15 N CPMG Ontspanningsdispersie voor het onderzoek van eiwitconformatiedynamiek op de μs-ms tijdschaal
Summary
Hier wordt een gedetailleerde beschrijving gegeven van het protocol dat in het laboratorium is geïmplementeerd voor de verwerving en analyse van 15N-ontspanningsdispersieprofielen door oplossing NMR-spectroscopie.
Abstract
Eiwitconforme dynamica speelt een fundamentele rol bij de regulatie van enzymatische katalyse, ligandbinding, allosterie en signalering, die belangrijke biologische processen zijn. Begrijpen hoe de balans tussen structuur en dynamiek de biologische functie regelt, is een nieuwe grens in de moderne structurele biologie en heeft verschillende technische en methodologische ontwikkelingen aangewakkerd. Onder deze, CPMG ontspanning dispersie oplossing NMR methoden bieden unieke, atomaire-resolutie informatie over de structuur, kinetiek, en thermodynamica van eiwit conformationele evenwicht optreden op de μs-ms tijdschaal. Hier presenteert de studie gedetailleerde protocollen voor het verkrijgen en analyseren van een 15N ontspanningsdispersie-experiment. Als voorbeeld wordt de pijplijn voor de analyse van de μs-ms dynamiek in het C-terminal domein van bacteriën Enzym I getoond.
Introduction
Carr-Purcell Meiboom-Gill (CPMG) ontspanningsdispersie (RD) experimenten worden routinematig gebruikt om conformatieevenwicht te karakteriseren dat optreedt op de μs-ms tijdschaal door oplossing NMR spectroscopie1,2,3,4,5. In vergelijking met andere methoden voor onderzoek van conformatiedynamiek zijn CPMG-technieken relatief eenvoudig te implementeren op moderne NMR-spectrometers, vereisen ze geen gespecialiseerde monstervoorbereidingsstappen (d.w.z. kristallisatie, monstervriezen of uitlijning, en/of covalente vervoeging met een fluorescerende of paramagnetische tag) en bieden ze een uitgebreide karakterisering van conformationeel evenwicht dat structurele, kinetische en thermodynamische informatie over uitwisselingsprocessen retourneert. Om een CPMG-experiment over een conformatieevenwicht te laten rapporteren, moeten twee voorwaarden van toepassing zijn: i) de waargenomen NMR-spins moeten verschillende chemische verschuivingen hebben in de staten die conformationele uitwisseling ondergaan (microstaten) en (ii) de uitwisseling moet plaatsvinden op een tijdschaal variërend van ~50 μs tot ~10 ms. Onder deze omstandigheden is de waargenomen transversale ontspanningssnelheid ( 
) de som van de intrinsieke R2 (de R2 gemeten bij afwezigheid van μs-ms 
dynamiek) en de uitwisselingsbijdrage aan de transversale ontspanning (Rex). De Rex bijdrage aan R2obs kan geleidelijk worden gedoofd door de afstand tussen de 180° pulsen die het CPMG-blok van de pulssequentie vormen, te verkleinen, en de resulterende RD-curven kunnen worden gemodelleerd met behulp van de Bloch-McConnell-theorie om het chemische verschuivingsverschil tussen microstaten, de fractionele populatie van elke microstaat en de wisselkoersen tussen microstaten te verkrijgen (Figuur 1)1,2,3.
Verschillende pulssequenties en analyseprotocollen zijn gerapporteerd in de literatuur voor 15N CPMG-experimenten. Hierin wordt het protocol beschreven dat in het laboratorium is geïmplementeerd. Met name zullen de cruciale stappen voor de voorbereiding van het NMR-monster, de opzet en verwerving van de NMR-experimenten en de verwerking en analyse van de NMR-gegevens worden ingevoerd (figuur 2). Om de overdracht van het protocol naar andere laboratoria te vergemakkelijken, worden het pulsprogramma, de verwerkings- en analysescripts en een voorbeeldgegevensset geleverd als aanvullende bestanden en kunnen ze worden gedownload op (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). De meegeleverde pulssequentie bevat een fasecyclus in vier stappen in het CPMG-blok voor onderdrukking van offset-afhankelijke artefacten6 en is gecodeerd voor het verkrijgen van verschillende interleaved experimenten. Deze interleaved experimenten hebben een identieke ontspanningsperiode maar verschillende aantallen heroriënterende pulsen om verschillende CPMG-velden te bereiken7. Het is ook belangrijk op te merken dat het beschreven pulsprogramma de 15N R2 van de TROSY-component van het NMR-signaalmeet 8. Over het geheel genomen is het protocol met succes toegepast voor de karakterisering van conformationele uitwisseling in middelgrote en grote eiwitten4,5,9,10. Voor kleinere systemen (<20 kDa) is het gebruik van een op Heteronucleaire Single Quantum Coherence (HSQC) gebaseerde pulssequentie11,12 aan te raden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit manuscript beschrijft het protocol dat in het laboratorium is geïmplementeerd voor de verwerving en analyse van 15N RD-gegevens over eiwitten. Met name de cruciale stappen voor de voorbereiding van het NMR-monster, de meting van de NMR-gegevens en de analyse van de RD-profielen komen aan bod. Hieronder worden enkele belangrijke aspecten met betrekking tot de verwerving en analyse van RD-experimenten besproken. Voor een meer diepgaande beschrijving van het experiment en de gegevensanalyse wordt echter een …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door fondsen van NIGMS R35GM133488 en van de Roy J. Carver Charitable Trust aan V.V.
Materials
| Cryoprobe | Bruker | 5mm TCI 800 H-C/N-D cryoprobe | Improve sensitivity |
| Deuterium Oxide | Sigma Aldrich | 756822-1 | >99.8% pure, utilised in preparing NMR samples and deuterated cultures |
| Hand driven centrifuge | United Scientific supply | CENTFG1 | Used to remove any air bubbles or residual liquid stuck on the walls of NMR tube. |
| High Field NMR spectrometer | Bruker | Bruker Avance II 600, Bruker Avance 800 | acquisition of the NMR data |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html | Modeling of the NMR data |
| NMR pasteur Pipette | Corning Incorporation | 7095D-NMR | Pyrex glass pastuer pipette to transfer liquid sample in NMR tube |
| NMR tube | Willmad Precision | 535-PP-7 | 5mm thin wall 7'' cylinderical glass tube |
| NMRPipe | Institute of Biosciences and Biotechnology research | https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html | NMR data processing |
| SPARKY | University of California, San Francisco | https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/ | Analysis of the NMR data |
| Tospin 3.2 (or newer) | Bruker | https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html | acquisition software |
References
- Anthis, N. J., Clore, G. M. Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy. Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).
- Lisi, G. P., Loria, J. P. Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery. Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).
- Mittermaier, A., Kay, L. E. New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics. Science. 312 (5771), 224-228 (2006).
- Venditti, V., Clore, G. M. Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).
- Venditti, V., et al. Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I. Nature Communications. 6, 5960 (2015).
- Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment. Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).
- Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme. Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins. Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).
- Dotas, R. R., et al. Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I. Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).
- Purslow, J. A., et al. Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics. Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).
- Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy. Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).
- Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins. Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).
- Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy. Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).
- Niklasson, M., et al. Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting. Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).
- Palmer, A. G., Kroenke, C. D., Loria, J. P. Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules. Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).
- Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain. Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).
- Carver, J. P., Richards, R. E. A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation. Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).
- Egner, T. K., et al. Surface Contrast’ NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation. ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).
- Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel. Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).
- Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy. Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).
- Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme. Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).
- Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution. Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).
- Pritchard, R. B., Hansen, D. F. Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy. Nature Communications. 10, 1747 (2019).
