Tools voor de real-time beoordeling van een Pseudomonas aeruginosa-infectiemodel

Pseudomonas aeruginosa (Pa) is een opportunistische ziekteverwekker die chronische infecties vaststelt bij immuungecompromitteerde personen. Voor mensen met de genetische ziekte cystic fibrosis (CF), kunnen deze infecties de loop van een leven duren. CF veroorzaakt de opbouw van een stroperig, voedingsrijk sputum in de luchtwegen, dat in de loop van de tijd wordt gekoloniseerd door een verscheidenheid aan microbiële pathogenen. Pa is een van de meest voorkomende CF-pathogenen, koloniseert de luchtwegen in de vroege kinderjaren en stelt moeilijk te behandelen infecties vast¹. Pa blijft een belangrijk klinisch probleem en wordt beschouwd als een belangrijke doodsoorzaak bij mensen met CF, ondanks verbeterde therapieregimes in de afgelopen jaren^2,3. Dit persistentiefenotype en toenemende antibioticatolerantie hebben Pa een plaats opgeleverd in een groep pathogenen die door zowel de Centers for Disease Control (CDC) als de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) zijn geïdentificeerd als onderzoeksprioriteiten voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën – de ESKAPE-pathogenen⁴.

Net als andere ESKAPE-pathogenen komt verworven antibioticaresistentie vaak voor bij Pa, maar er zijn ook veel intrinsieke eigenschappen die bijdragen aan de antimicrobiële tolerantie van Pa. Onder deze is het vermogen van Pa om aggregaten-zeer dichte clusters van ~ 10-1.000 cellen te vormen, die kunnen worden waargenomen bij meerdere infecties, waaronder CF-patiënt sputum^5,6. Vergelijkbaar met Pa bestudeerd in andere biofilmsystemen, vertonen Pa-aggregaten klinisch relevante fenotypen zoals verhoogde resistentie tegen antibiotica en activering van cel-celcommunicatie (quorum sensing (QS)). Van aggregaten van Pa is bijvoorbeeld aangetoond dat ze QS-gereguleerd gedrag gebruiken om andere microben te bestrijden en antimicrobiële behandelingen zoals de productie van pyocyanine te verdragen⁷. Het vermogen om dergelijk gedrag te bestuderen biedt een opwindend inzicht in bacteriële ecosystemen in een omgeving die vergelijkbaar is met die waarin ze in het menselijk lichaam bestaan.

Een van de grootste uitdagingen bij het bestuderen van hoe Pa-aggregaten reageren op de veranderende sputumomgeving is het gebrek aan nutritioneel relevante en robuuste systemen die de vorming van aggregaten bevorderen. Veel van wat bekend is over Pa is ontdekt met behulp van in vitro systemen waarin cellen planktonisch groeien of in een karakteristieke aan het oppervlak gehechte, “paddenstoel” -architectuur die niet in vivo is waargenomen ⁸. Hoewel klassieke biofilmgroeimodellen, zoals stromingscellen of vaste agar, uitgebreide en waardevolle kennis hebben opgeleverd over bacterieel gedrag en mechanismen van antibioticatolerantie, vertalen deze bevindingen zich niet altijd in vivo. Veel in vitro modellen hebben een beperkt vermogen om de groeiomgeving van de menselijke infectieplaats na te bootsen, waardoor kostbare in vivo studies nodig zijn. Op hun beurt missen veel in vivo modellen de flexibiliteit en resolutie die in vitro technieken bieden.

Synthetische cystic fibrosis sputum (SCFM2) is ontworpen om een omgeving voor Pa-groei te bieden die vergelijkbaar is met die ervaren tijdens chronische infectie in de CF-long. SCFM2 omvat voedingsbronnen geïdentificeerd in slijmolijmoste CF sputa naast mucine, lipiden en DNA. Pa-groei in SCFM2 vereist een bijna identiek gen dat is ingesteld als dat nodig is voor groei in feitelijk sputum en ondersteunt natuurlijke Pa-aggregaatvorming ^9,10. Na inenting vormen planktonische cellen aggregaten die in omvang toenemen door expansie. Individuele cellen (aangeduid als migranten) worden vrijgegeven uit aggregaten, migreren naar niet-gecoloniseerde gebieden en vormen nieuwe aggregaten¹⁰. Deze levensgeschiedenis kan worden waargenomen met behulp van CLSM en beeldanalyse met de resolutie van een enkele cel. Aggregaten van Pa gevormd in SCFM2 zijn van vergelijkbare grootte als die waargenomen in de CF-long¹⁰. Dit model maakt het mogelijk om meerdere aggregaten van verschillende grootte in real-time en in drie dimensies op micronschaal te observeren. Time-lapse microscopie maakt het mogelijk om duizenden (~ 50.000) aggregaten in één experiment te volgen. Het gebruik van beeldanalysesoftware maakt het mogelijk om geaggregeerde fenotypen uit micrografieën te kwantificeren, inclusief geaggregeerd volume, oppervlakte en positie in drie dimensies tot op 0,1 μm, zowel op individueel geaggregeerd als populatieniveau. Het vermogen om aggregaten te groeperen op fenotype en positie maakt de differentiatie van aggregaten in verschillende ontwikkelingsstadia met precisie mogelijk, evenals hun reactie op een veranderende micro-omgeving^6,11.

De toepassing van SCFM2 om Pa-aggregaten te bestuderen in lage volumes en high-throughput assays maken het een flexibel, kosteneffectief model. Als gedefinieerd medium biedt SCFM2 uniformiteit en reproduceerbaarheid op meerdere platforms, waardoor een nutritioneel en fysiek relevante methode wordt geboden om Pa-aggregaten in vitro te ^{bestuderen 9}. Toepassingen omvatten het gebruik ervan in combinatie met CLSM om ruimtelijke organisatie en antibioticatolerantie bij hoge resolutie te observeren (zoals beschreven in dit methodendocument). De mogelijkheid om experimenten uit te voeren die real-time gegevens op micronschaal opleveren, maakt de studie van intra-species en inter-species interacties mogelijk, omdat ze in vivokunnen voorkomen. SCFM2 is bijvoorbeeld eerder gebruikt om de ruimtelijke dynamiek van cel-celcommunicatie in geaggregeerde populaties te bestuderen via een netwerk van systemen die door Pa worden gebruikt om meerdere genen te reguleren die bijdragen aan virulentie en pathogenese⁶.

Figuur 1: Grafische weergave van de belangrijkste experimentele stappen. (A) SCFM2 wordt ingeënt met Pa-cellen en mag aggregaten vormen in een kweekschaal met glazen bodem. (B) Aggregaten worden overgebracht naar de confocale microscoop en antibioticum wordt toegevoegd. Afgebeeld zijn drie technische replicaties (kamers 1-3) en een controleput (4) van geënt SCFM2 zonder antibioticabehandeling. Aggregaten worden afgebeeld met behulp van CLSM in de loop van 18 h. (C) Na de eerste 18-h beeldvorming worden aggregaten behandeld met propidiumjodide om dode cellen te visualiseren en afgebeeld met CLSM (D) Aggregaten met het gewenste fenotype worden gescheiden van SCFM2 met behulp van FACS. Afkortingen: SCFM2 = synthetische cystic fibrosis sputum medium; Pa = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = confocale laser scanning microscopie; FACS = fluorescentie-geactiveerde celsortering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Hier wordt het nut van SCFM2 aangetoond om de impact van antibioticabehandeling op Pa-aggregaten in realtime te bestuderen, gevolgd door het gebruik van een celsorteerbenadering om populaties van aggregaten met verschillende fenotypen te isoleren voor downstream-analyse (figuur 1).