Протеомический подход на основе масс-спектрометрии для глобального анализа R-метилирования белка с высокой степенью достоверности
Summary
Белковое аргининовое (R)-метилирование является широко распространенной посттрансляционной модификацией, регулирующей несколько биологических путей. Масс-спектрометрия является лучшей технологией для глобального профилирования R-метил-протеома в сочетании с биохимическими подходами к обогащению модифицированными пептидами. Рабочий процесс, предназначенный для высокой достоверности идентификации глобального R-метилирования в клетках человека, описан здесь.
Abstract
Белковое аргининовое (R)-метилирование является широко распространенной посттрансляционной модификацией белка (PTM), участвующей в регуляции нескольких клеточных путей, включая обработку РНК, трансдукцию сигналов, реакцию на повреждение ДНК, биогенез микроРНК и трансляцию.
В последние годы, благодаря биохимическим и аналитическим разработкам, протеомика на основе масс-спектрометрии (МС) стала наиболее эффективной стратегией для характеристики клеточного метилпротеома с односайтовым разрешением. Однако идентификация и профилирование R-метилирования белка in vivo при РС остается сложным и подверженным ошибкам, главным образом из-за субстохиометрического характера этой модификации и наличия различных замен аминокислот и химической метилэтерификации кислотных остатков, которые являются изобарическими к метилированию. Таким образом, необходимы методы обогащения для улучшения идентификации R-метилпептидов и ортогональные стратегии валидации для снижения коэффициентов ложного обнаружения (FDR) в исследованиях метилпротеомики.
Здесь описан протокол, специально разработанный для идентификации и количественного определения R-метилпептидов с высокой степенью достоверности из клеточных образцов, который связывает метаболическую маркировку клеток с тяжелым изотоп-кодированным метионином (hmSILAC) и двойным перевариванием протеазы в растворе цельноклеточного экстракта, за которым следует оффлайн-фракционирование хроматографии с высоким рН (HpH-RP) и аффинное обогащение R-метил-пептидов с использованием анти-пан-R-метиловых антител. При анализе MS с высоким разрешением необработанные данные сначала обрабатываются с помощью программного пакета MaxQuant, а затем результаты анализируются hmSEEKER, программным обеспечением, предназначенным для углубленного поиска пиковых пар MS, соответствующих легким и тяжелым метил-пептидам в выходных файлах MaxQuant.
Introduction
Аргинин (R)-метилирование представляет собой посттрансляционную модификацию (PTM), которая украшает около 1% протеома млекопитающих1. Белковые аргининметилтрансферазы (PRMT) представляют собой ферменты, катализирующие реакцию R-метилирования путем осаждения одной или двух метильных групп к атомам азота (N) группы гуанидино боковой цепи R симметричным или асимметричным образом. У млекопитающих PRMT могут быть сгруппированы в три класса – тип I, тип II и тип III – в зависимости от их способности депонировать как монометилирование (ММА), так и асимметричное диметилирование (ADMA), ММА и симметричное диметилирование (SDMA) или только ММА, соответственно 2,3. PRMT в основном нацелены на остатки R, расположенные в богатых глицином и аргинином регионах, известных как мотивы GAR, но некоторые PRMT, такие как PRMT5 и CARM1, могут метилировать пролин-глицин-метионин-богатые (PGM) мотивы4. R-метилирование появилось как модулятор белка нескольких биологических процессов, таких как сплайсинг РНК5, репарация ДНК6, биогенез миРНК7 и трансляция2, способствуя исследованиям этого ПТМ.
Масс-спектрометрия (МС) признана наиболее эффективной технологией для систематического изучения глобального R-метилирования при разрешении белка, пептида и сайта. Тем не менее, этот PTM требует некоторых особых мер предосторожности для его высокой достоверности идентификации по РС. Во-первых, R-метилирование является субстохиометрическим, причем немодифицированная форма пептидов гораздо более распространена, чем модифицированные, так что масс-спектрометры, работающие в режиме Data Dependent Acquisition (DDA), будут фрагментировать высокоинтенсивные немодифицированные пептиды чаще, чем их метилированные аналоги с более низкой интенсивностью8. Кроме того, большинство рабочих процессов на основе МС для идентификации R-метилированных участков страдают от ограничений на уровне биоинформационного анализа. Действительно, вычислительная идентификация метилпептидов подвержена высоким показателям ложного открытия (FDR), потому что этот PTM является изобарическим для различных аминокислотных замен (например, глицин в аланин) и химической модификации, такой как метилэтерификация аспартата и глутамата9. Следовательно, методы, основанные на изотопной маркировке метильных групп, такие как Heavy Methyl Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell culture (hmSILAC), были реализованы в качестве ортогональных стратегий для уверенной MS-идентификации метилирования in vivo , значительно снижая частоту ложноположительных аннотаций10.
В последнее время были оптимизированы различные протоколы для изучения R-метилированных белков. Разработка основанных на антителах стратегий иммуноаффинного обогащения R-метилпептидов привела к аннотированию нескольких сотен R-метилированных участков в клетках человека11,12. Кроме того, во многих исследованиях 3,13 сообщалось, что соединение обогащения на основе антител с методами разделения пептидов, такими как фракционирование хроматографии HpH-RP, может увеличить общее количество идентифицированных метилпептидов.
В данной статье описывается экспериментальная стратегия, предназначенная для систематической и высокодостоверной идентификации R-метилированных участков в клетках человека, основанная на различных биохимических и аналитических этапах: экстракция белка из клеток, меченых hmSILAC, параллельное двойное ферментативное пищеварение протеазами трипсина и лисаргиназы с последующим хроматографическим фракционированием HpH-RP переваренных пептидов в сочетании с иммуноаффинным обогащением на основе антител MMA-, SDMA-, и ADMA-содержащие пептиды. Все обогащенные аффинностью пептиды затем анализируются методом жидкостной хроматографии высокого разрешения (LC)-MS/MS в режиме DDA, а необработанные данные MS обрабатываются алгоритмом MaxQuant для идентификации R-метилпептидов. Наконец, выходные результаты MaxQuant обрабатываются с помощью hmSEEKER, собственного инструмента биоинформатики для поиска пар тяжелых и легких метилпептидов. Вкратце, hmSEEKER считывает и фильтрует идентификацию метилпептидов из файла msms, затем сопоставляет каждый метилпептид с соответствующим пиком MS1 в файле allPeptides и, наконец, ищет пик тяжелого/ легкого пептидного аналога. Для каждой предполагаемой пары тяжелых легких вычисляются коэффициент Log2 H/L (LogRatio), разность времени удержания (dRT) и параметры mass error (ME), а дублеты, расположенные в пределах заданных пользователем отсечек, помечаются как истинные положительные значения. Рабочий процесс биохимического протокола описан на рисунке 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Высоконадежная идентификация метилирования белка/пептида in vivo глобальной протеомикой на основе РС является сложной задачей из-за риска высокого FDR, с несколькими аминокислотными замещениями и метилэтерификацией, происходящими во время подготовки образца, которые являются изоба…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MM и EM являются аспирантами Европейской школы молекулярной медицины (SEMM). EM является получателем 3-летней стипендии FIRC-AIRC (Код проекта: 22506). Глобальные анализы R-метил-протеомов в группе туберкулеза поддерживаются грантом AIRC IG (Код проекта: 21834).
Materials
| Ammonium Bicarbonate (AMBIC) | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 497363 | |
| C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) | Waters | WAT036905 | |
| Colloidal Coomassie staining Instant | Sigma-Aldrich | ISB1L-1L | |
| cOmplete Mini, EDTA-free | Roche-Sigma Aldrich | 11836170001 | Protease Inhibitor |
| Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
| DMEM Medium | GIBCO ThermoFisher | requested | with stabile glutamine and without methionine |
| EASY-nano LC 1200 chromatography system | ThermoFisher | ||
| EASY-Spray HPLC Columns | ThermoFisher | ES907 | |
| Glycerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | 144-48-9 | |
| Jupiter C12-RP column | Phenomenex | 00G-4396-E0 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M5308 | Light (L) Methionine |
| L-Methionine-(methyl-13C,d3) | Sigma-Aldrich | 299154 | Heavy (H) Methionine |
| LysargiNase | Merck Millipore | EMS0008 | |
| Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 | Branson | ||
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
| PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich | 4906837001 | Phosphatase Inhibitor |
| Pierce C18 Tips | ThermoFisher | 87782 | |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85175 | LC-MS Solvent B |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85170 | LC-MS Solvent A |
| Pierce Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade | ThermoFisher | 51101 | |
| Pierce Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 51140 | |
| Polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 92560 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610373 | |
| PTMScan antibodies α-ADMA | Cell Signaling Technology | 13474 | |
| PTMScan antibodies α-MMA | Cell Signaling Technology | 12235 | |
| PTMScan antibodies α-SDMA | Cell Signaling Technology | 13563 | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | ||
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf | Speed vac |
References
- Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
- Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: the coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
- Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
- Yang, Y., Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).
- Bezzi, M., et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes & Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).
- Auclair, Y., Richard, S. The role of arginine methylation in the DNA damage response. DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).
- Spadotto, V., et al. PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).
- Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
- Ong, S. -. E., Mittler, G., Mann, M. Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC. Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).
- Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
- Larsen, S. C., et al. Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells. Science Signaling. 9 (443), (2016).
- Massignani, E., et al. hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data. Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry. Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
- Huesgen, P. F., et al. LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification. Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).
- Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
- Bremang, M., et al. Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome. Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).
- Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling. Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).
- Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides. Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).
- Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).
- Swaney, D. L., et al. Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors. Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).
- Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
- Uhlmann, T., et al. A method for large-scale identification of protein arginine methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).
- Wang, K., et al. Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation. Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).
- Moore, K. E., et al. A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation. Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).
- Wu, Z., et al. A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).
- Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
- Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).
