Een op massaspectrometrie gebaseerde proteomics-benadering voor wereldwijde en betrouwbare eiwit-R-methylatieanalyse

Arginine (R)-methylatie is een posttranslationele modificatie (PTM) die ongeveer 1% van het zoogdierproteoom¹ versiert. Protein Arginine Methyltransferases (PRMTs) zijn de enzymen die de R-methylatiereactie katalyseren door de afzetting van een of twee methylgroepen naar de stikstof (N) atomen van de guanidinogroep van de zijketen van R op een symmetrische of asymmetrische manier. Bij zoogdieren kunnen PRMT’s worden gegroepeerd in drie klassen – type I, type II en type III – afhankelijk van hun vermogen om zowel monomethylatie (MMA) als asymmetrische dimethylatie (ADMA), MMA en symmetrische dimethylatie (SDMA) of alleen MMA te deponeren, respectievelijk ^2,3. PRMT’s richten zich voornamelijk op R-residuen in glycine- en argininerijke regio’s, bekend als GAR-motieven, maar sommige PRMT’s, zoals PRMT5 en CARM1, kunnen proline-glycine-methionine-rijke (PGM) motieven^{methylaaten 4}. R-methylatie is naar voren gekomen als een eiwitmodulator van verschillende biologische processen, zoals RNA-splicing⁵, DNA-reparatie⁶, miRNA-biogenese⁷ en translatie², waardoor het onderzoek naar deze PTM wordt bevorderd.

Massaspectrometrie (MS) wordt erkend als de meest effectieve technologie om systematisch wereldwijde R-methylatie te bestuderen met eiwit-, peptide- en site-resolutie. Deze PTM vereist echter enkele bijzondere voorzorgsmaatregelen voor de zeer betrouwbare identificatie door de lidstaten. Ten eerste is R-methylatie substoichiometrisch, waarbij de ongewijzigde vorm van de peptiden veel overvloediger is dan de gemodificeerde, zodat massaspectrometers die in de Data Dependent Acquisition (DDA) -modus werken, vaak onmodificeerde peptiden met hoge intensiteit zullen fragmenteren dan hun gemethyleerde tegenhangers met lagere intensiteit⁸. Bovendien lijden de meeste MS-gebaseerde workflows voor R-gemethyleerde site-identificatie aan beperkingen op het niveau van bio-informaticaanalyse. Inderdaad, de computationele identificatie van methylpeptiden is gevoelig voor hoge False Discovery Rates (FDR), omdat deze PTM isobaar is voor verschillende aminozuursubstituties (bijv. Glycine in alanine) en chemische modificatie, zoals methylverestering van aspartaat en glutamaat⁹. Vandaar dat methoden op basis van de isotoopetikettering van methylgroepen, zoals Heavy Methyl Stable Isotope Labeling with Amino Acids in Cell culture (hmSILAC), zijn geïmplementeerd als orthogonale strategieën voor zelfverzekerde MS-identificatie van in vivo methylaties, waardoor de snelheid van fout-positieve annotaties aanzienlijk wordt verminderd¹⁰.

Onlangs zijn verschillende proteoombrede protocollen voor het bestuderen van R-gemethyleerde eiwitten geoptimaliseerd. De ontwikkeling van op antilichamen gebaseerde strategieën voor de immunoaffiniteitsverrijking van R-methylpeptiden heeft geleid tot de annotatie van enkele honderden R-gemethyleerde sites in menselijke cellen^11,12. Bovendien meldden veel studies ^3,13 dat het koppelen van op antilichamen gebaseerde verrijking met peptidescheidingstechnieken zoals HpH-RP chromatografiefractionering het totale aantal geïdentificeerde methylpeptiden kan verhogen.

Dit artikel beschrijft een experimentele strategie ontworpen voor de systematische en zeer betrouwbare identificatie van R-gemethyleerde locaties in menselijke cellen, gebaseerd op verschillende biochemische en analytische stappen: eiwitextractie uit hmSILAC-gelabelde cellen, parallelle dubbele enzymatische spijsvertering met Trypsine en LysargiNase proteasen, gevolgd door HpH-RP chromatografische fractionering van verteerde peptiden, gekoppeld aan op antilichamen gebaseerde immuno-affiniteitsverrijking van MMA-, SDMA-, en ADMA-bevattende peptiden. Alle affiniteitsverrijkte peptiden worden vervolgens geanalyseerd door hoge-resolutie vloeistofchromatografie (LC) -MS / MS in DDA-modus, en ruwe MS-gegevens worden verwerkt door het MaxQuant-algoritme voor identificatie van R-methylpeptiden. Ten slotte worden de MaxQuant-uitvoerresultaten verwerkt met hmSEEKER, een in eigen huis ontwikkelde bioinformatica-tool om paren van zware en lichte methylpeptiden te zoeken. In het kort leest en filtert hmSEEKER methylpeptidenidentificaties uit het msms-bestand, vergelijkt vervolgens elk methylpeptide met de overeenkomstige MS1-piek in het allPeptides-bestand en zoekt ten slotte de piek van de zware / lichte peptide-tegenhanger. Voor elk vermeend zwaar-lichtpaar worden de parameters Log2 H/L-verhouding (LogRatio), Retentietijdverschil (dRT) en Massafout (ME) berekend en doubletten die zich binnen door de gebruiker gedefinieerde cut-offs bevinden, worden gelabeld als echte positieven. De workflow van het biochemische protocol is beschreven in figuur 1.