kystique (SCFM2) sont conçues pour fournir un environnement de croissance de l’AP similaire à celui ressenti lors d’une infection chronique dans le poumon de la FK. SCFM2 comprend des sources nutritionnelles identifiées dans la sputa de FK expectorée en plus de la mucine, des lipides et de l’ADN. La croissance du Pa dans SCFM2 nécessite un ensemble de gènes presque identique à celui requis pour la croissance des expectorations réelles et soutient la formation naturelle d’agrégats de Pa ^9,10. Après l’inoculation, les cellules planctoniques forment des agrégats dont la taille augmente par expansion. Les cellules individuelles (appelées migrants) sont libérées des agrégats, migrent vers des zones non colonisées et forment de nouveaux agrégats¹⁰. Cette histoire de vie peut être observée à l’aide de CLSM et de l’analyse d’images à la résolution d’une seule cellule. Les agrégats de Pa formés dans SCFM2 sont de tailles similaires à celles observées dans le poumon CF¹⁰. Ce modèle permet l’observation de multiples agrégats de taille variable en temps réel et en trois dimensions à l’échelle du micron. La microscopie en accéléré permet de suivre des milliers (~ 50 000) d’agrégats en une seule expérience. L’utilisation d’un logiciel d’analyse d’images permet de quantifier les phénotypes agrégés à partir de micrographies, y compris le volume agrégé, la surface et la position en trois dimensions au 0,1 μm le plus proche, à la fois au niveau de l’agrégat individuel et au niveau de la population. Avoir la capacité de regrouper les agrégats par phénotype et position permet la différenciation des agrégats à différents stades de développement avec précision, ainsi que leur réponse à un microenvironnement changeant^6,11.

L’application de SCFM2 pour étudier les agrégats de Pa dans des essais à faible volume et à haut débit en fait un modèle flexible et rentable. En tant que milieu défini, SCFM2 offre uniformité et reproductibilité sur plusieurs plates-formes, fournissant une méthode nutritionnellement et physiquement pertinente pour étudier les agrégats de Pa in vitro⁹. Les applications incluent son utilisation en combinaison avec CLSM pour observer l’organisation spatiale et la tolérance aux antibiotiques à haute résolution (comme décrit dans ce document sur les méthodes). La capacité d’effectuer des expériences qui fournissent des données en temps réel à l’échelle du micron permet d’étudier les interactions intra-espèces et inter-espèces telles qu’elles peuvent se produire in vivo. Par exemple, SCFM2 a déjà été utilisé pour étudier la dynamique spatiale de la communication cellule-cellule dans des populations agrégées via un réseau de systèmes utilisés par Pa pour réguler plusieurs gènes qui contribuent à la virulence et à la pathogenèse⁶.

Figure 1: Représentation graphique des principales étapes expérimentales. (A) SCFM2 est inoculé avec des cellules Pa et autorisé à former des agrégats dans une boîte de culture à fond de verre. (B) Les agrégats sont transférés au microscope confocal et un antibiotique est ajouté. Trois répliques techniques (chambres 1 à 3) et un puits de contrôle (4) de SCFM2 inoculé sans traitement antibiotique sont représentés. Les agrégats sont imagés à l’aide de CLSM au cours de 18 h. (C) Après l’imagerie initiale de 18 heures, les agrégats sont traités avec de l’iodure de propidium pour visualiser les cellules mortes et imagés à l’aide de CLSM (D) Les agrégats avec le phénotype souhaité sont séparés de SCFM2 à l’aide de FACS. Abréviations : SCFM2 = milieu d’expectorations synthétiques de fibrose kystique; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = microscopie confocale à balayage laser; FACS = tri cellulaire activé par fluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Ici, l’utilité de SCFM2 pour étudier l’impact du traitement antibiotique sur les agrégats pa en temps réel est démontrée, suivie de l’utilisation d’une approche de tri cellulaire pour isoler des populations d’agrégats avec des phénotypes distincts pour une analyse en aval(Figure 1).