15 ans N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the μs-ms Timescale
Summary
Ici, une description détaillée du protocole mis en œuvre en laboratoire pour l’acquisition et l’analyse de profils de dispersion de relaxation de 15N par spectroscopie RMN en solution est fournie.
Abstract
La dynamique conformationnelle des protéines joue un rôle fondamental dans la régulation de la catalyse enzymatique, de la liaison au ligand, de l’allostery et de la signalisation, qui sont des processus biologiques importants. Comprendre comment l’équilibre entre la structure et la dynamique régit la fonction biologique est une nouvelle frontière dans la biologie structurale moderne et a déclenché plusieurs développements techniques et méthodologiques. Parmi ceux-ci, les méthodes RMN de la solution de dispersion de relaxation CPMG fournissent des informations uniques de résolution atomique sur la structure, la cinétique et la thermodynamique des équilibres conformationnels des protéines se produisant sur l’échelle de temps μs-ms. Ici, l’étude présente des protocoles détaillés pour l’acquisition et l’analyse d’une expérience de dispersion de relaxation de 15N. À titre d’exemple, le pipeline pour l’analyse de la dynamique μs-ms dans le domaine C-terminal des bactéries enzyme I est montré.
Introduction
Les expériences de dispersion de relaxation (RD) de Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) sont utilisées sur une base de routine pour caractériser les équilibres conformationnels se produisant sur l’échelle de temps μs-ms par spectroscopie RMN en solution1,2,3,4,5. Comparativement à d’autres méthodes d’étude de la dynamique conformationnelle, les techniques cpmg sont relativement faciles à mettre en œuvre sur les spectromètres RMN modernes, ne nécessitent pas d’étapes spécialisées de préparation d’échantillon (c.-à-d. cristallisation, congélation ou alignement d’échantillon, et/ou conjugaison covalente avec une étiquette fluorescente ou paramagnétique), et fournissent une caractérisation complète des équilibres conformationnels renvoyant des informations structurelles, cinétiques et thermodynamiques sur les processus d’échange. Pour qu’une expérience CPMG rende compte d’un équilibre conformationnel, deux conditions doivent s’appliquer : (i) les spins RMN observés doivent posséder différents décalages chimiques dans les états subissant un échange conformationnel (micro-états) et (ii) l’échange doit se produire à une échelle de temps allant de ~50 μs à ~10 ms. Dans ces conditions, le taux de relaxation transversale observé ( 
) est la somme duR2 intrinsèque (leR2 mesuré en l’absence de dynamique μs-ms, 
) et de la contribution d’échange à la relaxation transversale (Rex). La contribution Rex àR2obs peut être progressivement trempée en réduisant l’espacement entre les impulsions de 180° constituant le bloc CPMG de la séquence d’impulsions, et les courbes RD résultantes peuvent être modélisées en utilisant la théorie de Bloch-McConnell pour obtenir la différence de décalage chimique entre les micro-états, la population fractionnaire de chaque micro-état, et les taux d’échange entre les micro-états(Figure 1)1,2,3.
Plusieurs séquences d’impulsions et protocoles d’analyse différents ont été rapportés dans la littérature pour 15expériences cpmg de N. Ici, le protocole mis en œuvre en laboratoire est décrit. En particulier, les étapes cruciales pour la préparation de l’échantillon RMN, la mise en place et l’acquisition des expériences RMN, ainsi que le traitement et l’analyse des données RMN seront introduites (Figure 2). Pour faciliter le transfert du protocole à d’autres laboratoires, le programme d’impulsions, les scripts de traitement et d’analyse et un exemple d’ensemble de données sont fournis sous forme de fichiers supplémentaires et peuvent être téléchargés à l’adresse (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). La séquence d’impulsions fournie intègre un cycle de phase en quatre étapes dans le bloc CPMG pour la suppression des artefacts dépendants du décalage6 et elle est codée pour l’acquisition de plusieurs expériences entrelacées. Ces expériences entrelacées ont une période de relaxation identique mais des nombres différents d’impulsions recentrantes afin d’obtenir différents champs CPMG7. Il est également important de noter que le programme d’impulsions décrit mesure les 15N R2 de la composante TROSY du signal RMN8. Dans l’ensemble, le protocole a été appliqué avec succès pour la caractérisation des échanges conformationnels dans des protéines de taille moyenne et grande4,5,9,10. Pour les systèmes plus petits (<20 kDa), l’utilisation d’une séquence d’impulsions11, 12 basée sur la cohérence quantique unique hétéronucléaire (HSQC) est recommandée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce manuscrit décrit le protocole mis en œuvre en laboratoire pour l’acquisition et l’analyse de données 15N RD sur les protéines. En particulier, les étapes cruciales pour la préparation de l’échantillon RMN, la mesure des données RMN et l’analyse des profils RD sont couvertes. Ci-dessous, certains aspects importants concernant l’acquisition et l’analyse des expériences de RD sont discutés. Cependant, pour une description plus approfondie de l’expérience et de l’analyse des données,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des fonds du NIGMS R35GM133488 et du Roy J. Carver Charitable Trust à V.V.
Materials
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
| Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
| High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | acquisition of the NMR data |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
| NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
| NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
| Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | acquisition software |
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