أدوات للتقييم في الوقت الحقيقي لنموذج عدوى السودوموناس aeruginosa
Summary
الاصطناعية التليف الكيسي البلغم المتوسطة (SCFM2) يمكن استخدامها في تركيبة مع كل من الليزر confocal المسح المجهري والفلورسينس تنشيط فرز الخلايا لمراقبة المجاميع البكتيرية في قرار عالية. تفصل هذه الورقة طرق تقييم المجموعات السكانية الإجمالية أثناء العلاج المضاد للميكروبات كمنصة للدراسات المستقبلية.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa (Pa) هي واحدة من مسببات الأمراض الانتهازية الأكثر شيوعا المرتبطة بالتليف الكيسي (CF). بمجرد تأسيس استعمار السلطة الفلسطينية ، تشكل نسبة كبيرة من البكتيريا المصابة الأغشية الحيوية داخل بغم مجرى الهواء. وقد ثبت أن الأغشية الحيوية Pa المعزولة عن البلغم CF تنمو في مجاميع صغيرة وكثيفة من ~ 10-1000 خلية يتم تنظيمها مكانيا وتظهر الأنماط الظاهرية ذات الصلة سريريا مثل تحمل مضادات الميكروبات. أحد أكبر التحديات لدراسة كيفية استجابة مجاميع Pa لبيئة البلغم المتغيرة هو عدم وجود أنظمة ذات صلة من الناحية التغذوية وقوية تعزز التكوين الكلي. باستخدام وسيطة البلغم CF الاصطناعية (SCFM2)، يمكن ملاحظة تاريخ حياة المجاميع السلطة الفلسطينية باستخدام المجهر المسح بالليزر confocal (CLSM) وتحليل الصور في قرار خلية واحدة. يسمح هذا النظام في المختبر بمراقبة آلاف المجاميع ذات الحجم المتفاوت في الوقت الحقيقي وثلاثة أبعاد وعلى مقياس ميكرون. وعلى المستويين الفردي والسكاني، فإن القدرة على تجميع المجاميع حسب النمط الظاهري والموقع تسهل مراقبة المجاميع في مراحل النمو المختلفة واستجابتها للتغيرات في البيئة الدقيقة، مثل العلاج بالمضادات الحيوية، التي يمكن تمييزها بدقة.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa (Pa) هو ممرض انتهازي يؤسس التهابات مزمنة في الأفراد الذين يتعرضون للخطر المناعي. بالنسبة لأولئك الذين يعانون من التليف الكيسي المرض الوراثي (CF)، يمكن لهذه العدوى تمتد على مدى العمر. CF يسبب تراكم البلغم لزجة وغنية بالمغذيات في الشعب الهوائية، والتي تصبح مستعمرة من قبل مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض الميكروبية مع مرور الوقت. السلطة الفلسطينية هي واحدة من مسببات الأمراض CF الأكثر انتشارا، واستعمار الشعب الهوائية في مرحلة الطفولة المبكرة وإنشاء العدوى التي يصعب علاجها1. السلطة الفلسطينية لا تزال مشكلة سريرية كبيرة ويعتبر السبب الرئيسي للوفيات في أولئك الذين يعانون من CF, على الرغم من تحسين نظم العلاج في السنوات الأخيرة2,3. وقد أكسب هذا النمط الظاهري المستمر وزيادة تحمل المضادات الحيوية Pa مكانا في مجموعة من مسببات الأمراض التي حددها كل من مراكز مكافحة الأمراض (CDC) ومنظمة الصحة العالمية (WHO) كأولويات بحثية لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة – مسببات الأمراض ESKAPE4.
مثل مسببات الأمراض الأخرى ESKAPE، اكتسبت مقاومة المضادات الحيوية أمر شائع في السلطة الفلسطينية،ولكن هناك أيضا العديد من الخصائص الجوهرية التي تسهم في التسامح Pa مضادات الميكروبات. من بين هذه هي قدرة السلطة الفلسطينية لتشكيل مجموعات المجاميع كثيفة للغاية من ~ 10-1000 الخلايا، والتي يمكن ملاحظتها في التهابات متعددة، بما في ذلك CF البلغم المريض5،6. على غرار Pa التي تمت دراستها في أنظمة بيو فيلم أخرى ، تعرض مجاميع Pa الأنماط الظاهرية ذات الصلة سريريا مثل زيادة مقاومة المضادات الحيوية وتنشيط الاتصالات الخلوية الخلية (استشعار النصاب القانوني (QS)). على سبيل المثال، وقد ثبت أن المجاميع من السلطة الفلسطينية لاستخدام السلوكيات QS التي تنظمها لمكافحة الميكروبات الأخرى، فضلا عن تحمل العلاجات المضادة للميكروبات مثل إنتاج البايوسيانين7. القدرة على دراسة مثل هذه السلوكيات يقدم نظرة مثيرة في النظم الإيكولوجية البكتيرية في بيئة مماثلة لتلك التي توجد في جسم الإنسان.
أحد أكبر التحديات لدراسة كيفية استجابة مجاميع Pa لبيئة البلغم المتغيرة هو عدم وجود أنظمة ذات صلة من الناحية التغذوية وقوية تعزز التكوين الكلي. وقد تم اكتشاف الكثير مما هو معروف عن السلطة الفلسطينية باستخدام النظم المختبرية التي تنمو الخلايا العوالق أو في سطح مميز المرفقة، “الفطر” العمارة التي لم يلاحظ في الجسم الحي8. في حين أن نماذج نمو البيو فيلم الكلاسيكية، مثل خلايا التدفق أو أجار الصلبة، قد أسفرت عن معرفة واسعة وقيمة حول السلوكيات البكتيرية وآليات التسامح مع المضادات الحيوية، وهذه النتائج لا تترجم دائما في الجسم الحي. العديد من النماذج في المختبر لديها قدرة محدودة على محاكاة بيئة النمو في موقع العدوى البشرية، مما يتطلب مكلفة في الدراسات الحية. بدوره، يفتقر العديد من نماذج الجسم الحي إلى المرونة والدقة التي توفرها التقنيات المختبرية.
تم تصميم البلغم التليف الكيسي الاصطناعية (SCFM2) لتوفير بيئة لنمو السلطة الفلسطينية مماثلة لتلك التي شهدتها خلال العدوى المزمنة في الرئة CF. SCFM2 يشمل المصادر الغذائية المحددة في sputa CF المتوقعة بالإضافة إلى الموسين والدهون والحمض النووي. السلطة الفلسطينية النمو في SCFM2 يتطلب مجموعة الجينات متطابقة تقريبا لتلك المطلوبة للنمو في البلغم الفعلي ويدعم الطبيعية السلطة الفلسطينية تشكيل الكلي9,10. بعد التطعيم، تشكل الخلايا العوالق مجاميع تزيد في الحجم من خلال التوسع. يتم تحرير الخلايا الفردية (يشار إليها باسم المهاجرين) من المجاميع، والهجرة إلى مناطق غير مستعمرة، وتشكيل مجاميع جديدة10. يمكن ملاحظة تاريخ الحياة هذا باستخدام CLSM وتحليل الصورة بدقة خلية واحدة. المجاميع من السلطة الفلسطينية التي تشكلت في SCFM2 هي من أحجام مماثلة لتلك التي لوحظت في الرئة CF10. يسمح هذا النموذج بمراقبة مجاميع متعددة ذات حجم مختلف في الوقت الفعلي وفي ثلاثة أبعاد على مقياس ميكرون. يسمح الفحص المجهري الفاصل زمنيا بتتبع الآلاف (حوالي 50,000) من المجاميع في تجربة واحدة. يسمح استخدام برنامج تحليل الصور بتقدير الأنماط الظاهرية الكلية من الصور الدقيقة، بما في ذلك الحجم الكلي والمساحة السطحية والموقع في ثلاثة أبعاد لأقرب 0.1 ميكرومتر، على مستوى التجميع الفردي والسكان على حد سواء. وجود القدرة على تجميع المجاميع حسب النمط الظاهري والموقف يسمح لتمايز المجاميع في مراحل النمو المختلفة بدقة ، فضلا عن استجابتها للبيئة الدقيقة المتغيرة6،11.
تطبيق SCFM2 لدراسة المجاميع السلطة الفلسطينية في حجم منخفض وأعلى الإنتاجية المقايسات جعله نموذجا مرنا وفعالا من حيث التكلفة. كوسيط محدد، يوفر SCFM2 التوحيد والتكرار عبر منصات متعددة، وتوفير طريقة ذات صلة من الناحية التغذوية والبدنية لدراسة المجاميع السلطة الفلسطينية في المختبر9. وتشمل التطبيقات استخدامه في تركيبة مع CLSM لمراقبة التنظيم المكاني والتسامح مع المضادات الحيوية بدقة عالية (كما هو موضح في ورقة الأساليب هذه). القدرة على إجراء التجارب التي توفر في الوقت الحقيقي، والبيانات على نطاق ميكرون يسمح لدراسة التفاعلات داخل الأنواع وبين الأنواع لأنها قد تحدث في الجسم الحي. على سبيل المثال، سبق استخدام SCFM2 لدراسة الديناميات المكانية للاتصال بين الخلايا في مجموعات سكانية إجمالية عبر شبكة من الأنظمة التي تستخدمها السلطة الفلسطينية لتنظيم الجينات المتعددة التي تساهم في الفوعة ومسببات الأمراض6.
الشكل 1: تصوير رسومية من الخطوات التجريبية الرئيسية. (أ) يتم تلقيح SCFM2 مع خلايا السلطة الفلسطينية ويسمح لتشكيل المجاميع في طبق ثقافة الزجاج القاع. (ب)يتم نقل المجاميع إلى المجهر confocal، ويتم إضافة المضادات الحيوية. يصور ثلاثة تكرارات تقنية (الغرف 1-3) وبخير تحكم (4) من SCFM2 الملقح دون علاج بالمضادات الحيوية. يتم تصوير المجاميع باستخدام CLSM على مدار 18 ساعة (C) بعد التصوير الأولي 18 ساعة ، يتم التعامل مع المجاميع مع يوديد البروبيديوم لتصور الخلايا الميتة وتصويرها باستخدام CLSM (D) يتم فصل المجاميع مع النمط الظاهري المطلوب من SCFM2 باستخدام FACS. الاختصارات: SCFM2 = الاصطناعية التليف الكيسي البلغم المتوسط; السلطة الفلسطينية = Pseudomonas aeruginosa; CLSM = المسح المجهري بالليزر confocal؛ FACS = فرز الخلايا المنشطة بالفلورسينس. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
هنا ، يتم إثبات فائدة SCFM2 لدراسة تأثير العلاج بالمضادات الحيوية على مجاميع Pa في الوقت الفعلي ، يليها استخدام نهج فرز الخلايا لعزل مجموعات المجاميع ذات الأنماط الظاهرية المتميزة لتحليل المصب(الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد أدخل هذا العمل منهجيات يمكن دمجها لدراسة المجموعات البكتيرية الإجمالية في وجود وغياب العلاج بالمضادات الحيوية. تسمح CLSM عالية الدقة بتصور التغيرات في الكتلة الحيوية الكلية والتوجه الهيكلي للمجاميع في الوقت الفعلي عند التعرض للمضادات الحيوية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن قياس السمات الفي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم S.E.D من قبل صناديق بدء التشغيل التي تقدمها وزارة الطب الجزيئي، وجامعة جنوب فلوريدا، فضلا عن منحة بحثية CFF (DARCH19G0) وN.I.H (5R21AI147654 – 02 (PI، تشن)) ومعهد USF على الميكروبيوم. نشكر مختبر وايتلي على التعاون المستمر الذي يشمل مجموعات البيانات المتعلقة بهذه المخطوطة. نشكر الدكتور تشارلز Szekeres لتسهيل فرز FACS. تم إنشاء الأرقام من قبل A.D.G و S.E.D باستخدام Biorender.com.
Materials
| Amino acids | |||
| Alanine | Acr s Organics |
56-41-7 | |
| Arginine HCl | MP | 1119-34-2 | |
| Asparagine | Acrs Organics |
56-84-8 | Prepared in 0.5 M NaOH |
| Cystine HCl | Alfa Aesar | L06328 | |
| Glutamic acid HCl | Acrs Organics |
138-15-8 | |
| Glycine | Acrs Organics |
56-40-6 | |
| Histidine HCl H2O | Alfa Aesar | A17627 | |
| Isoleucine | Acrs Organics |
73-32-5 | |
| Leucine | Alfa Aesar | A12311 | |
| Lysine HCl | Alfa Aesar | J62099 | |
| Methionine | Acrs Organics |
63-68-3 | |
| Ornithine HCl | Alfa Aesar | A12111 | |
| Phenylalanine | Acrs Organics |
63-91-2 | |
| Proline | Alfa Aesar | A10199 | |
| Serine | Alfa Aesar | A11179 | |
| Threonine | Acrs Organics |
72-19-5 | |
| Tryptophan | Acrs Organics |
73-22-3 | Prepared in 0.2 M NaOH |
| Tyrosine | Alfa Aesar | A11141 | Prepared in 1.0 M NaOH |
| Valine | Acrs Organics |
72-18-4 | |
| Antibiotic | |||
| Carbenicillin | Alfa Aesar | J6194903 | |
| Day-of Stocks | |||
| CaCl2 * 2H2O | Fisher Chemical | C79-500 | |
| Dextrose (D-glucose) | Fisher Chemical | 50-99-7 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Fisher (Avanti Polar Lipids) | 4235-95-4 | shake 15-20 min at 37 °C to evaporate chloroform |
| FeSO4 * 7H2O | Acrs Organics |
7782-63-0 | this stock equals 1 mg/mL, MUST make fresh |
| L-lactic acid | Alfa Aesar | L13242 | pH stock to 7 with NaOH |
| MgCl2 * 6H2O | Acrs Organics |
7791-18-6 | |
| N-acetylglucosamine | TCI | A0092 | |
| Prepared solids | |||
| Porcine mucin | Sigma | M1778-100G | UV-sterilize |
| Salmon sperm DNA | Invitrogen | 15632-011 | |
| Stain | |||
| Propidium iodide | Alfa Aesar | J66764MC | |
| Salts | |||
| K2SO4 | Alfa Aesar | A13975 | |
| KCl | Alfa Aesar | J64189 | add solid directly to buffered base |
| KNO3 | Acrs Organics |
7757-79-1 | |
| MOPS | Alfa Aesar | A12914 | add solid directly to buffered base |
| NaCl | Fisher Chemical | S271-500 | add solid directly to buffered base |
| Na2HPO4 | RPI | S23100-500.0 | |
| NaH2PO4 | RPI | S23120-500.0 | |
| NH4Cl | Acrs Organics |
12125-02-9 | add solid directly to buffered base |
| Consumables | |||
| Conical tubes (15 mL) | Olympus plastics | 28-101 | |
| Conical tubes (50 mL) | Olympus plastics | 28-106 | |
| Culture tubes w/air flow cap | Olympus plastics | 21-129 | |
| 35 mm four chamber glass-bottom dish | CellVis | NC0600518 | |
| Luria Bertani (LB) broth | Genessee Scientific | 11-118 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Bioreagents | BP2944100 | |
| Pipet tips (p200) | Olympus plastics | 23-150RL | |
| Pipet tips (p1000) | Olympus plastics | 23-165RL | |
| Serological pipets (5 mL) | Olympus plastics | 12-102 | |
| Serological pipets (25 mL) | Olympus plastics | 12-106 | |
| Serological pipets (50 mL) | Olympus plastics | 12-107 | |
| Ultrapure water (RNAse/DNAse free); nanopure water | Genessee Scientific | 18-194 | Nanopure water used for preparation of solutions in Table 1 |
| Syringes (10 mL) | BD | 794412 | |
| Syringes (50 mL) | BD | 309653 | |
| 0.22 mm PES syringe filter | Olympus plastics | 25-244 | |
| PS cuvette semi-mico | Olympus plastics | 91-408 | |
| Software | |||
| Biorender | To prepare the figures | ||
| FacsDiva6.1.3 | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| Imaris | Bitplane | version 9.6 | |
| Zen Black | |||
| Equipment | |||
| FacsAriallu | Becton Dickinson, San Jose, CA | ||
| LSM 880 confocal laser scanning microscope | Zeiss |
References
- Ramsay, K. A., et al. The changing prevalence of pulmonary infection in with fibrosis: A longitudinal analysis. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (1), 70-77 (2017).
- Bessonova, L., et al. Data from the US and UK cystic fibrosis registries support disease modification by CFTR modulation with ivacaftor. Thorax. 73 (8), 731-740 (2018).
- Breuer, O., et al. Changing prevalence of lower airway infections in young children with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (5), 590-599 (2019).
- O’Donnell, J. N., Bidell, M. R., Lodise, T. P. Approach to the treatment of patients with serious multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa infections. Pharmacotherapy. 40 (9), 952-969 (2020).
- Bjarnsholt, T., et al. The in vivo biofilm. Trends in Microbiology. 21 (9), 466-474 (2013).
- Darch, S. E., et al. Spatial determinants of quorum signaling in a Pseudomonas aeruginosa infection model. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (18), 4779-4784 (2018).
- Zhu, K., Chen, S., Sysoeva, T. A., You, L. Universal antibiotic tolerance arising from antibiotic-triggered accumulation of pyocyanin in Pseudomonas aeruginosa. PLoS Biology. 17 (12), 3000573 (2019).
- Ciofu, O., Tolker-Nielsen, T. Tolerance and resistance of Pseudomonas aeruginosa biofilms to antimicrobial agents-how P. aeruginosa can escape antibiotics. Frontiers in Microbiology. 10, 913 (2019).
- Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (13), 4110-4115 (2015).
- Darch, S. E., et al. Phage inhibit pathogen dissemination by targeting bacterial migrants in a chronic infection model. MBio. 8 (2), 00240 (2017).
- Jorth, P., et al. Regional isolation drives bacterial diversification within cystic fibrosis lungs. Cell Host & Microbe. 18 (3), 307-319 (2015).
- Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8079-8087 (2007).
- Davies, D. G., et al. The involvement of cell-to-cell signals in the development of a bacterial biofilm. Science. 280 (5361), 295-298 (1998).
- Hartmann, R., et al. Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ. Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).
- Stacy, A., et al. Bacterial fight-and-flight responses enhance virulence in a polymicrobial infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7819-7824 (2014).
