Анализ HBV-специфических CD4 Т-клеточных реакций и идентификация HLA-DR-ограниченных CD4 Т-клеточных эпитопов на основе пептидной матрицы
Summary
Основываясь на пептидной матрице, полученной из вируса гепатита В (HBV), HBV-специфические CD4 Т-клеточные ответы могут быть оценены параллельно с идентификацией HBV-специфических CD4 Т-клеточных эпитопов.
Abstract
CD4 Т-клетки играют важную роль в патогенезе хронического гепатита В. Как универсальная клеточная популяция, CD4 Т-клетки были классифицированы как отдельные функциональные подмножества на основе цитокинов, которые они секретировали: например, IFN-γ для CD4 T-хелперных клеток 1, IL-4 и IL-13 для CD4 T-хелперных клеток 2, IL-21 для CD4 T фолликулярных хелперных клеток и IL-17 для CD4 T хелперов 17 клеток. Анализ специфических CD4 Т-клеток вируса гепатита В (HBV) на основе секреции цитокинов после стимуляции пептидов, полученных из HBV, может предоставить информацию не только о величине HBV-специфического ответа CD4 T-клеток, но и о функциональных подмножествах HBV-специфических CD4 Т-клеток. Новые подходы, такие как транскриптомика и метаболомический анализ, могут предоставить более подробную функциональную информацию о HBV-специфических CD4 Т-клетках. Эти подходы обычно требуют выделения жизнеспособных HBV-специфических CD4 Т-клеток на основе пептидно-основных мультимеров гистосовместимости комплекса II, в то время как в настоящее время информация об HBV-специфических CD4 Т-клеточных эпитопах ограничена. На основе пептидной матрицы, полученной из HBV, был разработан метод для оценки HBV-специфических CD4 Т-клеточных реакций и идентификации HBV-специфических CD4 Т-клеточных эпитопов одновременно с использованием образцов мононуклеарных клеток периферической крови у пациентов с хронической инфекцией HBV.
Introduction
В настоящее время существует 3 основных подхода к анализу антиген-специфических Т-клеток. Первый подход основан на взаимодействии между Т-клеточным рецептором и пептидом (эпитопом). Антиген-специфические Т-клетки могут быть непосредственно окрашены мультимерами пептидно-большого комплекса гистосовместимости (MHC). Преимущество этого метода заключается в том, что он может получить жизнеспособные антиген-специфические Т-клетки, подходящие для последующего анализа транскриптомики / метаболомики. Ограничение этого метода заключается в том, что он не может предоставить информацию о реакции всей Т-клетки на специфический антиген, поскольку он требует проверенных эпитопных пептидов, в то время как количество идентифицированных эпитопов для конкретного антигена на данный момент ограничено. По сравнению с cd8-клеточными эпитопами CD8,специфичными для вируса гепатита В (HBV), было идентифицировано меньше HBV-специфических CD4 Т-клеточных эпитопов1,2,что сделало этот метод менее применимым для анализа HBV-специфических CD4 Т-клеток в настоящее время.
Второй подход основан на апрегуляции серии индуцированных активацией маркеров после стимуляции антигеннымпептидом 3. Обычно используемые маркеры включают CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4. Этот метод в настоящее время используется для анализа антиген-специфических Т-клеточных ответов у вакцинированных лиц5,6,пациентов с вирусной инфекцией иммунодефицита человека7и тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 с инфекцией8,9. В отличие от мультимерного анализа на основе пептида-MHC, этот метод не ограничен валидируемыми эпитопами и может получить жизнеспособные клетки для последующего анализа. Ограничением этого метода является то, что он не может предоставить информацию о цитокиновом профиле антиген-специфических Т-клеток. Кроме того, экспрессия этих маркеров, индуцированных активацией, некоторыми активированными антиген-неспецифическими клетками может способствовать фоновым сигналам в анализе, что может быть проблемой, особенно когда целевые антиген-специфические Т-клетки редки. В настоящее время применение этого метода на HBV-специфических CD4 Т-клетках4ограничено. Может ли этот метод быть использован для надежного анализа HBV-специфических CD4 Т-клеток, требует дальнейшего изучения.
Третий подход основан на секреции цитокинов после стимуляции антигенным пептидом. Как и анализ на основе маркеров, индуцированный активацией, этот метод не ограничен валидированными эпитопами. Этот метод может непосредственно выявить цитокиновый профиль антиген-специфических Т-клеток. Чувствительность этого метода ниже, чем метода, индуцированного активацией маркера, поскольку он опирается на секрецию цитокинов антиген-специфических Т-клеток, а количество тестируемых цитокинов обычно ограничено. В настоящее время этот метод широко используется при анализе HBV-специфических Т-клеток. Поскольку цитокины, секретируемые HBV-специфическими Т-клетками, вряд ли могут быть обнаружены путем прямой пептидной стимуляции ex vivo10,11,цитокиновый профиль HBV-специфических Т-клеток обычно анализируется после 10-дневного ин-витида in vitro, стимулированного расширением12,13,14,15,16. Расположение пептидных пулов в матричной форме было использовано для облегчения идентификации антиген-специфических эпитопов17,18. С комбинацией пептидной матрицы и анализа цитокиновой секреции был разработан метод оценки HBV-специфических CD4 Т-клеточных реакций и идентификации HBV-специфических CD4 Т-клеточных эпитопов одновременно16. В этом протоколе подробно описаны данные метода. Основной антиген HBV выбран в качестве примера демонстрации в этом протоколе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важные шаги в этом протоколе перечислены следующим образом: 1) достаточное количество НБК высокой жизнеспособности для начала расширения НБК; 2) подходящая среда для расширения НБМК; и 3) полное удаление остаточных пептидных пулов в культуре PBMCs до идентификации эпитопа.
<p class=…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (81930061), Фондом естественных наук Чунцина (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) и Китайским ключом.
Специализированный проект по инфекционным заболеваниям (2018ZX10723203).
Materials
| Albumin Bovine V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC-conjugated Anti-human TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Keep protected from light |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Limit cell clumping |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803 homozygote |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202 homozygote |
| Cell Culture Flask (T75) | Corning | 430641 | |
| Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) | Corning | 3599 | Flat bottom |
| Cell Culture Plate (96-well, round bottom) | Corning | 3799 | Round bottom |
| Cell Strainer | Corning | CLS431751 | Pore size 70 μm, white, sterile |
| Centrifuge Tube (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Sterile |
| Centrifuge Tube (50 mL) | Corning | 430829 | Sterile |
| Centrifuge, Refrigerated | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | ST16R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Prepare solution before use |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Keep at room temperature to prevent crystallization |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Filter Tips (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | Sterile |
| Filter Tips (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Sterile |
| Filter Tips (1-200) | Kirgen | KG5233 | Sterile |
| FITC-conjugated Anti-human CD4 | BioLegend | 300506 | Keep protected from light |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Keep protected from light |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | Protein Transport Inhibitor |
| Haemocytometer | Brand | 718620 | |
| HBV Core Antigen Derived Peptides | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Human Serum AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Flow Cytometer | BD | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Corning | MCT-150-C | Autoclaved sterilization before using |
| Microplate Shakers | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR Tubes (0.2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | Keep protected from light |
| PE-conjugated Anti-human IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Keep protected from light |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Keep protected from light |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Recombinant Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| Sodium pyruvate,100mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 |
References
- Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
- Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, 5863-5871 (2004).
- Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
- Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998 (2017).
- Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
- Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
- Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
- Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
- Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
- Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
- Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
- Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
- de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
- Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
- Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
- Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
- Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).
