الأساليب الكمية لدراسة البروتين أرجينين ميثيلترانسفيراز 1-9 النشاط في الخلايا
Summary
توفر هذه البروتوكولات المنهجية المستخدمة لتقييم النشاط الأنزيمي لأفراد عائلة البروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراز (PRMT) في الخلايا. يتم وصف إرشادات مفصلة حول تقييم نشاط PRMT باستخدام المؤشرات الحيوية الذاتية والخارجية ، والتعرف على الميثيل أرجينين الأجسام المضادة ، ومركبات أداة المانع.
Abstract
البروتين ميثيل ترانسفيراسيس (PRMTs) تحفيز نقل مجموعة الميثيل إلى بقايا أرجينين من البروتينات الركيزة. تتكون عائلة PRMT من تسعة أعضاء يمكنهم إعادة الترطيب الأحادي أو بقايا أرجينين ثنائي ميثيلات متناظرة /غير متماثلة. تتوفر عدة أجسام مضادة تعترف بأنواع مختلفة من ميثيل الأرجينين من البروتينات المختلفة؛ وبالتالي ، وتوفير أدوات لتطوير PRMT نشاط المؤشرات الحيوية المقايسات. إن المقايسات المستندة إلى الأجسام المضادة PRMT تشكل تحديا بسبب تداخل الركائز وخصائص الأجسام المضادة القائمة على الزخارف. وتناقش هذه القضايا والإعداد التجريبي للتحقيق في ميثيل الأرجينين التي ساهمت بها PRMTs الفردية. ومن خلال الاختيار الدقيق للركائز التمثيلية التي تمثل علامات بيولوجية لثمانية من أصل تسعة أفرقة استراتيجية الحد من الفقر، تم تصميم فريق من عمليات فحص نشاط فريق إدارة الموارد الطبيعية. هنا، يتم الإبلاغ عن بروتوكولات لإجراء فحوصات خلوية قياس كميا النشاط الأنزيمي لأفراد الأسرة PRMT الفردية في الخلايا. ميزة الأساليب الموصوفة هي أدائها المباشر في أي مختبر مع ثقافة الخلية وقدرات البقع الغربية الفلورية. تم التحقق من صحة خصوصية الركيزة وموثوقية الأجسام المضادة المختارة بالكامل مع نهج الضربة القاضية والإفراط في التعبير. وبالإضافة إلى المبادئ التوجيهية التفصيلية للمؤشرات الحيوية والأجسام المضادة للفرز، تقدم أيضا معلومات عن استخدام مجموعة مركبة أداة مثبطة لمضادات المركبات المضادة للمركبات.
Introduction
ميثيل أرجينين هو تعديل مهم بعد التحويل ينظم التفاعلات بين البروتين والبروتين والحمض النووي الريبي ، وبالتالي يلعب دورا مهما في العمليات الخلوية المختلفة مثل الربط قبل مرنا ، وتلف الحمض النووي ، واستجابة النسخ ، ونقل عامل النمو بوساطة1،2. أرجينين هو ميثيليد بواسطة البروتين أرجينين ميثيل ترانسفيراس (PRMTs) مما أدى إلى أرجينين أحادي ميثيل (Rme1), ثنائي ميثيل لارجينيني غير متناظرة (Rme2a), أو ثنائي ميثيل متماثل (Rme2s)3. واستنادا إلى نوع الميثيل، تصنف أفرقة الحد من الفقر إلى ثلاث مجموعات: النوع الأول (PRMT1، 2، 3، 4، 6، و8)، الذي يحفز ثنائي ميثيل أحادي وغير متماثل؛ النوع الأول (PRMT1، 2، 4، 6، 8)، الذي يحفز ثنائي ميثيل ثنائي الميثيل الأحادي وغير المتماثل؛ النوع 1، 2، 4، 6، 8، الذي يحفز ثنائي ميثيل أحادي وغير متماثل؛ النوع الأول من ثنائي الميثيل( 1، 2، 4، 6، 8)، والذي يحفز ثنائي الميثيل الأحادي وغير المتماثل؛ النوع الأول من ثنائي الميثيل( 1، 2، 4، 6، 8)، والذي يحفز ثنائي ثنائي الميثيل الأحادي وغير المتماثل؛ النوع النوع الثاني (PRMT5 و PRMT9) ، الذي يحفز ثنائي ميثيل أحادي ومتناظر ؛ والنوع الثالث (PRMT7)، والتي يمكن أن monomethylate أرجينينفقط 3.
نظرا لعدد متزايد من الأجسام المضادة الخاصة بمثيلة الأرجينين المتاحة تجاريا ، يمكن قياس نشاط PRMT باستخدام النشاف الغربي. الفلورسنت القائم على لطخة الغربية هي التقنية المفضلة على الكشف chemiluminescent بسبب مجموعة ديناميكية أكبر والخطية، وحساسية أعلى، والسماح لتعدد4. لتحديد مستويات ميثيل البروتين، يلزم تطبيع إشارة الميثيل إلى مستويات البروتين الإجمالية. عن طريق اختيار الأجسام المضادة للبروتين الكلي والميثيلية التي أثيرت في الأنواع المضيفة المختلفة (مثل الماوس والأرنب)، يمكن استخدام الأجسام المضادة الثانوية المسماة بفلوروفوريس مختلفة ويمكن تحديد إشارة لكلا الجسمين المضادين في نفس نطاق العينة. تم تطوير الأجسام المضادة الميثيل أرجينين لتحديد وتوصيف أحادي ميثيلات، غير متماثل، أو بروتينات ثنائية الثيلات بشكل متناظر حيث يوجد الميثيل أرجينين في سياق محدد. منذ الغالبية العظمى من PRMTs الميثيلات glycine- وأرجينين الغنية الزخارف داخلركائزها 5, أثيرت عدة أجسام مضادة للببتيدات التي تحتوي على مونوميل أو غير متماثل, متماثل ثنائي ميثيل أرجينين الجليسين يكرر مثل D5A12, ASYM24, أو ASYM25, وSYM11, على التوالي. تم إنشاء أجسام مضادة أخرى الميثيل أرجينين ضد مكتبة الببتيد التي تحتوي على غير المتماثلة، المتماثل ثنائي ميثيل وأرجينين أحادي ميثيل في سياق تكرار تسهيل الكشف عن الميثيل أرجينين في هذه السياقات خاصة6. وهناك أيضا عدد متزايد من الأجسام المضادة التي تعترف علامة أرجينين محددة على بروتين واحد والتي تمكن من الكشف الانتقائي عن الميثيل مثل الهستون H4R3me2a أو BAF155-R1064me2a.
هناك العديد من مثبطات PRMT المتاحة تجاريا ، والتي يمكن استخدامها كأدوات للمقاايسات الخلوية PRMT. ومع ذلك، لا تتميز جميعها بدقة بالانتقائية والآثار خارج الهدف، وينبغي استخدام بعضها بحذر. وقد طور اتحاد الجينوم الهيكلي، بالتعاون مع المختبرات الأكاديمية وشركاء الأدوية، مثبطات PRMT قوية وانتقائية وقابلة نفاذية للخلايا (مسابير كيميائية) يمكن استخدامها دون أي قيود من قبل المجتمع العلمي. ويمكن الاطلاع على معلومات عن هذه المثبطات على https://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics https://www.chemicalprobes.org/. المسابير الكيميائية هي مثبطات جزيء صغير مع في المختبر IC50 أو Kd < 100 nM، أكثر من 30 أضعاف الانتقائية على البروتينات في نفس الأسرة، والنشاط الخلوي كبيرة في 1 ميكرومتر. بالإضافة إلى ذلك، كل مسبار كيميائي لديه التناظرية الكيميائية القريبة التي هي غير نشطة ضد الهدف المقصود7،8،9،10،11،12.
الهدف من هذا البروتوكول هو قياس النشاط الخلوي لأفراد عائلة PRMT الفردية باستخدام طريقة الفلورسنت الغربية. هنا يتم توفير معلومات مفصلة عن المؤشرات الحيوية المقايسة التحقق من صحة، والأجسام المضادة، ومثبطات قوية نشطة الخلية، فضلا عن استراتيجيات قيمة لتنفيذ الفحص الناجح.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا ، يتم وصف بروتوكولات الفحص الخلوي التفصيلية لأفراد عائلة PRMT التي تستخدم أساليب النشاف الغربية الفلورية. تم اختيار الركائز الفريدة التي يمكن اكتشاف التغيرات في ميثيل الأرجينين بسهولة عند فقدان PRMT الفردي أو التثبيط الحفاز ولا يمكن تعويضها من قبل أفراد الأسرة الآخرين. يتم ميثيل بعض البروتينات من قبل PRMTs متعددة21،23، مما يشير إلى تداخل في خصوصية الركيزة حيث تساهم بعض PRMTs سوى كمية صغيرة من العلامة الخلوية في ركيزة بروتين معين24،25،26،27، على سبيل المثال ، يساهم كل من PRMT8 و PRMT1 في ميثيل EWS. لذلك، كل المقايسة تتطلب التحقق من صحة شاملة من الركائز والأجسام المضادة مع التجارب الضربة القاضية و / أو الإفراط في التعبير والمزيد من التحقق من صحة مع مثبطات انتقائية تتميز بشكل جيد. تم تحديد ركائز محددة PRMT التي يمكن الكشف عن تغييرات علامة الميثيل في غضون 2-3 أيام بعد فقدان PRMT / تثبيط لتجنب الآثار المركبة لانخفاض صلاحية الخلية والانتشار التي قد تؤثر بشكل غير مباشر على مستويات علامة الميثيل أرجينين. على الرغم من أنه كان من الممكن العثور على ركائز فريدة من نوعها لPRMT1 و 4 و 5 و 7 و 9 ؛ بالنسبة ل PRMT3 و 6 و 8 ، كان لا بد من استخدام نهج اكتساب الوظيفة. تم اختبار العديد من الأجسام المضادة الخاصة بمثيل الأرجينين لمختلف الأهداف الخلوية ، ولكن لم يتمكن أي منها من اكتشاف تغييرات كبيرة في غضون 3 أيام من الضربة القاضية PRMT3 و PRMT6 ؛ لذلك ، تم تطوير مقايسات العلامات الحيوية باستخدام الإنزيمات المعبر عنها خارج الرحم جنبا إلى جنب مع المسوخ غير النشطة الحفازة ، والتي كانت بمثابة عنصر تحكم لمثيلة الركيزة الأساسية. PRMT8 هو تجانس PRMT1 قريب ويشارك تفضيلات ركيزة مماثلة. كما لم يتم تحديد علامة بيولوجية انتقائية PRMT8، تم تطوير مقايسة في خلايا الضربة القاضية PRMT1، حيث تم التعبير عن PRMT8 بالاشتراك مع EWS. PRMT1 هو أيضا إنزيم رئيسي مسؤول عن الميثيل غير المتماثل H4R3 ، لذلك ، لاستخدام H4R3me2a كمرسم حيوي ل PRMT3 وPRMT6 المقايسات الخلوية ، تم اختيار الخلايا ذات مستويات H4R3me2a القاعدية المنخفضة وكذلك المسوخ غير النشطة بشكل تحفيزي كتحكم في الخلفية. على الرغم من أن يتم تفضيل المقايسات الذاتية، المقايسات الخارجية تثبت لا تقدر بثمن لاختبار قوة الخلوية من عدة مثبطات PRMTانتقائية 7،8،9. مع المعرفة المتزايدة لبيولوجيا PRMT ، نتوقع تحسين المقايسات من خلال العثور على بروتينات أكثر تحديدا للعلامات الحيوية PRMT3 و PRMT6 و PRMT8.
استخدام الأجسام المضادة التحقق من صحة والضوابط المناسبة حاسمة لأداء PRMT المقايسة. جميع الأجسام المضادة الموصى بها هنا قد تم التحقق من صحتها بدقة عن طريق تجارب الضربة القاضية والإفراط في التعبير ، ومع ذلك ، فإن الاختلافات دفعة إلى دفعة ، خاصة في حالة الأجسام المضادة متعددة النسيلة ، قد لا تزال تؤثر على أدائها. لذلك، من المهم استخدام الطرق الجينية والتحقيقات الكيميائية جنبا إلى جنب مع الضوابط السلبية ذات الصلة الوثيقة لتأكيد موثوقية المقايسة. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة لمقاايسات PRMT التي تتطلب التعبير المفرط عن البروتين ، من الأهمية بمكان استخدام المسوخ غير النشطة بشكل تحفيزي جنبا إلى جنب مع البروتين البري لتحديد مستويات الميثيل القاعدية.
ويمكن أن تكون هذه المجموعة من المقايسات الكمية لتوصيف نشاط تكنولوجيات PRMTs في الخلايا مفيدة على نطاق واسع للمجتمع العلمي حيث يمكن تنفيذها بسرعة وسهولة بأقل قدر من المعدات والخبرة التقنية المحدودة، والتي تنطوي فقط على زراعة الخلايا الأساسية وتقنيات النشاف الغربية الفلورية. ويمكن أيضا استخدام الأجسام المضادة الموصى بها والتحقيقات الكيميائية ل PRMTs لإجراء عمليات تقييم تنميط البروتين القائمة على النشاط (ABPP) لتحديد مدى ملاءمة مسبار ABPP معين ، ورصد المشاركة المستهدفة ، وتقييم الآثار خارج الهدف باستخدام تنسيق ABPP التنافسي. يمكن أيضا استقراء نهج تطوير المقايسة التي تمت مناقشتها هنا لعائلات الإنزيم الأخرى مثل lysine-methyltransferases البروتينية والأسيتيل ترانسفيراسي.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
اتحاد الجينوم الهيكلي هو مؤسسة خيرية مسجلة (رقم: 1097737) تتلقى الأموال من AbbVie ، باير AG، بوهرنجر إنغلهايم، Genentech، الجينوم كندا من خلال معهد أونتاريو الجينوم [OGI-196]، والاتحاد الأوروبي وEFPIA من خلال مبادرة الأدوية المبتكرة 2 التعهد المشترك [EUbOPEN منحة 875510]، يانسن، ميرك KGaA (الملقب EMD في كندا والولايات المتحدة)، فايزر، تاكيدا وصندوق ويلكوم [106169/ZZ14/Z].
Materials
| 10 cm TC dishes | Greiner bio-one | 664160 | |
| 24-well TC plates | Greiner bio-one | 662160 | |
| 4–12% Bis-Tris Protein Gels | ThermoFisher Scientiffic | NP0323BOX, NP0322BOX,NP0321BOX | |
| Amersham Hybond P PVDF membrane | Millipore-Sigma | 10600021 | |
| anti-Asym 24 | Millipore-Sigma | 07-414 | |
| anti-Asym 25 | Millipore-Sigma | 09-814 | |
| anti-B-actin | Santa Cruz Biotechnologies | sc-47778 | |
| anti-BAF155 | Santa Cruz Biotechnologies | sc-32763 | |
| anti-BAF155-R1064me2a | Millipore-Sigma | ABE1339 | |
| anti-FLAG (#, 1:5000) | Millipore-Sigma | F4799 | |
| anti-GFP | Clontech | 632381 | |
| anti-H3 | Abcam | ab10799 | |
| anti-H3R2me2a | Millipore-Sigma | 04-848 | |
| anti-H3R8me2a | Rockland | 600-401-I67 | |
| anti-H4 | Abcam | ab174628 | |
| anti-H4R3me2a | Active Motif | 39705 | |
| anti-Hsp/Hsc70 | Enzo | ADI-SPA-820 | |
| anti-PRMT1 | Millipore-Sigma | 07-404 | |
| anti-PRMT3 | Abcam | ab191562 | |
| anti-PRMT4 | Bethyl | #A300-421A | |
| anti-PRMT5 | Abcam | ab109451 | |
| anti-PRMT6 | Abcam | ab47244 | |
| anti-PRMT7 | Abcam | ab179822 | |
| anti-Rme1 | CST | 8015 | |
| anti-Rme2a | CST | 13522 | |
| anti-Rme2s | CST | 13222 | |
| anti-Rme2s (ASYM25), Millipore, , 1:2000) | 09-814 | ||
| anti-SAP145 (Abcam, #, 1:1000) | Abcam | ab56800 | |
| anti-SAP145-R508me2s | kind gift from Dr. Yanzhong Yang, Beckman Research Institute of City of Hope | ||
| anti-SmBB’ | Santa Cruz Biotechnologies | sc-130670 | |
| benzonase | PRODUCED IN-HOUSE | ||
| BSA | Millipore-Sigma | A7906 | |
| C2C12 | gift from Dr. Stephane Richard, McGill University | ||
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Millipore-Sigma | 11873580001 | |
| DMEM | Wisent | 319-005-CL | |
| DMSO | Bioshop | DMS666.100 | |
| donkey anti-mouse IgG-IR680 | Licor | 926-68072 | |
| doxycycline | Millipore-Sigma | D9891 | |
| EDTA | Bioshop | EDT111.500 | |
| FBS | Wisent | 80150 | |
| glycine | Bioshop | GLN002.5 | |
| goat-anti-rabbit IgG-IR800 | Licor | 926-32211 | |
| HEK293T | gift from Dr. Sam Benchimol, York University | ||
| Image Studio Software ver 5.2 | Licor | ||
| Loading buffer: NuPAGE LDS Sample Buffer (4x) | ThermoFisher Scientiffic | NP0007 | |
| MCF7 | ATCC® HTB-22™ | ||
| NaCl | Bioshop | SOD001.1 | |
| NuPAGE MOPS SDS Running Buffer | ThermoFisher Scientiffic | NP0001 | |
| Odyssey Blocking Buffer (dilute 4 x with PBST) | Licor | 927-40000 | Intercept (PBS) Blocking Buffer can also be used # 927-70001 |
| Odyssey CLX Imaging System | Licor | model number 9140 | |
| PBS (tissue culture) | Wisent | 311-010-CL | |
| PBS (western blot) | Bioshop | PBS405.4 | |
| penstrep | Wisent | 450-201-EL | |
| Pierce™ BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientiffic | 23225 | |
| SDS | Bioshop | SDS001.1 | |
| skim milk powder | Bioshop | SKI400.500 | |
| TC20 automated cell counter | Biorad | 1450102 | |
| Tripsin-EDTA (0.25%) | Wisent | 325-043-EL | |
| Tris | Bioshop | TRS003.5 | |
| Tritton X-100 | Bioshop | TRX506 | |
| trypan blue | GIBCO | 15250-061 | |
| Tween-20 | Bioshop | TWN510.500 |
References
- Blanc, R. S., Richard, S. Arginine Methylation: The Coming of Age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
- Yang, Y., Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).
- Bedford, M. T., Richard, S. Arginine methylation an emerging regulator of protein function. Molecular Cell. 18 (3), 263-272 (2005).
- Eaton, S. L., et al. A guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies. The Journal of Visualized Experiments. (93), e52099 (2014).
- Thandapani, P., O’Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. Defining the RGG/RG motif. Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).
- Dhar, S., et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Science Reports. 3, 1311 (2013).
- Kaniskan, H. U., et al. A potent, selective and cell-active allosteric inhibitor of protein arginine methyltransferase 3 (PRMT3). Angewandte Chemie International Edition. 54 (17), 5166-5170 (2015).
- Eram, M. S., et al. A Potent, Selective, and Cell-Active Inhibitor of Human Type I Protein Arginine Methyltransferases. ACS Chemical Biology. 11 (3), 772-781 (2016).
- Shen, Y., et al. Discovery of a Potent, Selective, and Cell-Active Dual Inhibitor of Protein Arginine Methyltransferase 4 and Protein Arginine Methyltransferase 6. Journal of Medicinal Chemistry. 59 (19), 9124-9139 (2016).
- Nakayama, K., et al. TP-064, a potent and selective small molecule inhibitor of PRMT4 for multiple myeloma. Oncotarget. 9 (26), 18480-18493 (2018).
- Bonday, Z. Q., et al. LLY-283, a Potent and Selective Inhibitor of Arginine Methyltransferase 5, PRMT5, with Antitumor Activity. ACS Medicinal Chemistry Letters. 9 (7), 612-617 (2018).
- Szewczyk, M. M., et al. Pharmacological inhibition of PRMT7 links arginine monomethylation to the cellular stress response. Nature Communications. 11 (1), 2396 (2020).
- Goulet, I., Gauvin, G., Boisvenue, S., Cote, J. Alternative splicing yields protein arginine methyltransferase 1 isoforms with distinct activity, substrate specificity, and subcellular localization. Journal of Biological Chemistry. 282 (45), 33009-33021 (2007).
- Siarheyeva, A., et al. An allosteric inhibitor of protein arginine methyltransferase 3. Structure. 20 (8), 1425-1435 (2012).
- Stefansson, O. A., Esteller, M. CARM1 and BAF155: an example of how chromatin remodeling factors can be relocalized and contribute to cancer. Breast Cancer Research. 16 (3), 307 (2014).
- Pesiridis, G. S., Diamond, E., Van Duyne, G. D. Role of pICLn in methylation of Sm proteins by PRMT5. Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21347-21359 (2009).
- Guccione, E., et al. Methylation of histone H3R2 by PRMT6 and H3K4 by an mLL complex are mutually exclusive. Nature. 449 (7164), 933-937 (2007).
- Yudao Shen, ., L, F., et al. A First-in-class, Highly Selective and Cell-active Allosteric Inhibitor of Protein Arginine Methyltransferase 6 (PRMT6). BioRxiv. , 1-21 (2020).
- Pahlich, S., Zakaryan, R. P., Gehring, H. Identification of proteins interacting with protein arginine methyltransferase 8: the Ewing sarcoma (EWS) protein binds independent of its methylation state. Proteins. 72 (4), 1125-1137 (2008).
- Lee, J., Sayegh, J., Daniel, J., Clarke, S., Bedford, M. T. PRMT8, a new membrane-bound tissue-specific member of the protein arginine methyltransferase family. Journal of Biological Chemistry. 280 (38), 32890-32896 (2005).
- Kim, J. D., Kako, K., Kakiuchi, M., Park, G. G., Fukamizu, A. EWS is a substrate of type I protein arginine methyltransferase, PRMT8. International Journal of Molecular Medicine. 22 (3), 309-315 (2008).
- Yang, Y., et al. PRMT9 is a type II methyltransferase that methylates the splicing factor SAP145. Nature Communications. 6, 6428 (2015).
- Rakow, S., Pullamsetti, S. S., Bauer, U. M., Bouchard, C. Assaying epigenome functions of PRMTs and their substrates. Methods. 1175, 53-65 (2020).
- Musiani, D., et al. Proteomics profiling of arginine methylation defines PRMT5 substrate specificity. Science Signaling. 12 (575), (2019).
- Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and Computational Approaches for the Large-Scale Analysis of Protein Arginine Methylation by Mass Spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
- Shishkova, E., et al. Global mapping of CARM1 substrates defines enzyme specificity and substrate recognition. Nature Communications. 8, 15571 (2017).
- Pawlak, M. R., Banik-Maiti, S., Pietenpol, J. A., Ruley, H. E. Protein arginine methyltransferase I: substrate specificity and role in hnRNP assembly. Journal of Cellular Biochemistry. 87 (4), 394-407 (2002).
