גישה פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות לניתוח R-מתילציה של חלבונים גלובליים ובביטחון גבוה
Summary
ארגינין חלבון (R)-מתילציה הוא שינוי פוסט-תרגומי נרחב המווסת מסלולים ביולוגיים מרובים. ספקטרומטריית מסות היא הטכנולוגיה הטובה ביותר ליצירת פרופיל עולמי של R-מתיל-פרוטאום, כאשר היא משולבת לגישות ביוכימיות להעשרת פפטידים מותאמים. תהליך העבודה המיועד לזיהוי בביטחון גבוה של מתילציה גלובלית של R בתאים אנושיים מתואר כאן.
Abstract
ארגינין חלבון (R)-מתילציה הוא שינוי חלבוני נפוץ לאחר תרגום (PTM) המעורב בוויסות של מספר מסלולים תאיים, כולל עיבוד RNA, התמרת אותות, תגובת נזק לדנ”א, ביוגנזה של miRNA ותרגום.
בשנים האחרונות, הודות להתפתחויות ביוכימיות ואנליטיות, פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות (MS) התגלתה כאסטרטגיה היעילה ביותר לאפיון מתיל פרוטאום תאי ברזולוציה של אתר יחיד. עם זאת, זיהוי ויצירת פרופיל של חלבון in vivo R-methylation על ידי טרשת נפוצה נותר מאתגר ומועד לטעויות, בעיקר בשל האופי הסובסטואיכיומטרי של שינוי זה ונוכחותם של תחליפי חומצות אמינו שונים ומתיל-אסטריפיקציה כימית של שאריות חומציות שהן איזובריות למתילציה. לפיכך, נדרשות שיטות העשרה לשיפור הזיהוי של R-מתיל-פפטידים ואסטרטגיות אימות אורתוגונליות להפחתת שיעורי גילוי כוזב (FDR) במחקרי מתיל-פרוטאומיקה.
כאן מתואר פרוטוקול שתוכנן במיוחד לזיהוי וכמות של R-מתיל-פפטידים בביטחון גבוה מדגימות תאים, אשר משלב תיוג מטבולי של תאים עם מתיונין בקידוד איזוטופים כבד (hmSILAC) ועיכול כפול של פרוטאז בתמיסה של תמצית תאים שלמים, ולאחר מכן פיצול כרומטוגרפיה לא מקוונת של שלב הפוך ב-pH גבוה (HpH-RP) והעשרת זיקה של R-מתיל-פפטידים באמצעות נוגדנים נגד פאן-R-מתיל. לאחר ניתוח טרשת נפוצה ברזולוציה גבוהה, נתונים גולמיים מעובדים תחילה עם חבילת התוכנה MaxQuant והתוצאות מנותחות לאחר מכן על ידי hmSEEKER, תוכנה המיועדת לחיפוש מעמיק של זוגות שיא MS המתאימים למתיל-פפטיד קל וכבד בתוך קבצי הפלט MaxQuant.
Introduction
ארגינין (R)-מתילציה הוא שינוי פוסט-תרגומי (PTM) המעטר כ-1% מהפרוטאום של היונקים1. חלבון ארגינין מתיל-טרנספראזות (PRMTs) הם האנזימים המזרזים את תגובת המתילציה של R על ידי תצהיר של קבוצת מתיל אחת או שתיים לאטומי החנקן (N) של חבורת הגואנידינו בשרשרת הצדדית של R באופן סימטרי או אסימטרי. ביונקים, ניתן לקבץ PRMTs לשלוש מחלקות – סוג I, סוג II וסוג III – בהתאם ליכולתם להפקיד הן מונו-מתילציה (MMA) והן די-מתילציה אסימטרית (ADMA), MMA ודי-מתילציה סימטרית (SDMA) או רק MMA,בהתאמה 2,3. PRMT מתמקדים בעיקר בשאריות R הממוקמות באזורים עשירים בגליצין וארגינין, הידועים כמוטיבים של GAR, אך PRMTs מסוימים, כגון PRMT5 ו-CARM1, יכולים לבצע מתיל-מאט של מוטיבים עשירים בפרולין-גליצין-מתיונין (PGM)4. R-מתילציה התגלתה כמודולטור חלבונים של מספר תהליכים ביולוגיים, כגון שחבור RNA5, תיקון DNA6, ביוגנזה של miRNA7 ותרגום2, מה שמעודד את המחקר על PTM זה.
ספקטרומטריית מסה (MS) מוכרת כטכנולוגיה היעילה ביותר לחקור באופן שיטתי R-מתילציה גלובלית ברזולוציית חלבון, פפטיד ואתר. עם זאת, PTM זה דורש כמה אמצעי זהירות מיוחדים עבור זיהוי הביטחון הגבוה שלה על ידי טרשת נפוצה. ראשית, מתילציה של R היא תת-קרקעית, כאשר הצורה הלא-משתנה של הפפטידים שופעת הרבה יותר מזו ששונתה, כך שספקטרומטרים של מסה הפועלים במצב רכישה תלוית נתונים (DDA) יחלקו פפטידים בעוצמה גבוהה ללא שינוי לעתים קרובות יותר מאשר עמיתיהם בעלי המתילציה בעוצמה נמוכה יותר8. יתר על כן, רוב תהליכי העבודה מבוססי MS לזיהוי אתרים עם מתילציה R סובלים ממגבלות ברמת הניתוח הביואינפורמטי. ואכן, הזיהוי החישובי של מתיל-פפטידים נוטה לשיעורי גילוי שווא גבוהים (FDR), מכיוון ש-PTM זה הוא איזוברי לתחליפי חומצות אמינו שונים (למשל, גליצין לאלנין) ולשינויים כימיים, כגון מתיל-אסטריפיקציה של אספרטט וגלוטמט9. לפיכך, שיטות המבוססות על תיוג איזוטופים של קבוצות מתיל, כגון תיוג איזוטופים כבדים של מתיל יציב עם חומצות אמינו בתרבית תאים (hmSILAC), יושמו כאסטרטגיות אורתוגונליות לזיהוי בטוח של MS של מתילציות in vivo , והפחיתו באופן משמעותי את שיעור הביאורים החיוביים השגויים10.
לאחרונה, פרוטוקולים שונים של פרוטאום לחקר חלבונים שעברו מתילציה של R עברו אופטימיזציה. פיתוח אסטרטגיות מבוססות נוגדנים להעשרת זיקה חיסונית של R-מתיל-פפטידים הוביל לביאור של כמה מאות אתרי R-מתילציה בתאים אנושיים11,12. יתר על כן, מחקרים רבים 3,13 דיווחו כי צימוד העשרה מבוססת נוגדנים עם טכניקות הפרדת פפטידים כגון פיצול כרומטוגרפיה של HpH-RP יכול להגביר את המספר הכולל של מתיל פפטידים שזוהו.
מאמר זה מתאר אסטרטגיה ניסיונית המיועדת לזיהוי שיטתי ובטוח של אתרי R-מתילציה בתאים אנושיים, המבוססת על שלבים ביוכימיים ואנליטיים שונים: מיצוי חלבונים מתאים המסומנים ב- hmSILAC, עיכול אנזימטי כפול מקביל עם פרוטאזות טריפסין ו- LysargiNase, ולאחר מכן פיצול כרומטוגרפי של HpH-RP של פפטידים מעוכלים, יחד עם העשרת זיקה חיסונית מבוססת נוגדנים של MMA-, SDMA-, ופפטידים המכילים ADMA. לאחר מכן, כל הפפטידים המועשרים באהדה מנותחים על-ידי כרומטוגרפיה נוזלית ברזולוציה גבוהה (LC)-MS/MS במצב DDA, ונתוני MS גולמיים מעובדים על-ידי אלגוריתם MaxQuant לזיהוי פפטידים מסוג R-מתיל-פפטידים. לבסוף, תוצאות הפלט של MaxQuant מעובדות באמצעות hmSEEKER, כלי ביואינפורמטיקה שפותח על ידי החברה לחיפוש זוגות של מתיל-פפטידים כבדים וקלים. בקצרה, hmSEEKER קורא ומסנן זיהויי מתיל-פפטידים מקובץ ה-MSMS, לאחר מכן מתאים כל מתיל-פפטיד לשיא MS1 המתאים לו בקובץ allPeptides, ולבסוף, מחפש את השיא של מקבילו הפפטיד הכבד/קל. עבור כל זוג פוטטיבי כבד-קל, מחושבים הפרמטרים Log2 H/L (LogRatio), הפרש זמן השמירה (dRT) ו- Mass Error (ME), וכפילים הממוקמים בתוך חתכים המוגדרים על-ידי המשתמש מסומנים כחיוביים אמיתיים. זרימת העבודה של הפרוטוקול הביוכימי מתוארת באיור 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
הזיהוי בביטחון גבוה של מתילציה של חלבון in vivo /פפטיד על ידי פרוטאומיקה גלובלית מבוססת MS הוא מאתגר, בשל הסיכון ל-FDR גבוה, כאשר מספר תחליפי חומצות אמינו ומתיל-אסטריפיקציה מתרחשים במהלך הכנת הדגימה שהם איזובריים למתילציה ועלולים לגרום להקצאות שגויות בהיעדר אסטרטגיות אימות MS אורתוגונליות…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MM ו- EM הם תלמידי דוקטורט בבית הספר האירופי לרפואה מולקולרית (SEMM). EM הוא הזוכה של 3 שנים FIRC-AIRC bursary (קוד הפרויקט: 22506). ניתוחים גלובליים של R-מתיל-פרוטאומים בקבוצת השחפת נתמכים על ידי מענק AIRC IG (קוד הפרויקט: 21834).
Materials
| Ammonium Bicarbonate (AMBIC) | Sigma-Aldrich | 09830 | |
| Ammonium Persulfate (APS) | Sigma-Aldrich | 497363 | |
| C18 Sep-Pak columns vacc 6cc (1g) | Waters | WAT036905 | |
| Colloidal Coomassie staining Instant | Sigma-Aldrich | ISB1L-1L | |
| cOmplete Mini, EDTA-free | Roche-Sigma Aldrich | 11836170001 | Protease Inhibitor |
| Dialyzed Fetal Bovine Serum (FBS) | GIBCO ThermoFisher | 26400-044 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 3483-12-3 | |
| DMEM Medium | GIBCO ThermoFisher | requested | with stabile glutamine and without methionine |
| EASY-nano LC 1200 chromatography system | ThermoFisher | ||
| EASY-Spray HPLC Columns | ThermoFisher | ES907 | |
| Glycerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| HeLa cells | ATCC | ATCC CCL-2 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | 144-48-9 | |
| Jupiter C12-RP column | Phenomenex | 00G-4396-E0 | |
| L-Methionine | Sigma-Aldrich | M5308 | Light (L) Methionine |
| L-Methionine-(methyl-13C,d3) | Sigma-Aldrich | 299154 | Heavy (H) Methionine |
| LysargiNase | Merck Millipore | EMS0008 | |
| Microtip Cell Disruptor Sonifier 250 | Branson | ||
| N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
| Penicillin-Streptomycin | GIBCO ThermoFisher | 15140122 | |
| PhosSTOP | Roche-Sigma Aldrich | 4906837001 | Phosphatase Inhibitor |
| Pierce C18 Tips | ThermoFisher | 87782 | |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85175 | LC-MS Solvent B |
| Pierce 0.1% Formic Acid (v/v) in Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 85170 | LC-MS Solvent A |
| Pierce Acetonitrile (ACN), LC-MS Grade | ThermoFisher | 51101 | |
| Pierce Water, LC-MS Grade | ThermoFisher | 51140 | |
| Polyacrylamide | Sigma-Aldrich | 92560 | |
| Precision Plus Protein All Blue Prestained Protein Standards | Bio-Rad | 1610373 | |
| PTMScan antibodies α-ADMA | Cell Signaling Technology | 13474 | |
| PTMScan antibodies α-MMA | Cell Signaling Technology | 12235 | |
| PTMScan antibodies α-SDMA | Cell Signaling Technology | 13563 | |
| Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | ||
| Sequencing Grade Modified Trypsin | Promega | V5113 | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Dionex | ||
| Urea | Sigma-Aldrich | U5378 | |
| Vacuum Concentrator 5301 | Eppendorf | Speed vac |
References
- Bulau, P., et al. Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography. Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).
- Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: the coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
- Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
- Yang, Y., Bedford, M. T. Protein arginine methyltransferases and cancer. Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).
- Bezzi, M., et al. Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery. Genes & Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).
- Auclair, Y., Richard, S. The role of arginine methylation in the DNA damage response. DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).
- Spadotto, V., et al. PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis. Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).
- Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry. Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).
- Ong, S. -. E., Mittler, G., Mann, M. Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC. Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).
- Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates. Molecular & Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).
- Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
- Larsen, S. C., et al. Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells. Science Signaling. 9 (443), (2016).
- Massignani, E., et al. hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data. Proteomics. 19 (5), 1800300 (2019).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
- Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry. Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).
- Nielsen, M. L., et al. Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry. Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).
- Huesgen, P. F., et al. LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification. Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896 (2007).
- Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
- Bremang, M., et al. Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome. Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).
- Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling. Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).
- Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides. Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).
- Guthals, A., Bandeira, N. Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).
- Swaney, D. L., et al. Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors. Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).
- Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins. Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).
- Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).
- Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis. Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).
- Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).
- Uhlmann, T., et al. A method for large-scale identification of protein arginine methylation. Molecular & Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).
- Wang, K., et al. Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation. Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).
- Moore, K. E., et al. A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation. Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).
- Wu, Z., et al. A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).
- Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest. Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).
- Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data. Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).
