Uma Abordagem Proteômica Baseada em Espectrometria de Massa para Análise de R-Metilação de Proteínas Global e de Alta Confiança

A arginina (R)-metilação é uma modificação pós-translacional (PTM) que decora cerca de 1% do proteoma^{de mamíferos 1}. A proteína arginina metiltransferases (PRMTs) são as enzimas que catalisam a reação de R-metilação pela deposição de um ou dois grupos metil aos átomos de nitrogênio (N) do grupo guanidino da cadeia lateral de R de maneira simétrica ou assimétrica. Em mamíferos, os PRMTs podem ser agrupados em três classes – tipo I, tipo II e tipo III – dependendo de sua capacidade de depositar monometilação (MMA) e dimetilação assimétrica (ADMA), MMA e dimetilação simétrica (SDMA) ou apenas MMA, respectivamente ^2,3. Os PRMTs visam principalmente resíduos de R localizados em regiões ricas em glicina e arginina, conhecidos como motivos GAR, mas alguns PRMTs, como PRMT5 e CARM1, podem metilar motivos ricos em prolina-glicina-metionina (PGM)⁴. A R-metilação emergiu como um modulador de proteínas de vários processos biológicos, como o splicing de RNA 5, o reparo de DNA⁶, a biogênese^de miRNA⁷ e a tradução², fomentando a pesquisa sobre esse PTM.

A espectrometria de massa (EM) é reconhecida como a tecnologia mais eficaz para estudar sistematicamente a R-metilação global na resolução de proteínas, peptídeos e locais. No entanto, este PTM requer algumas precauções particulares para a sua identificação de alta confiança pela EM. Primeiro, a R-metilação é subestequiométrica, com a forma não modificada dos peptídeos sendo muito mais abundante do que os modificados, de modo que os espectrômetros de massa que operam no modo de Aquisição Dependente de Dados (DDA) fragmentarão peptídeos não modificados de alta intensidade com mais frequência do que suas contrapartes metiladas de baixa intensidade⁸. Além disso, a maioria dos fluxos de trabalho baseados em EM para identificação de locais R-metilados sofre de limitações no nível de análise bioinformática. De fato, a identificação computacional de metilpeptídeos é propensa a altas Taxas de Falsa Descoberta (FDR), porque esse PTM é isobárico a várias substituições de aminoácidos (por exemplo, glicina em alanina) e modificações químicas, como metilesterificação de aspartato e glutamato⁹. Assim, métodos baseados na marcação isotópica de grupos metil, como o Heavy Methyl Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell culture (hmSILAC), têm sido implementados como estratégias ortogonais para a identificação confiante de MS de metilações in vivo , reduzindo significativamente a taxa de anotações falso-positivas¹⁰.

Recentemente, vários protocolos de proteoma para estudar proteínas R-metiladas foram otimizados. O desenvolvimento de estratégias baseadas em anticorpos para o enriquecimento por imunoafinidade de peptídeos-R-metil levou à anotação de várias centenas de sítios R-metilados em células humanas^11,12. Além disso, muitos estudos ^3,13 relataram que o acoplamento do enriquecimento baseado em anticorpos com técnicas de separação peptídica, como o fracionamento por cromatografia HpH-RP, pode aumentar o número total de metilpeptídeos identificados.

Este artigo descreve uma estratégia experimental desenhada para a identificação sistemática e de alta confiança de sítios R-metilados em células humanas, com base em várias etapas bioquímicas e analíticas: extração de proteínas de células marcadas com hmSILAC, digestão enzimática dupla paralela com proteases de tripsina e lisarginase, seguida de fracionamento cromatográfico de peptídeos digeridos por HpH-RP, juntamente com enriquecimento de imuno-afinidade baseado em anticorpos de MMA-, SDMA-, e peptídeos contendo ADMA. Todos os peptídeos enriquecidos com afinidade são então analisados por cromatografia líquida de alta resolução (LC)-MS/MS no modo DDA, e os dados brutos de MS são processados pelo algoritmo MaxQuant para identificação de peptídeos R-metil. Finalmente, os resultados de saída do MaxQuant são processados com o hmSEEKER, uma ferramenta de bioinformática desenvolvida internamente para pesquisar pares de metilpeptídeos pesados e leves. Resumidamente, o hmSEEKER lê e filtra as identificações de metilpeptídeos do arquivo msms, depois combina cada peptídeo de metila com seu pico MS1 correspondente no arquivo allPeptides e, finalmente, procura o pico da contraparte de peptídeo pesado / leve. Para cada suposto par de pesos pesados, os parâmetros Log2 H/L ratio (LogRatio), Retention Time difference (dRT) e Mass Error (ME) são calculados e os doublets localizados dentro de pontos de corte definidos pelo usuário são rotulados como verdadeiros positivos. O fluxo de trabalho do protocolo bioquímico está descrito na Figura 1.