15 μs-ms Zaman Ölçeğinde Protein Konformasyonsal Dinamiklerinin Araştırılması için N CPMG Gevşeme Dağılımı
Summary
Burada 15 Ngevşeme dispersiyon profillerinin çözelti NMR spektroskopisi ile edinilmesi ve analizi için laboratuvarda uygulanan protokolün detaylı bir açıklaması sağlanmaktadır.
Abstract
Protein konformasyonsal dinamikleri, önemli biyolojik süreçler olan enzimatik kataliz, ligand bağlama, allosteri ve sinyalizasyonun düzenlenmesinde temel roller oynar. Yapı ve dinamikler arasındaki dengenin biyolojik işlevi nasıl yönettiğini anlamak, modern yapısal biyolojide yeni bir sınırdır ve çeşitli teknik ve metodolojik gelişmelerin fitilini ateşlemiştir. Bunlar arasında, CPMG gevşeme dispersiyon çözümü NMR yöntemleri, μs-ms zaman ölçeğinde meydana gelen protein konformasyonsal dengenin yapısı, kinetiği ve termodinamiği hakkında benzersiz, atomik çözünürlüklü bilgiler sağlar. Burada, çalışma 15 Ngevşeme dispersiyon deneyinin edinilmesi ve analizi için ayrıntılı protokoller sunmaktadır. Örnek olarak, bakteri Enzim I’in C-terminal etki alanındaki μs-ms dinamiklerinin analizi için boru hattı gösterilmiştir.
Introduction
Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) gevşeme dispersiyon (RD) deneyleri, μs-ms zaman ölçeğinde meydana gelen konformasyonel dengeyi NMR spektroskopisi1, 2,3,4,5çözeltisi ile karakterize etmek için rutin bir tabanda kullanılır. Konformasyonel dinamiklerin araştırılması için diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, CPMG tekniklerinin modern NMR spektrometrelerinde uygulanması nispeten kolaydır, özel numune hazırlama adımları (örneğin, kristalizasyon, numune dondurma veya hizalama ve/veya floresan veya paramanyetik etiketli kovalent konjugasyon) gerektirmez ve değişim süreçlerinde yapısal, kinetik ve termodinamik bilgileri döndüren konformasyonel dengenin kapsamlı bir şekilde nitelendirilmesini sağlar. Bir CPMG deneyinin konformasyonsal bir dengeyi rapor edebilmesi için iki koşul geçerli olmalıdır: (i) gözlemlenen NMR dönüşleri, konformasyonsal değişime uğrayan durumlarda farklı kimyasal kaymalara sahip olmalıdır (mikro durumlar) ve (ii) değişimin ~50 μs ile ~10 ms arasında değişen bir zaman ölçeğinde gerçekleşmesi gerekir. Bu koşullar altında, gözlemlenen enine gevşeme oranı ( 
) iç R 2 ‘nin(μs-ms dinamiklerinin yokluğunda ölçülen R2) 
ve enine gevşemeye değişim katkısının (Rex)toplamıdır. R2obs’a Rex katkısı, darbe dizisinin CPMG bloğunu oluşturan 180 ° darbeler arasındaki aralığı azaltarak kademeli olarak söndürülebilir, ve ortaya çıkan RD eğrileri, mikro devletler arasındaki kimyasal kayma farkını, her mikro devletteki kesirli popülasyonu ve mikro devletler arasındaki değişim oranlarını elde etmek için Bloch-McConnell teorisi kullanılarak modellenebilir (Şekil 1)1,2,3.
Literatürde 15 NCPMG deneyi için birkaç farklı nabız dizisi ve analiz protokolü bildirilmiştir. Burada laboratuvarda uygulanan protokol açıklanmıştır. Özellikle, NMR örneğinin hazırlanması, NMR deneylerinin kurulması ve alınması ve NMR verilerinin işlenmesi ve analizi için önemli adımlar tanıtılacaktır (Şekil 2). Protokolün diğer laboratuvarlara aktarılmasını kolaylaştırmak için, darbe programı, işleme ve analiz komut dosyaları ve bir örnek veri kümesi Ek Dosyalar olarak sağlanır ve (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html. Sağlanan darbe dizisi, ofset bağımlı yapıtların6’nın bastırılması için CPMG bloğunda dört adımlı bir faz döngüsü içerir ve birkaç aralanmış deneyin alınması için kodlanmıştır. Bu aralanmış deneyler aynı gevşeme süresine sahiptir, ancak farklı CPMG alanları elde etmek için farklı sayıda yeniden odaklama darbeleri7. Açıklanan darbe programının NMR sinyali8’inTROSY bileşeninin 15N R 2’yi ölçtüklerine dikkat etmek de önemlidir. Genel olarak, orta ve büyük boyutlu proteinler 4 ,5,9,10’dakonformasyonsal değişimin karakterizasyonu için protokolbaşarıylauygulanmıştır. Daha küçük sistemler (<20 kDa) için Heteronuclear Tek Kuantum Tutarlılığı (HSQC) tabanlı darbe dizisi11,12 kullanılması önerilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, proteinler üzerinde 15 NRD verinin eldei ve analizi için laboratuvarda uygulanan protokol açıklanmaktadır. Özellikle, NMR örneğinin hazırlanması, NMR verilerinin ölçümü ve RD profillerinin analizi için önemli adımlar ele alınmıştır. Aşağıda RD deneylerinin edinimi ve analizi ile ilgili bazı önemli hususlar tartışılmıştır. Bununla birlikte, deney ve veri analizinin daha derinlemesine tanımlanması için, orijinal literatürün dikkatli bir şekilde incelenmesi şidd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIGMS R35GM133488 ve Roy J. Carver Charitable Trust’tan V.V.’ye fonlarla desteklendi.
Materials
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
| Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
| High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | acquisition of the NMR data |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
| NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
| NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
| Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | acquisition software |
References
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).
- Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
- Venditti, V., Clore, G. M. Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).
- Venditti, V., et al. Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I. Nature Communications. 6, 5960 (2015).
- Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment. Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).
- Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme. Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins. Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).
- Dotas, R. R., et al. Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I. Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).
- Purslow, J. A., et al. Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics. Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).
- Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins. Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).
- Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy. Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).
- Niklasson, M., et al. Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting. Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).
- Palmer, A. G., Kroenke, C. D., Loria, J. P. Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules. Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).
- Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain. Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).
- Carver, J. P., Richards, R. E. A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation. Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).
- Egner, T. K., et al. Surface Contrast’ NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation. ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).
- Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel. Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).
- Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy. Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).
- Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).
- Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution. Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).
- Pritchard, R. B., Hansen, D. F. Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy. Nature Communications. 10, 1747 (2019).
